姚沛琳，蔣家璇，武進(jìn)雨，孔振楊，季小康，徐禮生

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，宿州234000

食用植物酵素，是由一種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇等為原料，經(jīng)多種有益菌種長時間發(fā)酵而成，含有豐富的酶、有機(jī)物、益生菌、次生代謝產(chǎn)物等多種具有極高營養(yǎng)價值的功能性成分。不僅賦予酵素特有的風(fēng)味和口感，而且可以給人體提供美白養(yǎng)顏、延緩衰老、提高免疫力等多種保健功能[1,2]。水果酵素因其較好的生物活性逐漸成為研究熱點(diǎn)，例如發(fā)酵后桑葚酵素的SOD酶活(24 122.2 U/mL)可比桑葚果汁(10 818.7 U/mL)提高123%[3]；Zhao等[4]通過研究成熟度對諾力果酵素品質(zhì)的影響證明諾麗果酵素具有潛在的美白和預(yù)防肥胖功效；Siroli等[5]證明將植物乳桿菌菌株CIT3和V7B3分別接種于蘋果和生菜，可提高產(chǎn)品的安全性和保質(zhì)期。

無花果屬于桑科果屬，有“生命之果”之稱，含18種以上的氨基酸，其中8種是人體必需氨基酸，還含有人體必需的維生素、糖類等營養(yǎng)成分，具有降低血壓、潤腸通便等功效[6]。無花果營養(yǎng)豐富，但是表皮極易被微生物污染，采摘后運(yùn)輸貯藏難度極大，因此就地發(fā)酵是較好的處理方法。目前無花果在功能性食品領(lǐng)域深入研究較少，主要用于鮮食或加工成果干、果漿、果脯等，存在產(chǎn)品開發(fā)價值和附加值相對較低等問題[7]。從營養(yǎng)和保健功效考慮，無花果是開發(fā)食用酵素的優(yōu)良植物資源[8]。近年來，酵素制品已成為國際市場的主流，但國內(nèi)的酵素還處于研究起步階段，缺少自主知識產(chǎn)權(quán)，無花果酵素更是鮮有報道，將無花果加工成具有高營養(yǎng)價值的無花果酵素，則有利于無花果產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級和高值化利用。

本文以無花果為研究對象，以自然發(fā)酵法制備無花果酵素，探究發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)(pH、總酸、有機(jī)酸)、活性物質(zhì)(總黃酮、總酚)、抗氧化活性(DPPP自由基、羥基自由基、超氧自由基清除能力和還原力)的變化規(guī)律，以期得到最佳發(fā)酵時間，用標(biāo)準(zhǔn)化手段規(guī)范傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，為無花果酵素的自然發(fā)酵提供科學(xué)研究支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮無花果(產(chǎn)自浙江金華蘭溪地區(qū))；單晶冰糖(安徽福香源生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司)。

蒽酮、福林酚、氫氧化鈉、三氯乙酸、三氯化鐵、過氧化氫、水楊酸鈉、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、鄰苯三酚，甲醇、甲酸等試劑(國藥集團(tuán))；26種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan Go酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；1-1SPK小型臺式冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司)；BBC-SDC-A超凈工作臺(博科生物公司)；AB三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)；Waters ACQUITY UPLC(Waters公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 無花果酵素的制備

用超純水在無菌條件下輕揉沖洗無花果，洗去無花果表面沙子和灰塵，在無菌操作臺中自然晾干。冰糖用紫外滅菌后，按質(zhì)量比1∶1與無花果一起加入已滅菌的酵素罐中，一層無花果原料一層冰糖，將無花果壓實(shí)，排盡空氣，裝至酵素罐2/3處，采用不控溫的方式，放置暗處自然發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，適當(dāng)進(jìn)行攪拌，并觀察發(fā)酵情況，每日17∶00進(jìn)行5 min的放氣，在發(fā)酵的第10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150天取樣，將樣品于10 000 rpm下離心10 min，取上清液待測，可于-80 ℃下保存[9]。

1.3.2 pH、總酸含量的測定

利用pH計(jì)校準(zhǔn)后測定無花果酵素不同時間段的pH值?？偹岬臋z測方法參照國標(biāo)GB 12456-2021。

1.3.3 總酚含量測定

采用福林酚法進(jìn)行測定[10]，取7只25 mL的比色管，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，加蒸餾水至10 mL，每管加入5 mL 10% Folin試劑，振蕩混勻，靜置5 min，再加入4 mL 7.5% NaCO3溶液，混勻，在室溫下靜置60 min，采用酶標(biāo)儀在波長為765 nm下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.010 8x+0.098 7，R2=0.998 1。取1 mL酵素液，后續(xù)步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線，總酚含量以沒食子酸計(jì)，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚含量。

