張婷婷 ,薛衛(wèi)斌 ,蔣一斕 ,楊 霞 ,王浩園 ,羅?？怠?/p>

1.重慶市第九人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科,重慶 400700;2.西南大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院,重慶 400700

凝血因子Ⅺ(FⅪ)又稱血漿凝血酶原前質(zhì)(PTA),是由肝臟和巨核細胞所產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶原。早期凝血理論認為FⅪ是內(nèi)源性凝血途徑的重要因子,由FⅫa激活參與凝血過程;修正后的凝血理論則認為FⅪ更重要的作用在于放大凝血級聯(lián)反應(yīng),促進凝血酶的持續(xù)生成,抑制纖溶,穩(wěn)定血凝塊[1]。FⅪ缺乏癥首次報道是在1953年,相關(guān)學(xué)者發(fā)現(xiàn)該病是一種有別于抗血友病球蛋白(AHG)缺乏(血友病A)和血漿凝血活酶成分(PTC)缺乏(血友病B)的出血性疾病,稱為PTA 缺乏病(血友病C)[2];該病的遺傳方式為常染色體不完全隱性遺傳,與血友病X 染色體連鎖的隱性遺傳方式不同,故被剔除,現(xiàn)普遍稱為FⅪ缺乏癥。FⅪ缺乏癥在人群中較罕見,發(fā)病率僅為1/106～1/105[3]。迄今為止,人類基因突變數(shù)據(jù)庫[HGMD?gene result (cf.ac.uk)]報道了FⅪ基因的280多個突變個體。本研究通過基因測序技術(shù),對1例FⅪ缺乏癥患者進行FⅪ基因的全外顯子擴增并測序,確定其基因的突變位點,同時利用生物信息學(xué)工具分析該突變的致病可能性,初步探討該病例的發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患者,女,漢族,30歲,停經(jīng)52 d,要求終止妊娠,術(shù)前檢查發(fā)現(xiàn)凝血功能異常。進一步完善活化部分凝血活酶時間(APTT)糾正試驗和凝血因子活性檢查確診為FⅪ缺乏癥。肝功能、血常規(guī)等檢查均無明顯異常。該患者身體健康,無出血及血栓傾向,月經(jīng)規(guī)律,量中,無痛經(jīng)。適齡結(jié)婚,孕3產(chǎn)2,順產(chǎn)2女,丈夫及女兒均體健。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及處理 采集2管患者靜脈血標本2.7 mL,以3.2%枸櫞酸鈉1∶9抗凝,1管在規(guī)定的條件下(室溫,1 500×g、15 min)離心得到乏血小板血漿(血小板計數(shù)<10×109/L)用于凝血指標檢測。另1管靜脈全血標本送重慶浦洛通醫(yī)學(xué)檢驗實驗室進行基因測序分析。

1.2.2 凝血指標檢測 采用SYSMEX CS5100全自動凝血分析儀和SIEMENS配套凝血試劑檢測患者凝血酶原時間(PT)、APTT、血漿纖維蛋白原水平(Fbg)、凝血酶時間(TT)及完善APTT 糾正試驗和凝血因子Ⅱ活性(FⅡ∶C)、凝血因子Ⅴ活性(FⅤ∶C)、凝血因子Ⅶ活性(FⅦ∶C)、凝血因子Ⅷ活性(FⅧ∶C)、凝血因子Ⅸ活性(FⅨ∶C)、凝血因子Ⅹ活性(FⅩ∶C)、凝血因子Ⅺ活性(FⅪ∶C)、凝血因子Ⅻ活性(FⅫ∶C)檢測。

1.2.3 二代測序 使用HiPure Blood DNA Mini Kit血液DNA 小量提取試劑盒(產(chǎn)品編號:D3111-03,生產(chǎn)批次號:DJC31-01)提取患者外周血DNA。通過超聲打斷的方式將患者血漿DNA 打斷并制備文庫,之后用IDT xGen Exome Research Panel v1.0 對目標區(qū)域進行捕獲,再使用高通量測序平臺對變異進行檢測。本研究檢測平均測序深度100X;Q30≥85%,Q20≥90%,參考基因組GRCh37/hg19。

