陳詩韻，蘇丹萍，蔡奕全，袁 萍，顏戊利，賀錦燦

(廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510310)

隨著食品安全事件頻發(fā)，研究者們愈加重視發(fā)展低成本、高靈敏、易操作的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)[1]。傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測(cè)包括細(xì)菌培養(yǎng)[2]、PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))及其衍生技術(shù)[3-4]、酶免疫檢測(cè)技術(shù)[5]等，這些方法具有一定的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、操作繁瑣[6]等缺點(diǎn)。金屬有機(jī)骨架(Metal-Organic Frameworks，MOFs)是由有機(jī)配體和金屬離子通過自組裝合成的一類新型有機(jī)-無機(jī)雜化多孔材料[7],具有比表面積大，吸附性能強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在分離、傳感領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用。核酸適配體(Aptamer)是一段包含15～40個(gè)堿基寡核苷酸的片段，能特異性識(shí)別并且結(jié)合特定的靶分子[8]。本文以一鍋法合成Fe/Cu雙金屬M(fèi)OFs(Fe/Cu-MOFs)，并以其作為熒光猝滅平臺(tái)，熒光素FAM標(biāo)記的核酸適配體為探針，建立一種快速檢測(cè)食源性致病菌新的檢測(cè)方法，并運(yùn)用于實(shí)際樣品中食源性致病菌的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、副溶血性弧菌(ATCC17802)、沙門氏菌(ATCC14028)、單核增生李斯特菌(ATCC19115)、大腸桿菌(ATCC25922)購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；三氯化鐵、一水乙酸銅、均苯三甲酸購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；FAM標(biāo)記單增李斯特菌適配體(序列5’-AAAATACCAGCTTATTCAATTCCAAAAGCGCACCCATA TATGTTCTATGTCCCCCACCTCGAGATTGCACTTACTATCT-3’[9])、FAM標(biāo)記副溶血性弧菌適配體(序列5’-TCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACTAAA-3’[10])購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；VM-03RU迷你渦旋混勻器，蘇州捷美電子有限公司；F-7000熒光分光光度計(jì)，日本日立公司；DF-101S磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；H3-18K 臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；S-4800 SEM掃描電鏡儀，日本日立公司；Rigaku智能多功能X射線衍射儀 Smartlab，日本Rigaku 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Fe/Cu-MOFs的合成

先配制鐵-銅(1:4)雙金屬溶液(20 mmol/L)：取100 mL六水三氯化鐵溶液(4 mmol/L)和100 mL一水乙酸銅溶液 (16 mmol/L)混合，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杌靹? min。取均苯三甲酸(20 mmol，100 mL)于三頸燒瓶中，再取100 mL鐵-銅雙金屬溶液，緩慢注入，于磁力攪拌器中攪拌反應(yīng)30 min，所得材料分裝于15 mL離心管(10 mL/只)，于離心機(jī)中離心(6000 rd，10 min)，同時(shí)用乙醇水洗滌并離心2次，得到Fe/Cu-MOFs，最后倒去液體，留下固體材料。將離心管置于冰箱冷凍層冷凍12 h 后，再轉(zhuǎn)移至凍干機(jī)凍干24 h，得到Fe/Cu-MOFs凍干粉。

1.3.2 細(xì)菌培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)中，用接種環(huán)取一環(huán)副溶血性弧菌、單增李斯特菌懸液分別接種于TCBS斜面和TSAYE斜面，并恒溫培養(yǎng)24 h。

1.3.3 分析方法

副溶血性弧菌：依次加入400 μL 20 nmol/L的FAM標(biāo)記的副溶血性弧菌Apt溶液以及120 μL濃度為3 mg/mL的Fe/Cu-MOFs溶液，置于渦旋器中渦旋混勻，嚴(yán)格避光，待核酸適配體上的熒光素?zé)晒忖?0 min。最后加入100 μL副溶血性弧菌菌液。