1.3.4 總黃酮含量測定

采用亞硝酸鈉法進(jìn)行測定[11]。取1 mL樣液用80%乙醇溶液定容至10 mL，加入0.7 mL 5%的NaNO2溶液，反應(yīng)6 min，再加入0.7 mL 10%的AlCl3溶液，搖勻，反應(yīng)6 min，再加入5 mL 10%的NaOH溶液，用80%乙醇定容至25 mL，靜置反應(yīng)15 min，于510 nm波長下測定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算總黃酮含量。

1.3.5 有機(jī)酸含量的測定

取適量樣品于2 mL EP管中，準(zhǔn)確加入500 μL 30%甲醇水溶液(含0.1%甲酸)，混勻，8 000 rpm離心，取上清液，0.22 μm膜過濾，上機(jī)分析。色譜條件：色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，進(jìn)樣量5 μL，柱溫40 ℃，流動相A-水(含0.1%甲酸)，B-甲醇水(含0.1%甲酸)，梯度洗脫，流速：0.4 mL/min。質(zhì)譜條件：電噴霧電離(ESI)源，負(fù)離子電離模式。離子源溫度500 ℃,離子源電壓-4 500 V，碰撞氣6 psi，氣簾氣30 psi，霧化氣和輔助氣均為50 psi。采用多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)進(jìn)行掃描[12]。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的測定

參考Yu等[13]的方法，取1 mL樣品，加入3 mL的DPPH乙醇溶液(20 mmol/L)，振蕩搖勻。室溫下避光30 min后，在517 nm下測定其吸光度，使用公式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率=[(A1-A2)/A1]×100%

(1)

式中：A1為對照組吸光度；A2為樣品組吸光度。

1.3.7 羥基自由基清除能力的測定

采用水楊酸鈉法進(jìn)行測定[14]，取1 mL樣品，依次加入1.4 mL的H2O2溶液(6 mmol/L)、0.6 mL的水楊酸鈉溶液(20 mmol/L)和2 mL的FeSO4溶液(1.5 mmol/L)，振蕩搖勻，放在37 ℃的恒溫水浴鍋中加熱1 h，于562 nm下測定吸光度，使用公式(2)計(jì)算羥基自由基清除率。

羥基自由基清除率=[1-(A2-A3)/A1]×100%

(2)

式中：A1為空白組吸光度；A2為樣品組吸光度；A3為本底組吸光度

1.3.8 超氧自由基清除能力

采用鄰苯三酚法進(jìn)行測定[15]，取1 mL樣品，分別加入4.5 mL Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)和4.2 mL去離子水，充分混勻，在25 ℃的恒溫水浴鍋中水浴20 min后，加入0.3 mL的鄰苯三酚(7 mmol/L)，混勻后在25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，最后加入0.3 mL的HCl(10 mmol/L)終止反應(yīng)，在325 nm下，每隔5 min測定吸光值，連續(xù)測定30 min，繪制線性方程，方程斜率記為V1。以蒸餾水代替樣品，同樣條件下繪制線性方程，方程斜率記為V0，使用公式(3)計(jì)算超氧自由基清除率。

超氧自由基清除率=[(V0-V1)/V0]×100%

(3)

式中：V1為鄰苯三酚自動氧化后加入樣品檢測吸收值；V0鄰苯三酚自動氧化后檢測吸收值。

1.3.9 還原力的測定

采用鐵氰化鉀法進(jìn)行測定[16]，取1 mL樣品，加入2.5 mL(0.2 mol/L,pH=6.6)的PBS和2.5 mL的1%鐵氰化鉀溶液，50 ℃反應(yīng)20 min，加入2.5 mL的10%三氯乙酸溶液，3 000 rpm離心10 min，取2.5 mL的上清液，加入2.5 mL的蒸餾水和0.5 mL的0.1%三氯化鐵溶液，靜置10 min，在700 nm處測定吸光值。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理及分析

利用SPSS Statistics 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8.5對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 無花果發(fā)酵過程中總酸與pH的變化結(jié)果

