姚樟燠，劉方舟

[南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(江蘇省腫瘤醫(yī)院) 頭頸外科，江蘇 南京 210009]

1 線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)

線粒體是細(xì)菌大小的細(xì)胞器，存在于所有有核細(xì)胞中，是細(xì)胞內(nèi)ATP的主要生成者[1- 2]。mtDNA是一個(gè)多拷貝的16 569 bp的環(huán)狀雙鏈DNA分子，包含37個(gè)基因，其中13個(gè)基因編碼13個(gè)呼吸酶復(fù)合體的多肽， 24個(gè)基因編碼22個(gè)轉(zhuǎn)移RNA和2個(gè)作用于蛋白質(zhì)的核糖體RNA(12 s和16 s)。大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞每個(gè)細(xì)胞含有數(shù)百到數(shù)千個(gè)線粒體，每個(gè)線粒體有2～10個(gè)mtDNA拷貝[3]。與核基因組相比，mtDNA有其獨(dú)特的生物學(xué)環(huán)境和特性:(1) mtDNA是裸露的，缺乏組蛋白的保護(hù)，致癌物容易與其結(jié)合；(2) 線粒體內(nèi)脂肪/DNA值高，使親脂性的致癌物優(yōu)先在占細(xì)胞總DNA量很少的mtDNA上聚集；(3) mtDNA在整個(gè)細(xì)胞周期中都處于不斷合成狀態(tài)，易受外界干擾，穩(wěn)定性差；(4) 線粒體內(nèi)氧的濃度高，易產(chǎn)生氧自由基及過(guò)氧化氫等物質(zhì)，它本身又不能合成谷胱甘肽將其有效清除，故mtDNA易受氧化損傷；(5) mtDNA多聚酶Y的校對(duì)功能差，RNA基因部位易形成發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致復(fù)制錯(cuò)配頻率高；(6) 缺乏有效的基因修復(fù)系統(tǒng)，突變mtDNA可在細(xì)胞內(nèi)不停地復(fù)制和傳播，從而產(chǎn)生數(shù)量驚人的重復(fù)拷貝[4- 5]。所以mtDNA的突變頻率遠(yuǎn)高于核DNA，并且特別容易受到氧化應(yīng)激的影響。

2 mtDNA突變與腫瘤關(guān)系

線粒體廣泛參與細(xì)胞活動(dòng)，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、氧化應(yīng)激和凋亡[6]。1998年，Polyak等[7]做了一個(gè)里程碑式的報(bào)道，即在人類大腸腫瘤中存在體細(xì)胞mtDNA點(diǎn)突變，而在同一個(gè)體的健康組織中則不存在。從此，越來(lái)越多的研究描述了mtDNA突變?cè)谄渌麕追N人類癌癥中的高發(fā)生率，包括實(shí)體瘤和白血病[8- 12]。

D- 環(huán)區(qū)是線粒體DNA的非編碼區(qū)。大多數(shù)與線粒體DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的調(diào)控序列都位于該區(qū)域，該區(qū)域容易發(fā)生突變。Wang等[13]通過(guò)基因測(cè)序研究喉癌mtDNA D- loop基因突變與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)喉癌患者mtDNA的D環(huán)區(qū)域存在大量突變和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，表明mtDNA中的D環(huán)基因突變可能在喉癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。微衛(wèi)星是人類基因組中的短串聯(lián)重復(fù)序列，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是指由于與正常組織相比重復(fù)單元的插入或缺失，導(dǎo)致微衛(wèi)星長(zhǎng)度的變化和腫瘤中新微衛(wèi)星等位基因的出現(xiàn)。Habano等[14]在直腸癌研究中首次提出線粒體微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。Wang等[13]通過(guò)對(duì)喉癌病例的研究發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性主要集中在D310區(qū)域，表現(xiàn)為poly- C插入增加。在這些情況下，有9個(gè)顯示插入了一個(gè)堿基C，有6個(gè)顯示插入了兩個(gè)堿基，在插入兩個(gè)堿基情況下發(fā)現(xiàn)了微衛(wèi)星內(nèi)的堿基交換。這與Sanchez- Cespedes等[15]的研究一致，即41%的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌在D環(huán)區(qū)域發(fā)生突變。D310區(qū)域的HV可能與其在基因的內(nèi)含子、編碼子和啟動(dòng)子中的位置以及復(fù)制過(guò)程中滑動(dòng)錯(cuò)誤引起的重復(fù)修復(fù)有關(guān)。因此，mtDNA突變的分析，特別是D310區(qū)域變化的檢測(cè)，可能在細(xì)胞學(xué)診斷中發(fā)揮重要作用，特別是對(duì)于沒(méi)有明顯形態(tài)變化或罕見(jiàn)腫瘤細(xì)胞的病例。