單增李斯特菌：依次加入400 μL 20 nmol/L的FAM標(biāo)記的單增李斯特菌Apt溶液以及80 μL濃度為0.83 mg/mL的Fe/Cu-MOFs溶液，置于渦旋器中渦旋混勻，嚴(yán)格避光，待核酸適配體上的熒光素?zé)晒忖?0 min。最后加入100 μL單增李斯特菌菌液。

避光孵育30 min。實(shí)驗(yàn)平行三次，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。在F-7000型熒光分光光度計(jì)上以λex=494 nm的模式同步掃描得到熒光發(fā)射圖譜，分別記錄空白組和標(biāo)準(zhǔn)組在λ=517 nm處的熒光值F，計(jì)算ΔF=F-F0。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析原理

本方法的分析原理如圖1所示，當(dāng)FAM標(biāo)記的核酸適配體與Fe/Cu-MOFs混合后，核酸適配體被吸附到材料表面，本身所攜帶的熒光被猝滅。加入目標(biāo)細(xì)菌時(shí)，核酸適配體與細(xì)菌特異性結(jié)合，脫離金屬材料表面，熒光達(dá)到一定程度的恢復(fù)。在一定的范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度的恢復(fù)值與加入的菌液量成正比。

圖1 本方法的分析原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the proposed method

2.2 Fe/Cu-MOFs的表征

采用掃描電鏡(SEM)對(duì)Fe/Cu-MOFs的外觀形貌的尺寸進(jìn)行表征分析。如圖2可知，F(xiàn)e/Cu-MOFs呈現(xiàn)長(zhǎng)條棒狀晶體形貌，棱角分明，晶體長(zhǎng)度約為800 nm，寬度約為150 nm，高為50 nm。如圖3可知，F(xiàn)e/Cu-MOFs在18°[11]、26°[12]的具有MOFs的特征衍射峰，且峰形尖銳，說明合成的金屬有機(jī)骨架的結(jié)晶度較好。

圖2 Fe/Cu-MOFs的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy of Fe/Cu-MOFs

圖3 Fe/Cu-MOFs的XRD圖譜Fig.3 XRD spectrum of Fe/Cu-MOFs

2.3 分析條件的考察

以革蘭氏陽性菌—單增李斯特菌和革蘭氏陰性菌—副溶血性弧菌為例，考察 Fe/Cu-MOFs的用量、猝滅時(shí)間和恢復(fù)時(shí)間對(duì)熒光恢復(fù)值的影響。通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，最佳分析條件于表1所示。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以表1作為實(shí)驗(yàn)條件。

表1 分析條件考察結(jié)果Table 1 The results of analysis conditions

2.4 線性范圍及檢出限

革蘭氏陽性菌單增李斯特菌，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，設(shè)置空白組及標(biāo)準(zhǔn)組，每組實(shí)驗(yàn)平行三次。結(jié)果如圖4所示，單增李斯特菌在9.69×106～1.94×109CFU/mL濃度范圍內(nèi)時(shí)，熒光恢復(fù)強(qiáng)度(ΔF)與濃度對(duì)數(shù)(lgc，CFU/mL)呈線性相關(guān)(ΔF=65.763lgc-449.28，R2=0.9851，r=0.9925)，檢出限為1.00×106CFU/mL。

圖4 單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Linear curve of fluorescence recovery value and concentration of Listeria monocytogenes

革蘭氏陰性菌副溶血性弧菌，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，設(shè)置空白組及標(biāo)準(zhǔn)組，每組實(shí)驗(yàn)平行三次。結(jié)果如圖5所示，副溶血性弧菌在4.12×104～8.23×106CFU/mL濃度范圍內(nèi)時(shí)，熒光恢復(fù)強(qiáng)度(ΔF)與濃度對(duì)數(shù)(lgc，CFU/mL)呈線性相關(guān)(ΔF=98.479lgc-417.14，R2=0.9905，r=0.9952)，檢出限為1.00×104CFU/mL。

圖5 副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Linear curve of fluorescence recovery value and concentration of Vibrio parahaemolyticus

該結(jié)果表明，本方法既適用于革蘭氏陽性菌的分析，也適用于革蘭氏陰性菌的分析，具有一定的普適性。

2.5 選擇性實(shí)驗(yàn)