無花果酵素在發(fā)酵過程中總酸含量和pH值的變化如圖1所示。pH在整個發(fā)酵周期，均呈現(xiàn)下降趨勢，但是在發(fā)酵前30天，下降速度較快，從3.99下降至3.85，可能與乳酸菌等微生物大量繁殖，產(chǎn)生大量酸性次生代謝產(chǎn)物有關(guān)?？偹岷吭谡麄€發(fā)酵周期，呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，在發(fā)酵前90天，與pH呈現(xiàn)相反的變化趨勢，說明在這一段時期，發(fā)酵體系的微生物處在正常的生長狀態(tài)。但是90天以后，總酸含量持續(xù)下降，可能是由于pH值的降低阻礙了一些微生物的生長繁殖，也可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵后期，發(fā)酵體系的碳源不足，有機(jī)酸開始作為碳源被某些微生物利用[17]。

圖1 無花果酵素不同發(fā)酵時間總酸含量和pH值的變化Fig.1 Variation of total acid content and pH value of fig enzyme at different fermentation time

2.2 無花果發(fā)酵過程中總酚含量的變化結(jié)果

無花果酵素在發(fā)酵過程中總酚含量的變化如圖2所示，在整個發(fā)酵過程中，總酚含量呈先明顯增加后趨于穩(wěn)定，最后顯著下降的變化趨勢。發(fā)酵至第80天時，總酚積累量達(dá)到最大值，為0.228 mg/mL。在發(fā)酵前50天呈現(xiàn)增長趨勢，其中前20天增長較快，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是由于在這一時期，無花果里的酚類物質(zhì)在高滲透壓作用下析出，或者無花果酵素中微生物的生產(chǎn)代謝較為迅速，消耗原料中的其他成分生成酚類物質(zhì)。在發(fā)酵的第100～110天，總酚含量出現(xiàn)急速下降的現(xiàn)象，可能是因?yàn)榉宇惢衔锱c發(fā)酵液中蛋白質(zhì)類物質(zhì)結(jié)合形成沉淀，導(dǎo)致離心后酵素液中總酚含量減少或者是因?yàn)榕c發(fā)酵液中的有機(jī)酸發(fā)生反應(yīng)，生成其他物質(zhì)[18]。研究也表明，當(dāng)發(fā)酵液中酚類物質(zhì)達(dá)到一定濃度后會抑制微生物的生長代謝，這些微生物為了維持自身的生長會降解酚類物質(zhì)，導(dǎo)致其含量減少[17]?？偡雍颗c抗氧化有著密切的關(guān)系[19]，因此長時間發(fā)酵不利于抗氧化功能的發(fā)揮。

圖2 無花果酵素不同發(fā)酵時間總酚的變化Fig.2 Variation of total phenols of fig enzymes at different fermentation time

2.3 無花果發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化結(jié)果

無花果酵素在發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化如圖3可知，表現(xiàn)為上升的變化趨勢，在發(fā)酵第130天時，總黃酮積累量達(dá)到最大值，為4.26 mg/mL。但是在發(fā)酵的第130～140天，總黃酮的含量出現(xiàn)了驟降的現(xiàn)象。在發(fā)酵后期，糖類基本已耗盡，酚類物質(zhì)被分解利用，可以轉(zhuǎn)化為具有附加生物價值的黃酮類物質(zhì)，因此導(dǎo)致在發(fā)酵的第120～130天，總黃酮的含量出現(xiàn)了驟升的現(xiàn)象，這與酚類物質(zhì)在發(fā)酵的第100～110天出現(xiàn)的驟降現(xiàn)象相吻合。通過文獻(xiàn)查閱，桑葚酵素在發(fā)酵后期花青素含量出現(xiàn)明顯下降的現(xiàn)象，發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化[20]，推測無花果酵素中總黃酮含量的驟降可能也是由于黃酮中的某類物質(zhì)發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化或者生物降解，需進(jìn)一步分析研究。

圖3 無花果酵素不同發(fā)酵時間總黃酮含量的變化Fig.3 Changes in total flavonoid content of fig enzymes at different fermentation time

