顧 紅，王 威，張衛(wèi)兵，2

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)是一種呼吸性睡眠障礙，其特征是上呼吸道擴(kuò)張肌張力改變導(dǎo)致夜間反復(fù)發(fā)作上呼吸道部分或者完全阻塞，這種阻塞通常在上呼吸道呼吸存在情況下，上呼吸道氣流減少或者完全停止，導(dǎo)致間歇性低氧血癥和覺(jué)醒[1]。OSAS患者多伴有口呼吸習(xí)慣，這種習(xí)慣將改變顱面生長(zhǎng)模式[2]。多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)是OSAS診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，治療手段主要包括持續(xù)性正壓通氣治療(CAPA)[3]、牽張成骨[4]、正畸/正畸-正頜聯(lián)合矯治[5]等。正畸臨床中口腔矯治器通過(guò)下頜前移，改善軟腭或者舌位置增加氣道口徑來(lái)減少氣道塌陷。我們通過(guò)建立慢性間歇性缺氧(CIH)小鼠模型，觀察模擬OSAS的CIH小鼠下頜骨骨量變化，旨在探討CIH對(duì)骨代謝的影響[6-7]。

1 材料與方法

1.1 材料

8周齡C57BL/6雄性小鼠12 只，體質(zhì)量20～25 g，由南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)由南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，倫理號(hào)：IACUC2106015。

慢性間歇性低氧小鼠模型建立的主要試劑和儀器：蘇木精-伊紅染色試劑盒(碧云天，上海)、全自動(dòng)脫水機(jī)(Leica，德國(guó))、石蠟包埋機(jī)(Leica，德國(guó))、石蠟切片機(jī)(Leica，德國(guó))、顯微鏡及圖像攝取(Leica，德國(guó))、micro CT(Skyscan1176，荷蘭)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備 將12只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分成對(duì)照(CON)組和慢性間歇性缺氧(CIH)組，每組各6 只。自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。將CIH組放置于低氧氧艙內(nèi)模擬間歇性低氧，計(jì)算機(jī)控制氧氣濃度，氧氣濃度在正常濃度與低濃度之間循環(huán)，每120 s循環(huán)一次，每一個(gè)循環(huán)內(nèi)，氧氣濃度由21%左右逐漸下降到5%左右，然后再恢復(fù)到21%左右。供氣瓶分為氧氣瓶和氮?dú)馄?，通過(guò)減壓閥經(jīng)CIH控制系統(tǒng)對(duì)氣體進(jìn)行充入和暫停。每天上午9:00開(kāi)始間歇性低氧刺激，每天刺激8 h。8 h以外常規(guī)飼養(yǎng)。常氧組箱內(nèi)氧氣濃度維持21%濃度不變[8]。飼養(yǎng)4 周后，麻醉后斷頸處死，取右側(cè)下頜骨進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 micro CT觀察小鼠下頜骨三維結(jié)構(gòu) 每組選擇6 只小鼠，麻醉后斷頸處死，取右側(cè)下頜骨，沖洗后置于多聚甲醛固定液固定24 h后，流水沖洗過(guò)夜，將樣本置于固定器內(nèi)以15.6 μm層厚進(jìn)行micro CT掃描，掃描參數(shù)55 kVp,83 μA。

使用Skyscan分析軟件進(jìn)行三維重建和數(shù)據(jù)分析。掃描后所得數(shù)據(jù)首先用Data Viewer軟件調(diào)整下頜骨位置，使所有下頜骨組織均為外側(cè)面朝前，內(nèi)側(cè)面朝后，咬合面朝上。再使用CT Vox軟件進(jìn)行圖像重建，設(shè)定感興趣區(qū)域(ROI)為小鼠第一磨牙牙槽間隔區(qū)域的松質(zhì)骨。最后用CTAN軟件對(duì)目標(biāo)ROI進(jìn)行三維重建，并對(duì)選定區(qū)域進(jìn)行骨骼分析。得到下頜骨感興趣區(qū)域內(nèi)松質(zhì)骨的各項(xiàng)骨結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)算，觀察指標(biāo)包括：骨骼體積/組織體積(bone volume/total volume, BV/TV),骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th),骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)，骨小梁間距(trabecular separation，Tb.Sp)[9]。