在單增李斯特菌實(shí)驗(yàn)中選用細(xì)菌濃度為單增李斯特菌的10倍以上的四種菌(副溶血性弧菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌)，副溶血性弧菌實(shí)驗(yàn)中選用細(xì)菌濃度為副溶血性弧菌的10倍以上的四種菌(單增李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌)，分別考察這四種菌加入后，對(duì)FAM標(biāo)記的副溶血性弧菌Apt及單增李斯特菌適配體的熒光恢復(fù)情況，并且與加入副溶血性弧菌、單增李斯特菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果作對(duì)比。

單增李斯特菌實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果：即使加入其他菌，因?yàn)樵摼鷮?duì)單增李斯特菌適配體沒有特異性，在該菌細(xì)菌濃度為副溶血性弧菌的10倍以上的情況下，其對(duì)熒光恢復(fù)信號(hào)的響應(yīng)程度遠(yuǎn)不如單增李斯特菌菌作用的十分之一或者更低。副溶血性弧菌實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果：即使加入其他菌，因?yàn)樵摼鷮?duì)FAM標(biāo)記的副溶血性弧菌Apt沒有特異性，在該菌細(xì)菌濃度為副溶血性弧菌的10倍以上的情況下，其對(duì)熒光恢復(fù)的程度遠(yuǎn)不如副溶血性弧菌作用的十分之一或者更低。

由此可知，該實(shí)驗(yàn)方法對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)具有較高的特異性，方法的選擇性主要來源于核酸適配體對(duì)食源性致病菌的特異性結(jié)合能力。

2.6 實(shí)際樣品分析

將從菜市場(chǎng)購(gòu)買的新鮮基圍蝦去殼及八爪魚切塊后，將蝦肉及八爪魚用絞肉機(jī)攪碎后，稱量25 g肉糜，放入裝有225 mL緩沖蛋白胨水的均質(zhì)器中，在均質(zhì)器中均質(zhì)3 min或5 min。得到蝦肉、八爪魚均質(zhì)液后，再將樣品均質(zhì)液分裝于15 mL離心管中(10 mL/支)，離心機(jī)中以6000 r/min離心10 min。選用上清液作為單增李斯特菌和副溶血性弧菌實(shí)驗(yàn)中實(shí)際實(shí)驗(yàn)樣品，各平行三份。將得到的蝦肉、八爪魚上清液按照1.3.3中的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行價(jià)表回收實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果如表2、表3所示。

表2 蝦肉和八爪魚樣品中單增李斯特菌的測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 2 The detection results of Listeria monocytogenes in shrimp and octopus(n=3)

表3 蝦肉和八爪魚樣品中副溶血性弧菌的測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 3 The detection results of Vibrio parahaemolyticus in shrimp and octopus(n=3)

其中單增李斯特菌實(shí)驗(yàn)中蝦肉的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard division, RSD)為1.5%～2.2%。其回收率為94.4%～100%，八爪魚的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.3%～4.8%。其回收率為94.4%～111%。

副溶血性弧菌實(shí)驗(yàn)中蝦肉的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.4%～7.1%。其回收率為89.3%～94.7%，八爪魚的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.2%～5.2%。其回收率為90.7%～101%。

3 結(jié) 論

Fe/Cu-MOFs合成過程簡(jiǎn)單，條件溫和，形貌規(guī)則，具有良好的熒光猝滅性能。以Fe/Cu-MOFs作為熒光猝滅平臺(tái)，建立檢測(cè)食源性致病菌的方法。該方法操作簡(jiǎn)單，避免了平皿計(jì)數(shù)法法檢測(cè)前的增菌步驟，檢測(cè)速度快，檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)平均一小時(shí)，可通過一些酶放大信號(hào)的技術(shù)進(jìn)一步提高方法的靈敏度，適合革蘭氏陽性菌和陰性菌的分析，具有一定的普適性，在實(shí)際樣品的分析中具有一定的應(yīng)用潛力。