2.4 有機(jī)酸含量的變化

測定不同發(fā)酵時間，無花果酵素自然發(fā)酵液中26種有機(jī)酸含量，結(jié)果如表1所示，在26種有機(jī)酸中，共檢測出13種，其中含量比較大的是乳酸、琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、葡萄糖醛酸、泛酸，其次是富馬酸、3-羥基-3-甲基谷氨酸和丙二酸。無花果酵素中總有機(jī)酸含量隨發(fā)酵的進(jìn)行持續(xù)上升(P<0.05)，至發(fā)酵的第80天，達(dá)到最大值(2.639 mg/mL)，相較于發(fā)酵第10天時的1.449 mg/mL，增長了82.13%，80天后稍有下降但趨于穩(wěn)定。蘋果酸和檸檬酸含量在發(fā)酵過程中的變化趨勢類似，均隨著發(fā)酵時間的增加而增大，至60～80天達(dá)到最高后趨于穩(wěn)定或稍有下降。乳酸和琥珀酸含量呈現(xiàn)不規(guī)則變化，但是總體表現(xiàn)出先增大后穩(wěn)定的趨勢。富馬酸、酒石酸和順丁烯二酸的含量在無花果酵素中的含量極少，而且基本保持不變。葡萄糖醛酸、泛酸、L-焦谷氨酸，DL-3-苯基乳酸、3-羥基-3-甲基谷氨酸和丙二酸一直呈現(xiàn)增大的趨勢。發(fā)酵各個階段含量較大的不同有機(jī)酸含量平均值排序?yàn)椋浩咸烟侨┧?蘋果酸>泛酸>檸檬酸>琥珀酸>乳酸。

無花果酵素中有機(jī)酸含量的積累除了本身原料中有機(jī)酸的溶出外，主要由于發(fā)酵過程中微生物代謝所生成，而發(fā)酵后期有機(jī)酸總量有所下降的原因可能是由于糖類已消耗殆盡，微生物利用有機(jī)酸作為碳源生長[21]。蘋果酸在發(fā)酵后期下降，可能是由于參與蘋-乳代謝路徑，乳酸菌將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸[22]。檸檬酸參與三羧酸代謝循環(huán)，因此在發(fā)酵過程中不容易積累[23]。琥珀酸是碳代謝的中心物質(zhì)，是糖降解途徑主要中間產(chǎn)物，由糖降解代謝積累[24]。本研究利用UPLC-MS/MS對26種有機(jī)酸物質(zhì)進(jìn)行靶向測定，發(fā)現(xiàn)葡萄糖醛酸和泛酸的含量較大，葡萄糖醛酸是由葡萄糖被氧化失去羥基所得，并在人體肝臟中與有毒物質(zhì)結(jié)合，可以發(fā)揮解毒功效[25]。泛酸作為代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)，起到人體免疫屏障的作用[26]，可見發(fā)酵過程可以提高一些功能性有機(jī)酸的含量，有助于無花果酵素功能性作用的發(fā)揮。

2.5 無花果酵素的體外抗氧化活性研究

2.5.1 無花果酵素對DPPH自由基清除能力

無花果酵素在不同發(fā)酵時間對DPPH自由基清除能力如圖4所示，隨著發(fā)酵時間的延長，總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在發(fā)酵前60天，對DPPH自由基清除能力增加幅度較大，在第60天時，其清除率達(dá)到了最大值71.8%。在發(fā)酵的70～150天，呈現(xiàn)下降的趨勢，與前期研究的酚類物質(zhì)在發(fā)酵過程中的變化趨勢基本一致，表明酚類物質(zhì)在DPPH自由基清除能力中起著重要作用，這與文獻(xiàn)資料中的報道相吻合[17]。在發(fā)酵的70～90天，對DPPH自由基清除能力下降幅度較大，結(jié)合前面對總黃酮的測定結(jié)果，推測可能與黃酮類物質(zhì)的下降有關(guān)。DPPH自由基清除能力的降低除了與微生物在生產(chǎn)代謝過程中分解或消耗具有清除能力的物質(zhì)有關(guān)，也可能是由于乳酸菌、酵母菌等微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了促進(jìn)DPPH自由基增加的代謝產(chǎn)物[27]。由此可見，發(fā)酵時間的延長，對DPPH自由基清除能力是不利的。

表1 無花果酵素自然發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量變化結(jié)果Table 1 Results of organic acid content change during natural fermentation of fig enzyme (mg/mL)

圖4 無花果酵素不同發(fā)酵時間DPPH自由基清除能力的變化Fig.4 Changes of DPPH free radical scavenging ability of fig enzymes at different fermentation time

