劉 爽，馬國武

鈷鉻合金因其良好的生物相容性、耐磨性和耐腐蝕性，且價格低廉,已成為口腔科學應(yīng)用最廣泛的金屬材料。目前，鈷鉻合金材料可以采用傳統(tǒng)的鑄造工藝和3D打印技術(shù)加工制備而用于口腔修復(fù)科，傳統(tǒng)鑄造技術(shù)受周期、鑄件性能的影響，存在不同的缺陷[1]，3D打印則常采用選擇性激光熔融技術(shù)(selective laser melting，SLM)，具備精確的數(shù)字化模型，具有制作過程無模具，人為干預(yù)少的優(yōu)點而受到關(guān)注[2]。研究表明3D打印在組織相容性方面具有優(yōu)勢[3]，應(yīng)用SLM技術(shù)制成的金屬樣品與細胞生物性能的研究比較中[4-5]，樣品在細胞生長、遷移和粘附方面表現(xiàn)出很好的生物相容性。而關(guān)于3D打印鈷鉻合金與鑄造合金在理化性能和生物學影響的全面比較的研究較少[6]。

本研究以常見的鈷鉻合金為原料，利用3D打印的選擇性熔融技術(shù)、傳統(tǒng)的鑄造技術(shù)制作鈷鉻合金試件，通過硬度測定、耐腐蝕性檢測、細胞毒性及凋亡實驗檢測，為3D打印鈷鉻合金在臨床應(yīng)用上進一步提供科學的數(shù)據(jù)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗設(shè)備及材料

鈷鉻合金金屬粉和金屬塊(Co 63.54%、Cr 24.88%、W 5.05%、Si 0.78%)，金屬3D打印機(鉑力特BLT-A100，西安)，義獲嘉烤鑄一體爐(EP 3010，義獲嘉偉瓦登特上海商貿(mào)有限公司)，洛氏硬度計HR-150A、金相顯微鏡(均由大連理工大學材料學院提供)，超聲波清洗器(濟南永興偉業(yè)儀器儀表有限公司)，電化學工作站(遼寧石油化工大學提供)，小鼠成纖維細胞(武漢博士德生物工程有限公司)，CCK-8增殖細胞毒檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒(均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試件制備

以金屬粉末和金屬塊為原材料采用金屬3D打印機(激光功率7.4 kW，掃描速度7 m/s，送粉速度2 ～10 cm3/h，光斑直徑70～200 μm，保護氣體為氮氣，保護氣體流量為1 m3/h，層厚0.03 mm)和義獲嘉烤鑄一體爐分別制作出直徑25 mm高1 mm的圓柱試件各10個。

1.3 理化實驗方法

1.3.1 洛氏硬度測定 測量金屬試件表面洛氏硬度載荷60 kg，取5點計算平均值。

1.3.2 金相觀察 將各金屬試件依次用400、600、800、1 000、2 000目砂紙進行打磨處理，并拋光至鏡面，用現(xiàn)制王水(V(HNO3)∶V(HCl)=1∶3)腐蝕60 s，在金相顯微鏡下觀察并分析樣品金相組織。

1.3.3 極化曲線的測定 本實驗采用三體電極體系，金屬試樣為工作電極，石墨為輔助電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，動電位極化曲線由美國PAR公司的2273電化學工作站測試完成。以1 mV/s的速率進行計劃掃描，掃描電位范圍為-0.8～0.6 V。將金屬試件放入模擬體液中，在自腐蝕電位下對金屬試件進行電化學阻抗測試，測量頻率范圍為100 kHz～10 MHz，擾亂電位為10 mV，測量在自腐蝕電位下進行，測量結(jié)果用Origin軟件進行數(shù)據(jù)擬合。