1.2.3 蘇木精-伊紅染色觀察脫鈣后小鼠下頜骨組織形態(tài) 取缺氧組和對(duì)照組各6只小鼠的下頜骨多聚甲醛固定，10%EDTA脫鈣1個(gè)月，常規(guī)脫水，石蠟包埋后，制作連續(xù)切片。石蠟切片脫蠟至水，蘇木精染色5 min，水洗，1%鹽酸乙醇消化1～2 s，流水沖洗，鏡下看細(xì)胞核是否著色，伊紅染色1 min，看著色程度，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察下頜骨組織變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析

納入小鼠共12 只，全部進(jìn)入結(jié)果分析，無(wú)死亡和感染。

2.2 間歇性缺氧小鼠下頜骨松質(zhì)骨顯微結(jié)構(gòu)變化

慢性間歇性缺氧4 周后，實(shí)驗(yàn)選取小鼠下頜骨第一磨牙牙槽間隔的松質(zhì)骨為感興趣區(qū)域，如圖1中黑色實(shí)線框所示，從三維重建的影像來(lái)比較慢性間歇性缺氧組和對(duì)照組形態(tài)差異，結(jié)果顯示缺氧組下頜骨發(fā)生骨質(zhì)破壞，下頜體、下頜支、下頜角骨質(zhì)較對(duì)照組有明顯的骨質(zhì)吸收。

圖1 對(duì)照組及CIH組小鼠下頜骨的三維重建圖像Fig.1 Three-dimensional reconstruction image of the mandible in the control group and CIH group

圖2顯示慢性間歇性低氧組較對(duì)照組，骨小梁體積變小，數(shù)量減少。通過(guò)對(duì)感興趣區(qū)域進(jìn)行三維重建，并對(duì)該區(qū)域進(jìn)行骨骼參數(shù)分析，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，CIH組下頜骨感興趣區(qū)域內(nèi)松質(zhì)骨骨骼體積/組織體積、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度及骨小梁均顯著性減少，骨小梁間距顯著性增加(P<0.05),見(jiàn)圖3。

圖2 對(duì)照組和CIH組下頜第一磨牙感興趣區(qū)域CT平掃圖像Fig.2 CT scanning image of the region of interest in the first molar of mandible bone in the control group and CIH group

2.3 兩組小鼠下頜骨松質(zhì)骨組織形態(tài)

蘇木精-伊紅染色顯示，慢性間歇性低氧組小鼠下頜第一磨牙根分叉區(qū)域的牙槽骨骨量下降，板層狀骨減少，形成不規(guī)則小梁骨，骨髓腔細(xì)胞排列紊亂。下頜骨松質(zhì)骨骨小梁數(shù)目減少，體積變小,見(jiàn)圖4。

***：P<0.05

3 討 論

下頜骨的生理結(jié)構(gòu)正畸牙移動(dòng)的基礎(chǔ)，牙齒在力的作用下，在下頜骨內(nèi)緩慢移動(dòng)。下頜松質(zhì)骨和骨小梁排列成軌道以及肌力軌道，骨小梁的粗細(xì)，數(shù)目以及排列與力學(xué)功能密切相關(guān)[10]。

OSAS是一種常見(jiàn)疾病，目前研究表明OSAS與骨代謝存在一定的關(guān)聯(lián)性[11]，青少年OSAS患者通常伴有骨發(fā)育異常、繼發(fā)性骨質(zhì)疏松[12]，而中老年OSAS患者多有骨質(zhì)疏松，增加了骨折的風(fēng)險(xiǎn)[13]。OSAS多見(jiàn)于老年患者中，但是也會(huì)影響年輕人群，尤其是一些患有腺樣體/扁桃體肥大的人群中，兒童肥胖的患病率越來(lái)越高，因此OSAS在年輕人中也越來(lái)越普遍。通過(guò)多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)，約45%的中重度肥胖青少年被診斷出OSAS[14]。青少年患者處于生長(zhǎng)發(fā)育高峰期，如果患有OSAS，睡眠質(zhì)量差，代謝紊亂，性腺功能減退，骨骼很容易受到影響，無(wú)法達(dá)到峰值骨骼質(zhì)量，加速了骨量損失，最終導(dǎo)致骨量低下。因此早期對(duì)這個(gè)問(wèn)題進(jìn)行糾正，有利于骨骼重建，糾正骨骼質(zhì)量、結(jié)構(gòu)、強(qiáng)度不足的問(wèn)題[15]。然而OSAS是否會(huì)影響下頜骨改建的研究報(bào)道甚少。

