史浩天 ,范學(xué)武 ,田 龍△ ,胡逸民

1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,河北張家口 075000;2.河北省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科導(dǎo)管室,河北石家莊 050000;3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院放療科,北京 100021

前列腺癌(PCa)粗發(fā)病率位居中國(guó)男性惡性腫瘤第6位,且仍在升高[1]。局限性或區(qū)域性擴(kuò)散的PCa患者5年相對(duì)生存率可達(dá)100.0%,但存在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的PCa患者僅為30.2%[2]。因此,早期篩查確診PCa并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶將會(huì)極大改善患者預(yù)后,具有重要的臨床意義。

PCa早期篩查方法以血清前列腺特異性抗原(PSA)檢驗(yàn)為主。PCa發(fā)病率隨著PSA 水平升高而升高[3-6]。然而一些良性病變,如前列腺增生(BPH)也會(huì)導(dǎo)致PSA 升高。因此,單獨(dú)檢測(cè)PSA 對(duì)PCa的診斷特異度較低。目前,生物基因組標(biāo)志物已經(jīng)開始應(yīng)用于多種腫瘤的篩查和治療[7]。其中有關(guān)參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控,長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子微小RNA(miRNA)相關(guān)研究較多。miRNA 可作為致癌基因或抑癌基因在PCa中異常表達(dá),對(duì)PCa的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移具有較大影響[8]。因此,在前列腺腫瘤組織,尿液和血清標(biāo)本中檢測(cè)特定miRNA 表達(dá)水平可能對(duì)提高PCa診斷準(zhǔn)確率具有重大意義,但目前相關(guān)研究較少。

為了明確miRNA 對(duì)PCa的診斷意義,本研究檢測(cè)了前列腺疾病患者前列腺影像學(xué)異常區(qū)域(IAA)組織中miRNA-182和miRNA-187表達(dá)水平并統(tǒng)計(jì)分析其與PCa各項(xiàng)臨床資料間的關(guān)系和對(duì)PCa的診斷效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院2019年12月至2020年12月收治的33例PCa患者為試驗(yàn)組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)體質(zhì)量指數(shù)在18～25 kg/m2;(2)患者接受多參數(shù)磁共振成像并確定IAA大小;(3)患者接受經(jīng)直腸超聲引導(dǎo)穿刺活檢;(4)各項(xiàng)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)前列腺存在嚴(yán)重鈣化、肥大或感染;(2)合并直腸息肉或痔瘡;(3)接受過前列腺按摩;(4)接受過其他針對(duì)前列腺疾病的治療(手術(shù)、放化療、激素治療等)?；颊吣挲g52～73歲,平均(65.2±7.8)歲;年齡≥60歲患者26例,<60歲7例;6例為Gleason評(píng)分(GS評(píng)分)≤6分的高分化腺癌患者,7例為GS評(píng)分=7分的中分化腺癌患者,20例為GS評(píng)分≥8分的低分化腺癌患者;患者PSA水平在0～<10 ng/mL的有5例,10～<20 ng/mL的有7例,≥20 ng/mL的有21例;腫瘤分期在T1～T2期有14例,T3～T4期有19例;全身骨掃描發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移患者17 例,未發(fā)生轉(zhuǎn)移者16 例;前列腺IAA≥1 cm 者9例,<1 cm 者24例。選取同期收治的前列腺增生(BPH)患者30例為對(duì)照組。本研究通過該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理編號(hào):W2021)。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 Trizon Reagent試劑盒和低溫高速離心機(jī)均購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀和試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司。生物組織研磨器購(gòu)自法國(guó)Bertin 公司。miRNA-182、miRNA-187、U6逆轉(zhuǎn)錄引物、PCR 上下游引物均由美國(guó)Sigma生物科技公司提供,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 方法

1.3.1 IAA 組織標(biāo)本的獲取 對(duì)所有患者進(jìn)行經(jīng)直腸超聲引導(dǎo)穿刺活檢,所有活檢標(biāo)本取自多參數(shù)磁共振影像確定的IAA。將活檢標(biāo)本置于研磨器中,Trizol充分裂解后加入氯仿進(jìn)行離心。之后將上層水相抽至新的微量離心管中,加入同體積冷異丙醇以沉淀RNA。之后離心并丟棄上清液,使用75%預(yù)冷乙醇洗滌包含RNA的沉淀物,離心并丟棄上清液。最后,于RNA 提取試劑盒中加DEPC處理水溶解標(biāo)本。采用紫外分光光度法檢測(cè)總RNA 濃度及純度,取吸光度比值為1.8～2.1的樣品用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 miRNA 表達(dá)水平的測(cè)定 以U6為內(nèi)參,將樣本逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并利用SYBR Premix ExTaq熒光 定量PCR 試劑盒、miRNA-182/187 引物和SYBRGreen 熒光染料,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄。通過RT-qPCR 曲線獲得熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù),即Ct值,miRNA 相對(duì)表達(dá)水平計(jì)算公式為RQ=2-ΔΔCt。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用M(P25,P75)表示,組間比較采用秩和檢驗(yàn)。根據(jù)受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)評(píng)估m(xù)iRNA 對(duì)PCa的診斷效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組miRNA 表達(dá)水平比較 試驗(yàn)組IAA 組織中miRNA-182 表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P=0.002);miRNA-187表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.001),見表2。