1.4 生物學實驗方法

1.4.1 浸提液的制備 根據(jù)中華人民共和國國家標準GB/T 16886.12-2005/ISO 10993-12：2002，在無菌操作臺中，將已經(jīng)制備好的試件按3 cm2/mL比例浸泡于新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2條件下連續(xù)浸提72 h。然后按體積分數(shù)加入10%的胎牛血清和1%雙抗，混勻，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 實驗分組 陰性對照組(a)、實驗組3D打印鈷鉻合金浸提液(b)、鑄造鈷鉻合金浸提液(c)，空白對照組(d)，每組5個平行。

1.4.3 細胞毒性檢測 將處于對數(shù)生長期的L-929細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成濃度為5×104個/mL的細胞懸液，接種至96孔板中，每孔細胞懸液100 μL，置于37 ℃、飽和濕度、CO2濃度為5%的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，待細胞貼壁后，棄原培養(yǎng)基，PBS沖洗，分別加入a、b、c、d組浸提液或培養(yǎng)基，至培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，微振蕩后置入培養(yǎng)箱，3 h后終止培養(yǎng)，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長處測定各孔吸光度，重復(fù)5次取各組平均值。計算小鼠成纖維細胞L-929的相對增殖率，根據(jù)細胞毒性評定標準對各組結(jié)果進行評價。

1.4.4 運用AnnexinⅤ-FITC/PI熒光染色檢測細胞凋亡 待L-929細胞在a、b、c、d各組浸提液中培養(yǎng)48 h后，吸出各孔中的鈷鉻合金浸提液，用不含EDTA的0.25%胰酶對細胞進行消化3 min，將消化下來的細胞懸液與各孔吸出的鈷鉻合金浸提液一起離心，1 000 r/min 5 min，PBS洗滌2次，加入500 μL的Binding Buffer 懸浮細胞；加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻，室溫、避光、反應(yīng)5～15 min，在1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測，流式細胞儀激光波長用488 nm，用一波長為515 nm通道濾器檢測FITC，另一波長大于560 nm的濾器檢測PI。重復(fù)3次取平均值，觀察各組細胞流式細胞儀散點圖，計算每組細胞凋亡率。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 洛氏硬度測量

3D打印組、鑄造組的洛氏硬度分別為70.6±0.1、68.5±0.2，3D打印組強于鑄造組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.005)。

2.2 金相觀察

由圖1可看出3D打印鈷鉻合金組織沒有第二相；鑄造組織為樹枝晶，第二相強化。

A：3D打印組；B：鑄造組

2.3 極化曲線分析

由圖2可知各種金屬試件在模擬體液中的腐蝕參數(shù)，即自腐蝕電位、自腐蝕電流密度，數(shù)值見表1(陰極極化曲線和陽極極化曲線直線部分外延，相交于一點，縱坐標為自腐蝕電流密度，橫坐標為自腐蝕電位，該點處電流為維鈍電流[7])。由于耐腐蝕性與自腐蝕電流密度和維鈍電流成負相關(guān)[8]，由圖2可看出在耐腐蝕性方面3D打印鈷鉻合金強于鑄造鈷鉻合金。

表1 各種金屬試件在生理鹽水中的腐蝕參數(shù)Tab.1 Electrochemical parameters of various metal specimens in normal saline

圖2 各組金屬試件在生理鹽水中的極化曲線Fig.2 Polarization curves of each group of metal specimens in normal saline

2.4 CCK-8檢測細胞毒性

24、48、72 h時，3D打印組、鑄造組、陰性對照組之間細胞毒性差異有顯著性意義，鑄造組細胞毒性最強，且各組均隨著時間延長細胞毒性逐漸增強(圖3)。參考美國藥典，細胞毒性評價結(jié)果為表2。

*:P<0.05；**:P<0.01；***:P<0.001

表2 各組細胞相對增殖率和細胞毒性等級Tab.2 Relative cell proliferation rate and cytotoxicity level of each group

2.5 細胞凋亡實驗

經(jīng)流式細胞儀顯示各象限的正常細胞和不同時期的凋亡細胞(圖4)，并分析計算凋亡率，3D打印組、鑄造組、陰性對照組細胞均以正常細胞為主，三組的凋亡率分別為(3.513±0.055)%、(5.407±0.401)%、(2.497±0.121)%，各組間均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

