李燕燕，朱 珠，謝雯靜，徐子昂，張紫薇，張 瑋

由于外傷、炎癥、腫瘤等引起頜面部較大的骨缺損，臨床修復困難，從而給患者治療帶來不便[1]。目前有一些藥物用于這方面的治療，比如雙膦酸鹽、地諾單抗、降鈣素、激素類藥物。然而，它們會導致嚴重的不良反應，包括頜骨壞死、癌癥、血栓栓塞和中風[2]。尋求一種較為溫和的促進骨重塑，修復骨缺損的藥物迎合臨床需求。

骨重塑包括破骨細胞去除舊骨，成骨細胞形成新骨。這個過程是緊密耦合的，對于維持骨的強度和完整性至關重要。由于破骨細胞是唯一能夠進行骨吸收的細胞，治療骨疾病的藥物的開發(fā)主要集中在減少破骨細胞的分化、成熟和骨吸收機制，而很少有治療方法能真正增加骨形成。來自觀察性、實驗和臨床研究的證據(jù)表明，天然產(chǎn)生的化合物與骨骼健康指標的改善之間存在正聯(lián)系。這為促進骨重塑和解決臨床骨缺損引起的修復和治療問題提供了一個解決方案[3-4]。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是指具有自我更新能力并具有進行多向分化能力的基質(zhì)細胞，骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)是一種存在于骨髓中的多能間充質(zhì)干細胞。它們具有很強的增殖能力和多向分化潛能，長期以來被認為是組織工程應用的寶貴細胞來源[5]。人頜骨骨髓間充質(zhì)干細胞(human jaw bone marrow mesenchymal stem cells，hjBMSCs)也是其中一種。

續(xù)斷，是一種草本植物干燥的根，生長在中國潮濕的田野和山區(qū)。它在中國長期被用于治療骨疾病[6-7]。既往研究表明，續(xù)斷含有三萜皂苷[8]。川續(xù)斷皂苷Ⅵ(asperosaponinⅥ，ASAⅥ)是一種典型的來自續(xù)斷的生物活性三萜皂苷。它具有神經(jīng)保護、預防骨質(zhì)疏松等功能。但是其對hjBMSCs成骨分化的影響尚未見明確報道[9]。本文試圖進行探究ASAⅥ促進hjBMSCs成骨分化的合適濃度，同時驗證其促hjBMSCs成骨分化效應。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

川續(xù)斷皂苷Ⅵ(ASAⅥ)(純度>99%，中國藥品生物制品檢定所)，二甲基亞砜溶液(DMSO)(索萊寶，中國)，細胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)(蘇州新賽美公司，中國)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，4%青霉素和鏈霉素(碧云天，中國)，抗壞血酸磷酸酯、β-甘油磷酸酯、地塞米松和茜素紅(Sigma公司，美國)，胎牛血清(FBS)(Invigentech，美國)，RNAeasy動物RNA抽提試劑盒(離心柱式)(碧云天，中國)，Bradford蛋白濃度測定試劑盒(去垢劑兼容型)(碧云天，中國)，PVDF膜(Millipore，德國)，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(碧云天，中國)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PBS)(Gibco，美國)，osteocalcin抗體(Affinity，美國)，runt-related transcription factor 2抗體(Affinity，美國)，collagen-type Ⅰ抗體(Proteintech Group,美國)，CD34-PE、CD45-PE、CD90-PE、CD105-PE(Ebioscience，美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和成骨分化 經(jīng)患者同意后(倫理審批號：PJ2018-069-001)，2019年7—8月從江蘇省口腔醫(yī)院口腔頜面外科病房的多生牙拔除手術中取得約5 mm×5 mm×5 mm頜骨骨塊(患者年齡7～17歲)，無菌環(huán)境下剪成大小均勻的骨塊，用含4%青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液輕輕沖洗骨塊3次，均勻置于培養(yǎng)瓶中，含有10%FBS和1%青霉素和鏈霉素的高糖DMEM恰好沒過骨塊，靜置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱7 d，其間不換液，保持骨塊無劇烈晃動。待細胞孵出后棄骨繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換一次液，細胞融合度達80%以上時進行胰酶消化傳代，P2～P5代用于后續(xù)實驗[10]。