2.5.2 無花果酵素對羥基自由基清除能力

無花果酵素在不同發(fā)酵時間對DPPH自由基清除能力如圖5所示，在發(fā)酵的前20天，羥基自由基的清除能力基本保持不變，可能是由于發(fā)酵液中的環(huán)境不足以支持微生物的大量繁殖，發(fā)酵液中的成分變化不顯著。在發(fā)酵30～50天時，羥基自由基清除率增加幅度較大，從30.0%增加到75.4%，上漲了60.21%。在發(fā)酵50天后，羥基自由基清除率基本呈現(xiàn)波動式下降的趨勢。Ng等[28]的研究表明，黃酮類化合物對羥基自由基有較好的清除能力，其清除能力的強(qiáng)弱取決于芳香環(huán)上羥基的數(shù)目和位置。因此在發(fā)酵的110～140天，無花果酵素對羥基自由基清除能力變化幅度較大，可能與總黃酮含量在這一時期變化幅度較大有關(guān)。

圖5 無花果酵素不同發(fā)酵時間羥基自由基清除能力的變化Fig.5 Changes of hydroxyl radical scavenging ability of fig enzymes at different fermentation time

2.5.3 無花果酵素對超氧自由基清除能力

無花果酵素在發(fā)酵過程中對超氧自由基清除能力的變化如圖6所示。在發(fā)酵前80天，超氧自由基清除率處于快速增加階段，從22.3%增長到54.72%，在發(fā)酵80天達(dá)到最大值。但是在發(fā)酵80～90天，超氧自由基清除率快速下降，然后逐漸趨于穩(wěn)定。研究表明，苯環(huán)上羥基數(shù)量較多的黃酮類化合物和SOD對清除超氧自由基有著促進(jìn)作用[29]，發(fā)酵后期出現(xiàn)快速降低的原因，可能與這兩類物質(zhì)的減少有關(guān)，還需通過深度分析進(jìn)行驗(yàn)證。這一研究結(jié)果也說明延長發(fā)酵時間不利于超氧自由基清除能力的提高。

圖6 無花果酵素不同發(fā)酵時間超氧自由基清除能力的變化Fig.6 Changes in superoxide radical capacity of fig enzymes at different fermentation time

2.5.4 無花果酵素的還原能力

由圖7可知，無花果酵素的還原力在發(fā)酵前40天變化不大，在發(fā)酵40～50天，急劇增大，吸光度從0.07增大到0.261，在發(fā)酵60天時，達(dá)到最大值0.279，在發(fā)酵60～70天急劇降低，然后趨于穩(wěn)定，結(jié)果顯示，無花果酵素的還原力水平不高，延長發(fā)酵時間對還原力不利，并且在整個發(fā)酵過程中，還原力與其余3個抗氧化指標(biāo)存在一定的差別，可能是因?yàn)檫€原力是評價抗氧化活性的綜合指標(biāo)，與多種因素有關(guān)，導(dǎo)致其變化的機(jī)理更加復(fù)雜。

圖7 無花果酵素不同發(fā)酵時間還原力的變化Fig.7 Variation of reducing power of fig enzyme at different fermentation time

2.6 無花果酵素中代謝產(chǎn)物與抗氧化活性的相關(guān)性分析

無花果酵素在發(fā)酵過程中，由于代謝產(chǎn)物種類復(fù)雜，而且在不同發(fā)酵時間，各代謝產(chǎn)物和抗氧化指標(biāo)對無花果酵素的品質(zhì)影響是不同的，因此采用主成分分析法(PCA)對不同發(fā)酵階段的無花果酵素進(jìn)行綜合評價。首先對無花果酵素在發(fā)酵過程中的總酸、總酚、總黃酮、有機(jī)酸、有機(jī)酸總量與抗氧化指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示?？偹崤c羥基自由基清除能力之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，富馬酸和蘋果酸與DPPH自由基清除能力之間存在極顯著正相關(guān)(P<0.01)，檸檬酸與DPPH自由基清除能力之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。泛酸與羥基和超氧自由基清除能力之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，總酚與超氧自由基清除能力之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，由此說明無花果酵素中的酚類和有機(jī)酸等物質(zhì)均具有一定的抗氧化能力。泛酸與有機(jī)酸總量之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，說明泛酸含量對有機(jī)酸總量影響較大。

2.7 主成分分析

2.7.1 主成分分析的特征值

通過主成分分析對無花果酵素中各變量之間的相互關(guān)系進(jìn)行降維處理。無花果酵素主成分特征值、貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率如表3所示。以特征值為依據(jù)，提取的第一主成分的貢獻(xiàn)率為47.16%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為24.96%，兩者總貢獻(xiàn)率為72.12%，即二者能夠反映原始變量72.12%的信息，可以用于描述大部分的變量信息。因此，對原先的14個變量進(jìn)行降維處理后獲得兩個新變量。