mtDNA D- loop有一個(gè)特異的突變熱點(diǎn)區(qū)域，突變程度與胃腸道腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。胃腸道腫瘤中mtDNA D- loop突變主要為同質(zhì)突變，常在嘧啶位點(diǎn)發(fā)生突變。線粒體微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，包括多胞苷延伸的形成，在胃腸道腫瘤中很常見(jiàn)。Wang等[16]證實(shí)了中國(guó)人胃腸道腫瘤中mtDNA D- loop突變的發(fā)生，并支持這些突變與腫瘤進(jìn)展的相關(guān)性，他們發(fā)現(xiàn)過(guò)度激活的DNA修復(fù)功能可能修復(fù)胃腸道腫瘤mtDNA損傷，并且與腫瘤的進(jìn)展表出現(xiàn)出一定的相關(guān)性。

Yu 等[17]利用高通量測(cè)序策略和建立R0細(xì)胞系，在肝癌患者中檢測(cè)到了新的mtDNA突變，并初步證明線粒體功能障礙可能影響肝癌細(xì)胞的增殖和化療耐藥。他們還建立了R0細(xì)胞，并鑒定出4個(gè)體細(xì)胞非同義突變(T6115C，65.74%；G8387A，12.23%；G13121A，93.08%；T14180C，28.22%)可以導(dǎo)致氨基酸替換，tRNA突變可以引起氨基酸替換。通過(guò)采用R0細(xì)胞構(gòu)建這些突變雜交體，可以幫助理解這些突變?cè)诟伟┻M(jìn)展中的作用。乳腺癌是女性的主要癌癥之一，其復(fù)雜性和高度異質(zhì)性的遺傳背景是環(huán)境因素與核基因組和線粒體DNA突變相互作用的結(jié)果。線粒體基因組功能與轉(zhuǎn)化過(guò)程相關(guān)，腫瘤細(xì)胞可以逃避不同的調(diào)控機(jī)制，但不能逃避能量流動(dòng)機(jī)制。因此，癌細(xì)胞可以獲得功能性mtDNA突變，作為在適應(yīng)致癌條件期間調(diào)節(jié)能量代謝的一種策略[18]。為了評(píng)估乳腺腫瘤的體細(xì)胞突變格局，并確定mtDNA突變負(fù)擔(dān)是否與乳腺癌的OS相關(guān)，Pérez- Amado等[19]對(duì)92例墨西哥婦女的外周血液腫瘤樣本進(jìn)行了全mtDNA測(cè)序。他們發(fā)現(xiàn)24例(26.1%)腺腫瘤的體細(xì)胞突變?yōu)殛幮裕?8例(73.9%)為陽(yáng)性，其中78%以上為異質(zhì)性突變。對(duì)乳腺癌和不同類型腫瘤的研究報(bào)告了攜帶mtDNA突變的腫瘤的不同比例(分別為73.7%和45.7%)，由此證明了高頻率的異質(zhì)性mtDNA突變和編碼突變(主要是非同義突變)，以及D- 環(huán)區(qū)和tRNA基因的高突變率。