1.2.4 一代測序驗證 對含突變位點在內(nèi)的220 bp堿基序列進行擴增,利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計特異性引物。引物序列為:正向5'-ATC TTT CTT TGG GGT TCA AGA A-3',反向5'-TGG CAC TCT TCG TTG GTC ACT A-3'。第一輪PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))總反應(yīng)體積25 μL;擴增體系為2×T5 Direct PCR Mix(Blood):12.5 μL;ddH2O:9.5 μL;正向引物:1 μL;反向引物:1μL;DNA 模板:1 μL。擴增程序:98 ℃預(yù)變性3 min,98 ℃變性10 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸15 s,一共進行35個循環(huán);72 ℃再次延伸3 min,4 ℃保存。將5 μL PCR 產(chǎn)物放在2.0%的瓊脂糖凝膠上,通過電泳檢測擴增效果。第一輪擴增完成后用磁珠(MagPure P1)純化法進行純化,然后進行第二輪PCR,總體積10 μL,擴增體系為Seq Buffer,1.9 μL,ddH2O:5.9 μL;Big Bye:0.25 μL。反向引物或正向引物:1 μL;DNA 模板:1 μL。擴增程序:96 ℃預(yù)變性1 min,96 ℃變性10 s,50 ℃退火5 s,60 ℃延伸4 min,共進行25 個循環(huán),4 ℃保存。第二輪擴增完成后,再用磁珠(DTR)進行純化,最后取15 μL 純化完成后的DNA 上機測序(上機儀器為一代測序儀ABI 3500)。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 用ClustalX-2.1-win軟件將人的FⅪ氨基酸序列與6個同源物種[褐家鼠(Rattus norvegicus)、小 家 鼠(Mus musculus)、獼 猴(Macaca mulatta)、牛(Bos troglodytes)、馬(Equus caballus)、豬(Sus scrofa)]的氨基酸序列進行比對,分析突變氨基酸位點在物種進化過程中的保守性。在Uniprot數(shù)據(jù)庫中查找FⅪ的ID 并獲取該蛋白質(zhì)FASTA 格式的氨基酸序列,用生物信息學(xué)在線工具Polyphen2預(yù)測突變位點的危害性,再利用蛋白質(zhì)變異效應(yīng)分析軟件 PROVEAN 分析突變是否影響蛋白質(zhì)功能。用SWISS-MODEL 預(yù)測野生型和突變型FⅪ的三維結(jié)構(gòu),在Pymol 軟件中查看Thr517 和Asn517周圍的氫鍵情況,分析第517位的Thr突變?yōu)锳sn后蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)及分子間作用力的變化情況,參考蛋白質(zhì)FⅪ的名稱為“P03951”。

2 結(jié)果

2.1 凝血指標檢測結(jié)果 對患者進行凝血4 項及APTT 糾正試驗,結(jié)果顯示,患者APTT 為74.6 s,高于參考范圍上限;Fbg為4.32 g/L,比參考范圍上限稍高。APTT(1∶1混合血漿即刻檢測)、APTT(1∶1混合血漿孵育2 h)均在參考范圍內(nèi),可以糾正,見表1。凝血因子活性檢測結(jié)果顯示患者FⅪ∶C 僅為4.1%,低于參考范圍下限,其他凝血因子活性均正常,見表2。

表1 患者凝血4項及APTT 糾正試驗結(jié)果

表2 患者凝血因子活性檢測結(jié)果

2.2 基因分析結(jié)果 全外顯子高通量測序結(jié)果顯示,患者F11基因的第13外顯子出現(xiàn)了新的突變,新的突變位點為c.1550C>A/p.Thr 517Asn,一代測序驗證此結(jié)果。與參考序列(NM_000128.3)相比,F11基因的CDS序列的第1 550個堿基由C變?yōu)榱薃,且為純和突變,序列信息上傳至NCBI(SRA Accession:PRJNA763306)。該突變在數(shù)據(jù)庫中未見報道。見圖1。

圖1 患者F11基因測序結(jié)果

2.3 同源性與突變危害分析結(jié)果 ClustalX-2.1-win軟件保守性分析結(jié)果表明,人類凝血因子Ⅺ突變位點Thr517在本文找的6種同源物種間高度保守。Polyphen2對F11基因突變位點p.Thr 517Asn的危害性預(yù)測結(jié)果顯示,HumDiv和HumVar兩個指標都是“PROBABLY DAMAGING”,得分分別為1.000和0.998。見圖2。