配制成骨培養(yǎng)基(1 mmol/L地塞米松、1 mol/L β-甘油磷酸和10 mmol/L L-抗壞血酸)用于后期誘導細胞成骨分化。

1.2.2 細胞鑒定 采用流式細胞儀分析來檢測細胞表面標記物。造血干細胞(hemopoietic stem cells，HSCs)的表面標記物有CD34、CD45，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的表面標記物有CD90、CD105[11]。

hjBMSCs第3代用于流式表型檢測。將長滿2個細胞培養(yǎng)皿中的細胞胰酶消化后分成5等份，分別放入含0、5 μL抗體(CD34-PE、CD45-PE、CD90-PE、CD105-PE)的100 μL PBS中，冰上避光孵育30 min。用PBS沖洗細胞，離心(1 000 r/min，5 min)3次。使用流式細胞儀定量細胞熒光，并使用FlowJo_v10.6.2軟件進行分析。對抗體陰性樣本進行自身熒光檢測。

1.2.3 細胞活力測定 第5代hjBMSCs接種在96孔板中，密度為3×103個細胞/孔。每孔含100 μL培養(yǎng)基，37 ℃孵育。24 h后，用不同濃度的ASAⅥ(0、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-8mol/L)處理細胞，每個濃度設置3個復孔，對照組用藥物配制液DMSO處理。培養(yǎng)1、3、5 d后分別終止培養(yǎng)，棄去舊培養(yǎng)液，以1∶10的比例將CCK-8試劑與完全培養(yǎng)基混合后孵育細胞，2 h后用分光光度計在450 nm處測定代表細胞活力的吸光度。

1.2.4 BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色 將細胞接種在12孔板中，細胞密度達80%時，用含0、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-8mol/L ASAⅥ的成骨誘導液培養(yǎng)細胞，每組設置3個復孔。每間隔2 d換一次液，誘導7 d后終止誘導，用多聚甲醛固定30 min,PBS洗滌后，用BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑染色，根據(jù)代表堿性磷酸酯酶含量的藍色深淺觀察ASAⅥ促進hjBMSCs成骨分化的情況。

1.2.5 茜素紅染色 將細胞接種在6孔板中，細胞密度達80%時，用含不同濃度的ASAⅥ的成骨誘導培養(yǎng)基誘導細胞，前4 d每2 d換一次液。此后只加液不換液。到第14天時，用多聚甲醛固定30 min。然后用PBS洗滌，每孔加入適量茜素紅溶液使其均勻覆蓋皿底，常溫孵育3 min。拍攝記錄代表細胞成骨分化程度的紅色深淺，顯微鏡下觀察細胞外基質(zhì)形成的鈣結(jié)節(jié)情況。

1.2.6 免疫印跡分析 用含有一定濃度ASAⅥ的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞7 d后，用RIPA裂解液在冰上裂解細胞，然后在12 000 r/min 4 ℃ 離心10 min。收集上清液，并使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒(去垢劑兼容型)測定蛋白質(zhì)濃度；50 μg蛋白質(zhì)煮沸10 min，冷卻后置于-20 ℃儲存。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE)分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在TBST緩沖液中用5%BSA封閉膜，在4 ℃下與一級抗體孵育過夜。在TBST中洗滌膜3次15 min，并在室溫下與二級抗體孵育45 min。用曝光機測定實驗帶的吸光度值與內(nèi)參GAPDH吸光度的關系。

1.2.7 實時熒光定量PCR檢測 采用實時熒光定量PCR檢測顯著的成骨分化相關標記基因，包括Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、骨鈣素(OCN)和Ⅰ型膠原(COL-Ⅰ)的表達水平。將細胞接種于6孔板，用以上篩選濃度的ASAⅥ培養(yǎng)細胞。在7 d后，使用RNAeasy動物RNA抽提試劑盒提取總RNA，對COL-Ⅰ、Runx2和OCN進行cDNA合成。β-actin作為內(nèi)參。使用比較閾值循環(huán)(ΔΔCT)方法分析目的基因的相對表達量，為了降低變異性，所有RT-PCR均重復進行3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad Prism 9統(tǒng)計軟件，細胞活力測定實驗采用方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett。實時熒光定量PCR實驗使用t檢驗。P<0.01為具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié) 果