表2 兩組miRNA 表達(dá)水平的比較[M(P25,P75)]

2.2 PCa患者miRNA 表達(dá)水平與臨床資料的關(guān)系 結(jié)果顯示,PCa患者miRNA-182 表達(dá)水平與所有臨床資料無關(guān);miRNA-187表達(dá)水平與血清PSA水平、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、IAA 大小存在一定關(guān)系,PSA≥10 ng/mL、存在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、IAA≥1 cm 時(shí),miRNA-187表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。但miRNA-187表達(dá)水平與年齡、GS評(píng)分、臨床分期無關(guān)(P>0.05)。見表3。

表3 miRNA 表達(dá)水平與各臨床資料的關(guān)系[M(P25,P75)]

續(xù)表3 miRNA 表達(dá)水平與各臨床資料的關(guān)系[M(P25,P75)]

2.3 miRNA的診斷效能 單獨(dú)檢測(cè)miRNA-182診斷PCa的AUC 為0.638(95%CI:0.522～0.711,P<0.01);單獨(dú)檢測(cè)miRNA-187 診斷PCa的AUC為0.741(95%CI:0.652～0.799,P<0.01);miRNA-182與miRNA-187 聯(lián)合檢測(cè)診斷PCa的效能最高,AUC為0.822(95%CI:0.771～0.839,P<0.01)。

3 討論

miRNA 通過參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后影響基因表達(dá)調(diào)控,即調(diào)節(jié)從DNA 到蛋白質(zhì)的過程,影響細(xì)胞分化、增殖和凋亡等過程[9]。50%以上的miRNA 位點(diǎn)在腫瘤相關(guān)區(qū)域[10],其異常表達(dá)是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的重要原因之一[11]。miRNA 對(duì)PCa的影響極為復(fù)雜,可分為表達(dá)水平升高而發(fā)揮“促癌”作用的miRNA-21、miRNA-34b等,以及表達(dá)水平降低而發(fā)揮“抑癌”作用的miRNA-15a、miRNA-206 等[12]。隨著研究進(jìn)展,同PCa密切相關(guān)的miRNA 不斷被發(fā)現(xiàn),其作用機(jī)制也逐漸清晰。

本研究發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組IAA 組織中miRNA-182表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P=0.002);miRNA-187表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.001)。劉云等[13]研究發(fā)現(xiàn),miRNA-182在PCa組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織,且在PCa 細(xì)胞系PC-3、LNCaP 和DU145中的表達(dá)均高于前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE-1;miRNA-182可上調(diào)PCa細(xì)胞雄激素非依賴性生長(zhǎng),并通過干預(yù)多個(gè)抑癌基因表達(dá)來遲滯腫瘤細(xì)胞凋亡程序的啟動(dòng);成功下調(diào)miRNA-182表達(dá)后,PCa細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制,細(xì)胞凋亡能力明顯增強(qiáng),FOXO1表達(dá)水平明顯升高,VEGF和p53的表達(dá)明顯降低,從而降低了“促癌”作用。HU 等[14]研究中發(fā)現(xiàn)miRNA-187在PCa組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織,而CD276表達(dá)水平明顯升高。miRNA-187通過誘導(dǎo)CD276抑制PCa細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和血管生成,促進(jìn)其凋亡。成功上調(diào)miRNA-187 表達(dá)后,CD276表達(dá)降低,JAK3-STAT3-Slug 信號(hào)通路受到抑制,從而降低了“抑癌”作用[15-16]。

本研究結(jié)果顯示,單獨(dú)檢測(cè)miRNA-182 診斷PCa的AUC 為0.638,單獨(dú)檢測(cè)miRNA-187 診斷PCa的AUC 為0.741,miRNA-182 與miRNA-187聯(lián)合檢測(cè)診斷PCa的效能最高,AUC 為0.822。鄭興明等[17]研究了miRNA-34b聯(lián)合PSA 檢測(cè)對(duì)PCa的診斷價(jià)值,結(jié)果顯示,聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值最高。未來研究中可以聯(lián)合直腸指檢、經(jīng)直腸超聲和多參數(shù)磁共振等臨床資料進(jìn)行診斷,可能會(huì)進(jìn)一步提高診斷效能。

綜上所述,IAA 組織中miRNA-182 和miRNA-187的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)PCa診斷具有一定臨床價(jià)值,值得臨床推廣應(yīng)用。