表2 發(fā)酵過程中各參數(shù)相關(guān)性Table 2 Correlation of parameters in the fermentation process

表3 主成分的特征值、貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率Table 3 The eigenvalue,contribution rate and the cumulative contribution rate of principal components

2.7.2 主成分法構(gòu)建無花果酵素的綜合評價指標(biāo)

發(fā)酵過程中無花果酵素主成分樣品得分圖如圖8所示，發(fā)酵10天和20天在第1、2主成分上位置均較近。發(fā)酵20天與發(fā)酵40天在第1主成分上位置距離較遠(yuǎn)，發(fā)酵20天與發(fā)酵60天在第1、2主成分上位置均較遠(yuǎn)，發(fā)酵40天與發(fā)酵60天在第2主成分上位置距離較遠(yuǎn)，說明發(fā)酵10天和20天的無花果酵素樣品的性質(zhì)相近；發(fā)酵20、40、60天的無花果酵素樣品的性質(zhì)差異較大；發(fā)酵60天和80天的第1、2主成分均距離較近，說明這兩個發(fā)酵階段的無花果酵素樣品差異不大；發(fā)酵80天與第100天、130天和150天，剛開始在第1主成分上的位置距離較遠(yuǎn)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，在第2主成分上的位置距離開始變遠(yuǎn)，說明無花果酵素樣品的性質(zhì)差異開始變大。

通過主成分分析法構(gòu)建不同發(fā)酵時間樣品的綜合評價指標(biāo)(comprehensive evaluation index，CEI)，即以每個主成分所對應(yīng)的特征值占所提取主成分的特征值之和的比例，再進(jìn)行線性加權(quán)求和。

圖8 主成分樣品得分圖Fig.8 Principal component sample score graph

綜合評價指標(biāo)(CEI)=Y1×G1+Y2×G2

(4)

其中Y1代表樣品在主成分1中的得分，Y2代表樣品在主成分2中的得分；G1指主成分1的貢獻(xiàn)率，G2指主成分2的貢獻(xiàn)率。

不同發(fā)酵時間無花果酵素的綜合評價指標(biāo)如圖9所示，發(fā)酵的10～20天，CEI值變化緩慢，發(fā)酵的20～60天，CEI值呈線性快速上升，在第60天時達(dá)到最大值1.17；在發(fā)酵的60～80天，CEI值變化不明顯，與前面主成分樣品得分的結(jié)果相吻合，發(fā)酵60天與發(fā)酵80天的無花果酵素性質(zhì)差異不大。發(fā)酵80天后，綜合評價指標(biāo)值持續(xù)降低，說明無花果酵素自然發(fā)酵的時間適合在發(fā)酵60～80天這一時間段結(jié)束，或者在這一時間段可以補(bǔ)充碳源等營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵。

圖9 無花果酵素綜合評價指標(biāo)Fig.9 Comprehensive evaluation index of fig enzyme

3 結(jié)論

目前關(guān)于無花果酵素的研究鮮有報道，本文的研究結(jié)果表明，發(fā)酵過程中pH值持續(xù)降低，總黃酮呈波動式上升趨勢，總酸、總酚、DPPH自由基、羥基自由基、超氧自由基清除能力和還原力均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，但是DPPH自由基和羥基自由基清除能力在發(fā)酵后期表現(xiàn)出不規(guī)則變化，因此延長發(fā)酵時間不利于抗氧化能力的提高。無花果酵素中有機(jī)酸組成及含量豐富，不僅具有常見的乳酸、檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸，還含有大量的葡萄糖醛酸和泛酸。相關(guān)性分析表明，無花果酵素中的檸檬酸、蘋果酸、富馬酸、泛酸對其抗氧化活性起著重要的作用。綜合評價指標(biāo)分析結(jié)果表明，發(fā)酵第60天綜合得分最高，發(fā)酵80天后出現(xiàn)明顯下降的趨勢，此可以作為無花果酵素前發(fā)酵結(jié)束的依據(jù)。無花果酵素中代謝產(chǎn)物及抗氧化活性的變化均是微生物消亡和適應(yīng)的結(jié)果，因此有必要對無花果酵素自然發(fā)酵過程中微生物菌群變化開展研究，以期對無花果酵素的發(fā)酵過程實(shí)施更精準(zhǔn)的調(diào)控，指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)，獲得更優(yōu)質(zhì)的酵素產(chǎn)品。