編碼mtDNA突變可以改變蛋白質(zhì)功能和氧化磷酸化(OXPHOS)系統(tǒng)，而非編碼突變可能影響mtDNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和結(jié)構(gòu)mtDNA組織等基本生物學(xué)過(guò)程，從而為腫瘤細(xì)胞的增殖提供有利條件[20]。Wallace 等[21]認(rèn)為，在致癌過(guò)程中產(chǎn)生的有害致病突變，當(dāng)造成蛋白質(zhì)功能和細(xì)胞活力受損時(shí)被消除，但如果它們能促進(jìn)細(xì)胞增殖，則被保留下來(lái)。

已報(bào)道的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤mtDNA突變的發(fā)生率也是由其不同的類型決定的。Mohamed yusoff等[22]研究表明，HVⅡ片段是一個(gè)頻繁突變的區(qū)域，其中11個(gè)突變中有9個(gè)主要發(fā)生在D310序列的保守序列塊Ⅱ，一個(gè)位于303到315個(gè)核苷酸之間的多胞嘧啶單核苷酸重復(fù)區(qū)域。D310序列的改變，無(wú)論是堿基缺失還是插入，是在各種人類癌癥中發(fā)現(xiàn)的最常見(jiàn)的mtDNA改變，包括腦腫瘤。D310序列是mtDNA復(fù)制的重要元件，因?yàn)樗琀鏈復(fù)制起始點(diǎn)。因此，D310序列的突變可能通過(guò)損害線粒體DNA聚合酶γ和其他反式作用因子的結(jié)合來(lái)影響線粒體DNA復(fù)制的速度。

體細(xì)胞mtDNA突變引起的OXPHOS缺陷在人的大腸上皮細(xì)胞中隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，Smith等[23]發(fā)現(xiàn)OXPHOS功能障礙引起的新陳代謝改變是通過(guò)SSP(序列特異性引物)實(shí)現(xiàn)的，這種改變?yōu)槟[瘤的生長(zhǎng)提供了一個(gè)有利的存活環(huán)境。但是mtDNA突變并非腫瘤形成的必要條件，只有線粒體在很重要的功能位點(diǎn)發(fā)生突變，并且在一個(gè)異質(zhì)性足夠高的水平，這種水平能導(dǎo)致OXPHOS缺陷并能導(dǎo)致有利的新陳代謝改變，才能加速腫瘤的生長(zhǎng)。他們認(rèn)為年齡相關(guān)的線粒體OXPHOS缺陷可以通過(guò)上調(diào)絲氨酸生物合成途徑加速腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。代謝途徑是治療干預(yù)的有吸引力的目標(biāo)，并且在具有OXPHOS缺陷的腸腫瘤中對(duì)SSP的固有依賴可能使它們選擇性地容易受到SSP抑制，值得進(jìn)行研究。