2.1 hjBMSCs的鑒定

造血干細胞(HSCs)的表面標記物有CD34、CD45；間充質(zhì)干細胞(MSCs)的表面標記物有CD90、CD105。流式細胞儀定量細胞熒光鑒定顯示，抗體陰性樣本自身熒光及造血干細胞表面標記物CD34、CD45檢測陰性，而間充質(zhì)干細胞的表面標記物有CD90、CD105呈強陽性(圖1)，說明提取的細胞屬于頜骨骨髓非造血間充質(zhì)干細胞，可以用于后續(xù)實驗。

A：細胞自身熒光；B：加入CD34抗體的樣品；C：加入CD45抗體的樣品；D：加入CD90抗體的樣品；E：加入CD105抗體的樣品

2.2 ASAⅥ對hjBMSCs增殖的影響

上述方法中設置的濃度梯度的ASAⅥ培養(yǎng)細胞1、3和5 d后用CCK8測定，結(jié)果顯示1×10-4mol/L組明顯抑制細胞增殖，對細胞有一定的毒性(P<0.01)，而1×10-8～1×10-5mol/L ASAⅥ組則對細胞增殖均無明顯抑制(P>0.05)(圖2)。

2.3 ASAⅥ對hjBMSCs 堿性磷酸酯酶活性的影響

用含有0、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L ASAⅥ的誘導液培養(yǎng)細胞7 d，棄舊培養(yǎng)基后固定，采用BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑對其染色并觀察。肉眼觀察，與對照組相比，1×10-5、1×10-6、1×10-8mol/L ASAⅥ組藍色標記的堿性磷酸酯酶染色更深， 說明其對應的堿性磷酸酯酶活性更強，而堿性磷酸酯酶含量的高低能代表成骨分化的水平[12]。1×10-5、1×10-6mol/L染色比1×10-8mol/L更深，意味著其誘導成骨分化能力更強(圖3)。鏡下觀察細胞著色情況與肉眼觀察一致(圖4)。

*：P<0.01

圖3 BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色Fig.3 BCIP/NBT alkaline phosphatase staining

A：對照；B：1×10-4 mol/L；C:1×10-5 mol/L；D：1×10-6 mol/L；E：1×10-7 mol/L；F：1×10-8 mol/L

2.4 ASAⅥ對hjBMSCs細胞外基質(zhì)礦化的影響

采用茜素紅染色法檢測1×10-5、1×10-6mol/L ASAⅥ誘導hjBMSCs后細胞外鈣結(jié)節(jié)沉積情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，1×10-5、1×10-6mol/L組中紅色標記的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量顯著增加(圖5)。

A：對照；B：1×10-5 mol/L；C：1×10-6 mol/L

2.5 ASAⅥ對hjBMSCs成骨影響的蛋白水平檢測

用免疫印跡分析對照組、1×10-5、1×10-6mol/L組中成骨相關的蛋白表達水平(圖6)。對比GAPDH的吸光度，1×10-5、1×10-6mol/L組中的Runx2、OCN和COL-Ⅰ的表達均高于對照組(圖7)，其中OCN和COL-Ⅰ表達的升高有顯著性差異。

圖6 免疫印跡分析成骨相關蛋白的表達Fig.6 Western blot analysis of the expression of osteogenesis-related proteins

2.6 ASAⅥ對hjBMSCs成骨影響的mRNA水平檢測

*:P<0.01

用實時定量PCR檢測對照組、1×10-5、1×10-6mol/L組成骨相關指標的mRNA水平的表達。1×10-5、1×10-6mol/L組的Runx2、OCN和COL-Ⅰ的表達均高于對照組(P<0.05)(圖8)，且1×10-5mol/L組略顯優(yōu)勢。