A：陰性對照組；B:3D打印組；C:鑄造組

3 討 論

傳統(tǒng)的鑄造技術(shù)生產(chǎn)的鈷鉻合金作為口腔科材料在臨床應(yīng)用已有幾十年之久，在其制造的繁瑣工藝中，很容易出現(xiàn)錯誤。3D打印則是一種快速成型技術(shù)[9]，用SLM技術(shù)生產(chǎn)鈷鉻合金時，可以在相對短的時間段內(nèi)，直接借助電腦輔助的設(shè)計模型，以鈷鉻粉末為原料，一層一層地從模型的切片數(shù)據(jù)中用激光融熔的數(shù)據(jù)“打印”產(chǎn)品，新一層的金屬粉末覆蓋在熔化層之上，激光則根據(jù)切片中的數(shù)據(jù)再次掃描熔化這些金屬粉末，不斷循環(huán)直到自動化地完成產(chǎn)品為止，具有節(jié)省人力物力的優(yōu)點[10]，然而其制造的鈷鉻合金產(chǎn)品在臨床應(yīng)用上的特性則有待驗證。

本實驗選用了3D打印鈷鉻合金和鑄造鈷鉻合金，測定硬度、極化曲線，進行金相觀察，并制備浸提液檢測其對小鼠成纖維細胞L-929的生物相容性。

口腔具有復(fù)雜的咀嚼環(huán)境，金屬材料的表面硬度是其抵抗外力防止變形的重要性質(zhì)，具有良好硬度的材料可以增加其在口腔修復(fù)治療后的使用年限。一般常溫下，組織越細，表面硬度越高，由圖1可以看出鑄造組織為樹枝晶，第二相強化，3D打印組織為快速凝固，固溶強化，所以硬度較鑄造組織高。同時鑄造組織的第二相與基體自腐蝕電位不同，形成原電池，3D打印技術(shù)表現(xiàn)出更耐腐蝕的特點，這與之前的研究[11]一致。3D工藝產(chǎn)生的鈷鉻合金表現(xiàn)得更致密更光滑，這與其表面硬度和耐腐蝕性有一定的關(guān)系[12]。

口腔金屬材料腐蝕可釋放金屬離子和腐蝕衍生物，作用于細胞，產(chǎn)生細胞毒性[13]。Richardson等[14]研究口腔材料的細胞毒性時發(fā)現(xiàn)，浸提液中離子濃度越大，則細胞毒性越強，離子的濃度與口腔黏膜細胞的損傷成正相關(guān)[15]。金屬離子作為一種化學因素作用于細胞，可導致DNA損傷，若損傷不能修復(fù)，則啟動細胞進入程序性凋亡，且析出的金屬離子濃度不同，細胞效應(yīng)也不同，對鄰近的器官及遠隔器官的損傷也不同[16]。在本實驗的條件下，從細胞毒性和細胞凋亡兩方面檢測，3D打印加工工藝的鈷鉻合金均優(yōu)于鑄造鈷鉻合金，這可能是由于3D打印鈷鉻合金的耐蝕性較好，培養(yǎng)基中析出的金屬離子和腐蝕衍生物較少的原因。

綜上所述，3D打印鈷鉻合金試件在機械性能耐腐蝕性和細胞毒性上的表現(xiàn)均優(yōu)于傳統(tǒng)鑄造鈷鉻合金，本實驗進一步證明了3D打印鈷鉻合金在口腔領(lǐng)域的臨床應(yīng)用價值。目前，3D打印技術(shù)由于快速成型，更精準化的特點，是一種由大批量制造模式向個性化制造模式轉(zhuǎn)變的技術(shù)[17-18]，已應(yīng)用于神經(jīng)外科[19]、頜面部贗復(fù)體的制作[20]等領(lǐng)域。由于3D打印與人體組織的相互關(guān)系，未來分子生物學與材料學和醫(yī)學的多學科聯(lián)動可能會為3D打印的發(fā)展提供新的機會[21]。