3 mtDNA拷貝數(shù)改變與腫瘤關(guān)系

mtDNA拷貝數(shù)在不同組織間差異很大[24]，但在正常細(xì)胞中保持相對(duì)穩(wěn)定[25]。mtDNA拷貝數(shù)的異?？赡軙?huì)導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，這取決于多種機(jī)制，包括活性氧的產(chǎn)生增加、氧化磷酸化減少、生存蛋白的表達(dá)增加以及對(duì)凋亡的抵抗[26]。研究人員已經(jīng)證明，mtDNA拷貝數(shù)異常與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)，如肺癌、甲狀腺乳頭狀癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌、胃癌和卵巢癌等。此外，流行病學(xué)研究還探討了外周血中mtDNA拷貝數(shù)的意義，它可以作為預(yù)測(cè)癌癥風(fēng)險(xiǎn)的潛在生物標(biāo)志物。然而，在不同的癌癥中結(jié)果是不確定的。例如，較高的mtDNA拷貝數(shù)與患腎細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[27]，但較低的mtDNA拷貝數(shù)增加了子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)[28]。外周血中mtDNA拷貝數(shù)的增加可能是氧化應(yīng)激和ROS介導(dǎo)的DNA損傷增加的標(biāo)志，mtDNA拷貝數(shù)的增加可能補(bǔ)償mtDNA的損傷或功能障礙。同時(shí)，線粒體增加所產(chǎn)生的ROS可能會(huì)對(duì)某些細(xì)胞內(nèi)成分造成更多的氧化損傷，進(jìn)而造成腫瘤的形成與進(jìn)展[29]。到目前為止，已經(jīng)有多項(xiàng)研究討論了mtDNA拷貝數(shù)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，但現(xiàn)有的結(jié)果并不一致。例如，Lin等[30]報(bào)道HNSCC患者的mtDNA拷貝數(shù)明顯更高；但He等[31]報(bào)道，與正常組織相比腫瘤組織中mtDNA拷貝數(shù)減少。Wang等[32]發(fā)現(xiàn)了mtDNA拷貝數(shù)和HNSCC風(fēng)險(xiǎn)之間的U型關(guān)系，一項(xiàng)嵌套病例對(duì)照研究也類似地報(bào)道了這一關(guān)系，該研究顯示，mtDNA拷貝數(shù)的最低和最高四分位數(shù)與HNSCC風(fēng)險(xiǎn)的增加顯著相關(guān)。因此，mtDNA拷貝數(shù)與某些癌癥風(fēng)險(xiǎn)之間的真正關(guān)聯(lián)可能不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。他們發(fā)現(xiàn)mtDNA拷貝數(shù)極低和極高均與HNSCC的風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)，提示線粒體DNA拷貝數(shù)與HNSCC風(fēng)險(xiǎn)之間存在U型關(guān)系，為理解mtDNA在HNSCC發(fā)病機(jī)制中的意義提供了新的視角。

酪氨酸激酶受體(TKR)ERBB2基因拷貝數(shù)增加導(dǎo)致癌基因產(chǎn)物過(guò)度表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，并伴有線粒體功能障礙，這在不同的侵襲性腫瘤中都有報(bào)道。雖然ERBB2的擴(kuò)增在不同的研究中都有報(bào)道，但mtDNA含量的變化與ERBB2基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系卻知之甚少。Ebrahimi等[33]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了70例霍梅尼伊瑪目醫(yī)院收治的乳腺癌患者腫瘤組織中mtDNA的相對(duì)含量，結(jié)果顯示，ERBB2擴(kuò)增的標(biāo)本mtDNA含量明顯降低。表明ERBB2有可能通過(guò)控制mtDNA含量來(lái)調(diào)節(jié)線粒體的活性。研究表明ERBB2和線粒體之間存在串?dāng)_。抑制凋亡被認(rèn)為是HER- 2促進(jìn)細(xì)胞存活的初步功能。ERBB2通過(guò)將癌細(xì)胞的氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒跆墙徒庾鳛槟芰縼?lái)源，對(duì)線粒體的呼吸功能起到調(diào)節(jié)作用。此外，研究表明ERBB2通過(guò)移位到線粒體并調(diào)節(jié)線粒體呼吸功能而導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體功能障礙。

mtDNA拷貝數(shù)的調(diào)控是一個(gè)受多種因素控制的復(fù)雜過(guò)程。研究表明，細(xì)胞核和線粒體基因組上的不同位點(diǎn)負(fù)責(zé)維持mtDNA含量。此外，已經(jīng)證明mtDNA的含量受到許多信號(hào)通路激活的影響。已證明通過(guò)ERBB2擴(kuò)增或者過(guò)表達(dá)激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)對(duì)線粒體功能有影響。ERBB2還通過(guò)激活特定的HER- 2相關(guān)信號(hào)通路來(lái)控制線粒體功能，促進(jìn)癌細(xì)胞存活和增殖[34]。他們發(fā)現(xiàn)ERBB2基因的擴(kuò)增與mtDNA含量的降低相關(guān)。由于ERBB2及其下游信號(hào)通路的激活都參與了線粒體生物能量學(xué)機(jī)制和程序性細(xì)胞死亡，因此他們提出了這樣的想法，即ERBB2可能通過(guò)改變mtDNA含量來(lái)調(diào)節(jié)線粒體的功能，從而介導(dǎo)其作用。