圖2 p.Thr 517Asn保守性分析和危害性預(yù)測

2.4 FⅪ三維結(jié)構(gòu)模型分析結(jié)果 見圖3。結(jié)果顯示,Thr517位于β-折疊結(jié)構(gòu)域。Asn517也位于β-折疊結(jié)構(gòu)域。同時,Thr517 周圍沒有氫鍵,Val516 與Ala535有兩個距離分別為1.9? 和2.0?的氫鍵,Glu518與Gln533有兩個距離分別為2.3? 和2.1?氫鍵。圖3D 顯示Asn517 與Gln533 有一個距離為2.4?的氫鍵,Val516 與Ala535 有兩個距離分別為1.9? 和2.1?的氫鍵,Glu518與Gln533有兩個距離分別為2.4? 和2.1? 氫鍵。圖3C、圖3D 中標記為①的是氫鍵,標記為②的柱狀氨基酸為Val516,標記為③的柱狀氨基酸為Thr517,標記為④柱狀氨基酸為Glu518,標記為⑤的柱狀氨基酸為Ala535,標記為⑥的柱狀氨基酸為Gln533。

圖3 野生型、突變型FⅪ三維結(jié)構(gòu)模型圖

3 討論

FⅪ缺乏癥的癥狀相對較輕,自發(fā)性出血罕見,主要見于受傷或手術(shù)相關(guān)的出血,尤其是當創(chuàng)傷涉及具有高纖維蛋白溶解活性的局部部位,如口腔或鼻腔、前列腺和尿道[4]。多數(shù)患者在術(shù)前檢查凝血功能異常時發(fā)現(xiàn),女性患者可因月經(jīng)量過多而就診[5]。研究表明,FⅪ∶C與出血嚴重程度之間缺乏相關(guān)性,一些輕度患者與重度患者的出血頻率幾乎相同[6]。目前實驗室常規(guī)檢測方法無法評估FⅪ缺乏癥患者的出血風(fēng)險,在FⅪ缺乏癥患者中出血表現(xiàn)具有高度異質(zhì)性而FⅪ的替代治療可能會增加患者發(fā)生血栓風(fēng)險[7]。對非出血患者,替代治療存在過度使用的風(fēng)險,而對于出血患者可能存在治療不足,因此應(yīng)該根據(jù)患者個體風(fēng)險、手術(shù)部位及類型等采用個體化診療措施。

本研究中患者為育齡期女性要求終止妊娠,術(shù)前檢查發(fā)現(xiàn)凝血功能異常,APTT 延長,FⅪ∶C 僅為4.1%,APTT 糾正試驗顯示糾正,可以排除凝血因子抗體及抑制物的影響[8]。患者肝功能、血常規(guī)等檢查無明顯異常,并無出血與血栓表現(xiàn),已順產(chǎn)2女且無異常出血。未糾正凝血功能行人工流產(chǎn)術(shù)中及術(shù)后亦未異常出血,術(shù)后第2天出院。大多數(shù)FⅪ缺乏癥為遺傳性,獲得性FⅪ缺乏癥非常罕見,多為個案報道,與免疫系統(tǒng)功能障礙、腫瘤及輸血等因素相關(guān),APTT 糾正試驗不能糾正可將其與遺傳性鑒別[9]。根據(jù)本研究中患者病史及相關(guān)實驗室檢查結(jié)果可初步診斷為遺傳性FⅪ缺乏癥。

FⅪ是一種有助于止血的血漿絲氨酸蛋白酶酶原,由兩個FⅪ單體通過第321位的半胱氨酸產(chǎn)生的二硫鍵形成同源二聚體,并以此種方式存在于血漿中[10]。每個單體包含4 個串聯(lián)的蘋果(Ap)結(jié)構(gòu)域(A1～A4),這些Ap結(jié)構(gòu)域顯示出彼此之間的序列同源性,還包含1個絲氨酸蛋白酶(SP)域,該域與其他凝血因子的絲氨酸蛋白酶域同源。FⅪ的激活導(dǎo)致位于第369位的精氨酸(Arg)與第370 位的異亮氨酸(Ile)之間的肽鍵斷裂,形成包含 Ap 結(jié)構(gòu)域的重鏈和包含 SP 結(jié)構(gòu)域的輕鏈,在 His413、Asp462 和 Ser557處具有催化三聯(lián)體(H413-A462-S557)。編碼FⅪ的基因是F11,F11位于4號染色體長臂 (4q35),由15個外顯子和14個內(nèi)含子組成[11]。1號外顯子編碼5'端非轉(zhuǎn)錄區(qū),2號外顯子編碼18個氨基酸的信號肽,3～10號外顯子編碼成熟蛋白位于氨基端的4個Ap結(jié)構(gòu)域,其中每兩個外顯子編碼1個Ap結(jié)構(gòu)域,11～15號外顯子編碼的是多肽鏈羧基端的SP結(jié)構(gòu)域[1]。目前,F11的突變位點約有280個,不同位點的突變,將對FⅪ產(chǎn)生不同的影響。