*:P<0.01

3 討 論

傳統(tǒng)中藥ASAⅥ具有改善免疫，促進骨損傷愈合、抗菌、抗炎等作用[13]。研究顯示，ASAⅥ既可以通過抑制破骨細胞的形成，也可促進成骨細胞分化，提高成骨細胞的活性和數(shù)量，促進基質(zhì)鈣化、骨痂生長，從而防止骨質(zhì)疏松、促進骨折的愈合[14-15]。但是其對hjBMSC的作用及具體影響機制未見明確報道。

MSCs是再生醫(yī)學中細胞治療的重要來源。在動物模型和人體臨床試驗中，MSCs 在修復各種退行性疾病中的受損組織方面顯示出優(yōu)勢[16-18]。MSCs在組織修復中的一個關鍵機制是它們定向分化為受損組織[19]。hjBMSCs是存在于人頜骨骨髓中的非造血間充質(zhì)干細胞，具有成骨等多向分化的潛能，且取材來源較廣，易于培養(yǎng)[20]。研究證實，將hjBMSCs定向分化為受損骨組織的成分對于骨損傷愈合至關重要[21-22]。

本研究中，設置不同濃度組的ASAⅥ對hjBMSCs進行誘導，期望篩選出在不影響細胞增殖的前提下又能定向誘導其成骨分化的濃度，篩選的同時也驗證了ASAⅥ能使hjBMSCs定向成骨分化。

堿性磷酸酶(ALP)在礦化組織的細胞中高度表達，并在硬組織的形成中起關鍵作用，其含量的高低能代表成骨分化的水平[23]。BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色是其含量的檢測方式之一[24]。在檢測ASAⅥ對hjBMSCs增殖的影響時，只篩選了有無毒性的濃度，并未直接以增殖活性作為唯一標準排除濃度組。而是同時結(jié)合代表成骨分化的BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色再次對幾個濃度進行篩選。我們發(fā)現(xiàn)了高濃度的ASAⅥ(1×10-4mol/L)對hjBMSCs有明顯的抑制增殖及分化的毒性作用。而低濃度的ASAⅥ對細胞增殖無毒性，且其增強了hjBMSCs的堿性磷酸酯酶的表達，促進成骨分化。其中效果最為明顯的濃度組是1×10-5、1×10-6mol/L。

為進一步驗證1×10-5、1×10-6mol/L濃度組的ASAⅥ促進hjBMSCs成骨分化，茜素紅染色(ARS)被用于實驗。ARS試劑能夠與鈣融合產(chǎn)生一種紅色復合物，可用于識別ASAⅥ誘導hjBMSCs成骨分化產(chǎn)生的礦化結(jié)節(jié)。顏色深淺代表礦化程度的高低。結(jié)果顯示，與對照組相比，1×10-5、1×10-6mol/L濃度組的鈣結(jié)節(jié)明顯增多，成骨分化水平明顯升高。

骨形成是一個高度受限的過程。Runx2是骨祖細胞增殖所必需的，被認為是最早確定成骨細胞譜系的轉(zhuǎn)錄因子[25]。OCN被認為與成熟的成骨細胞活性有關，因此被視為晚期成骨細胞發(fā)生的標志物[26]。COL-Ⅰ刺激成骨細胞的鈣鹽和磷在新形成的類骨質(zhì)中沉淀，以形成骨礦物質(zhì)或羥基磷灰石[27]。在我們的研究中，1×10-5、1×10-6mol/L的ASAⅥ誘導hjBMSCs一段時間后，發(fā)現(xiàn)代表成骨分化的幾個指標在蛋白水平均明顯高于對照組。這再次說明，一定濃度的ASAⅥ能夠讓hjBMSCs定向成骨分化。

結(jié)合以上結(jié)果，用RT-PCR檢測1×10-5、1×10-6mol/L的ASAⅥ誘導hjBMSCs后，代表成骨分化的幾個指標在mRNA水平的變化。與前面的結(jié)果一致，與對照組相比，1×10-5、1×10-6mol/L ASAⅥ組的Runx2、OCN、COL-Ⅰ在RNA水平也明顯上升。

綜上所述，1×10-5、1×10-6mol/L的中藥川續(xù)斷皂苷Ⅵ均能較好誘導人頜骨骨髓間充質(zhì)干細胞定向成骨分化，其具體機制有待進一步檢測。