a：牙本質(zhì)；b：牙髓腔；c：牙周膜；d：牙槽骨；e：骨髓腔; 與對(duì)照組相比，CIH組小鼠下頜骨松質(zhì)骨骨小梁數(shù)目減少

本研究選擇8周齡雄性小鼠為研究對(duì)象，避免性別對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。機(jī)械應(yīng)力通過(guò)調(diào)控骨改建來(lái)影響骨小梁以及結(jié)構(gòu)，骨小梁的結(jié)構(gòu)、排列影響正畸[16]，因此選擇了生長(zhǎng)期小鼠的磨牙區(qū)進(jìn)行下頜骨骨微結(jié)構(gòu)分析。micro CT技術(shù)通過(guò)三維重建，能從骨的質(zhì)和量反應(yīng)骨小梁數(shù)量、結(jié)構(gòu)改變，尤其是松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)改變提供了精確完善的數(shù)據(jù)，被廣泛應(yīng)用于骨量和骨形態(tài)學(xué)的各項(xiàng)研究[17]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，慢性間歇性缺氧組下頜骨松質(zhì)骨骨量顯著下降，提示慢性間歇性缺氧組頜骨的強(qiáng)度受到了影響。對(duì)于OSAS患者，夜間反復(fù)缺氧，缺氧和骨代謝異常有一定的相關(guān)性。研究表明，缺氧能阻斷成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，并能刺激破骨細(xì)胞的生成，增強(qiáng)破骨細(xì)胞的活性，增加骨的重吸收[18]。缺氧時(shí)HIF-1α明顯上調(diào)，直接刺激增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，抑制間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成脂分化，并能阻止PTH在成熟骨骼中的骨代謝[19-21]。缺氧會(huì)在體內(nèi)形成一個(gè)酸性環(huán)境，這種環(huán)境能激活破骨細(xì)胞并且抑制成骨細(xì)胞的礦物質(zhì)沉積[18]。缺氧常伴隨著氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化和抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，與骨吸收和骨量低密切相關(guān)[22]。

由于OSAS患者常夜間覺(jué)醒，白天嗜睡，身體的生物節(jié)律被破壞，而成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞均有晝夜節(jié)律性，會(huì)受到晝夜節(jié)律的破壞和睡眠不足的影響[23]。

大多數(shù)文獻(xiàn)顯示OSAS患者的血清中，瘦素水平升高[24]，食欲素和褪黑素水平下降[25]。褪黑素能激活交感神經(jīng)，高水平的瘦素會(huì)產(chǎn)生低骨質(zhì)量表型，瘦素缺陷有高骨質(zhì)表型[26]。食欲素在OSAS患者低骨量中也發(fā)揮了作用，食欲素基因敲除小鼠的骨量明顯減少，骨形成速率低下，礦物質(zhì)沉積率下降，成骨細(xì)胞數(shù)量減少，破骨細(xì)胞數(shù)目不變，抑制骨形成[27]。褪黑素在睡眠和調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律方面也起著重要作用，在小鼠研究中，褪黑素能通過(guò)清除局部骨吸收產(chǎn)生的自由基破壞破骨細(xì)胞的功能，促進(jìn)MSC分化為成骨細(xì)胞[22]，而OSAS患者的晝夜節(jié)律被打破，褪黑素分泌受到干擾，有可能對(duì)骨骼產(chǎn)生負(fù)面影響[15]。

綜上所述，長(zhǎng)期慢性間歇性低氧將會(huì)導(dǎo)致小鼠骨松質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但是其具體引起下頜骨乃至全身骨骼結(jié)構(gòu)改變的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。