先前的研究中充分體現(xiàn)了氨基酸的變化引起蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)變化,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)中氨基酸相互作用力的改變并影響其功能的事實。如LEE 等[12]研究發(fā)現(xiàn)位于F11的13外顯子C.1517A>G/Asp506Gly的突變,C 端催化域中的Asp506殘基通過形成氫鍵與A3域中的Arg202 相互作用,此突變造成了Asp完全被Gly取代并破壞了與Arg202的氫鍵相互作用,這種破壞可能會導(dǎo)致A3結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化,從而造成患者凝血障礙;SU 等[13]研究發(fā)現(xiàn)Tyr503Cys的突變中,替換產(chǎn)生了半胱氨酸殘基,導(dǎo)致形成額外的氫鍵和二硫鍵,影響FⅪ蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,Tyr503位于FⅪ催化結(jié)構(gòu)域 (催化三聯(lián)體:H413-A462-S557),因此Tyr503Cys突變可能會導(dǎo)致FⅪ功能嚴重缺陷;GAILANI等[14]研究發(fā)現(xiàn)Pro520Leu突變導(dǎo)致FⅪ催化效率降低;ZIVELIN 等[15]對Gly555Glu研究發(fā)現(xiàn)突變后將大大降低FⅪ激活率;葉佳佳等[16]研究發(fā)現(xiàn)Cys482Trp使FⅪ重要結(jié)構(gòu)域缺失及作用力改變導(dǎo)致形成不穩(wěn)定蛋白,可能導(dǎo)致FⅪ∶C下降。

本研究中二代測序結(jié)果表明患者F11基因中發(fā)現(xiàn)了新的突變位點c.1550C>A/p.Thr 517Asn,并通過一代測序驗證該突變位點。在Ensemble數(shù)據(jù)庫搜索,發(fā)現(xiàn)此位點位于F11第13外顯子,FⅪ氨基酸序列第517位蘇氨酸被天冬酰胺取代。經(jīng)同源序列比對,Thr517在同源物種中高度保守,說明該位點的重要性和功能特異性。PoliPhen2在線預(yù)測蛋白突變影響的結(jié)果顯示為“可能具有危害性”,HumDiv 和HumVar兩個指標得分分別為1.000和0.998,表明此突變可能引起相關(guān)疾病。FⅪ三維結(jié)構(gòu)建模顯示,Thr517位于FⅪ的β-折疊域,且Thr周圍并無氫鍵,但是與Thr相鄰的516Val與Ala535有兩個距離分別為1.9? 和2.0?的氫鍵,Glu518與Gln533有兩個距離分別為2.3? 和2.1?的氫鍵。但是當Thr517突變?yōu)锳sn后,Asn517與Gln533之間增加了一個距離為2.4?的氫鍵,Val516 與Ala535 之間的兩個氫鍵有一個距離由2.0? 變?yōu)?.1?,Glu518與Gln533之間的兩個氫鍵有一個距離由2.4? 變?yōu)?.1?。由此可見,FⅪ的Thr517突變?yōu)锳sn后,自身增加了額外的氫鍵,同時還改變周圍氨基酸的氫鍵作用強度,從而影響了FⅪ的三維構(gòu)象及其功能。此種改變可能導(dǎo)致FⅪ難以被FⅫ激活或催化活性顯著降低,患者出現(xiàn)APTT 明顯延長,其分子機制有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)1例FⅪ缺乏患者,通過二代測序和一代測序證實其為遺傳性FⅪ缺乏癥,突變位點(c.1550C>A/p.Thr 517Asn),通過生物信息學(xué)分析,認為此突變是造成的凝血因子Ⅺ活性降低原因。該位點突變導(dǎo)致APTT 顯著延長,但患者不會出現(xiàn)凝血功能障礙,診療過程中不需補充凝血因子?？傊?本研究豐富了FⅪ遺傳變異的數(shù)據(jù)庫,也為臨床工作中類似病例的診療提供了參考。