Sun等[35]測(cè)定了591例宮頸癌患者和373例正常對(duì)照宮頸脫落細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)的相對(duì)含量，他們發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者的mtDNA拷貝數(shù)中位數(shù)明顯高于對(duì)照組。在調(diào)整了年齡和HPV類型后，mtDNA拷貝數(shù)水平較高仍然與患宮頸癌的幾率增加有關(guān)，并且mtDNA拷貝數(shù)對(duì)宮頸癌存在劑量反應(yīng)效應(yīng)。結(jié)果表明，mtDNA拷貝數(shù)的改變可能與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)，并可能成為HPV陽(yáng)性婦女分診的潛在生物標(biāo)志物。高危HPV感染可能通過(guò)加速ROS的產(chǎn)生而導(dǎo)致一系列線粒體功能障礙。mtDNA拷貝數(shù)和ROS在宮頸癌發(fā)生過(guò)程中均升高。雖然HPV感染通常不會(huì)引起炎癥反應(yīng)，但病毒致癌基因可以誘導(dǎo)慢性ROS反應(yīng)。體外研究表明，HPV16 E6蛋白的表達(dá)增加了宮頸癌細(xì)胞中的ROS水平。HPV16 E6和E7蛋白也可以通過(guò)激活NOX2氧化酶引起ROS反應(yīng)。此外，HPV18E2蛋白已被證明定位于線粒體膜并增加線粒體ROS的產(chǎn)生而不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而低風(fēng)險(xiǎn)的HPV6E2與線粒體的相互作用非常低。ROS的增加被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致mtDNA損傷并啟動(dòng)mtDNA復(fù)制，以抵消受損線粒體的功能缺陷。另一種可能性是D- 環(huán)區(qū)中的特定遺傳事件可能導(dǎo)致mtDNA復(fù)制的上調(diào)。由于正常線粒體在能量產(chǎn)生、代謝和細(xì)胞凋亡中起重要作用，mtDNA改變的積累可能在宮頸癌的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[36]。

4 展 望

線粒體是真核生物中僅有的細(xì)胞核外含有DNA的細(xì)胞器，是OXPHOS產(chǎn)生ROS的主要部位，為細(xì)胞活動(dòng)提供必要的能量和氧自由基。當(dāng)mtDNA發(fā)生突變時(shí)，細(xì)胞能量供應(yīng)功能紊亂，產(chǎn)生大量的ROS。這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能的改變甚至壞死，從而表現(xiàn)出各種臨床癥狀。線粒體功能障礙可能在腫瘤發(fā)生、早期診斷、耐藥、預(yù)防復(fù)發(fā)和預(yù)后等方面發(fā)揮重要作用。線粒體作為機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器，參與了能量產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡、腫瘤的發(fā)生以及衰老等多種病理生理的代謝過(guò)程。有關(guān)mtDNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用研究剛剛起步，目前的研究已經(jīng)能夠闡明一些相關(guān)的機(jī)制：mtDNA突變可能是誘導(dǎo)核基因突變的內(nèi)源性因素之一，對(duì)腫瘤的發(fā)生可能有促進(jìn)作用。但不同部位的實(shí)體瘤中mtDNA 的突變和不穩(wěn)定性不是很一致，對(duì)于他們的整體研究還不是很成熟，mtDNA在線粒體間、細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的調(diào)控機(jī)制，它們的遺傳背景和環(huán)境，mtDNA 突變與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系等，仍然需要進(jìn)行深入的研究?？傊?，線粒體基因結(jié)構(gòu)損傷與腫瘤是一個(gè)有潛力的研究領(lǐng)域，將吸引越來(lái)越多的科研工作者來(lái)開(kāi)辟生命科學(xué)的下一個(gè)研究熱點(diǎn)。