方 康，彭海濤，胡瓊波

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，廣州 510642)

昆蟲雙雜交(Insect two-hybrid, I2H)技術(shù)是一種測(cè)定昆蟲細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用的方法(Monetal., 2009)，該系統(tǒng)由pIE2-AD、pIE2-DBD和pUAS-Luc三個(gè)載體構(gòu)成，pIE2-DBD載體含有酵母GAL4-DNA結(jié)合域(DNA binding domain, DBD)，而pIE2-AD載體含有小鼠核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活域(activating domain, AD)，DBD和AD結(jié)構(gòu)域相互靠近時(shí)，激活pUAS-Luc熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)(圖1)。將兩個(gè)待測(cè)蛋白(X和Y)分別構(gòu)建成pIE2-DBD-X和pIE2-AD-Y兩個(gè)載體，與pUAS-Luc一起共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，如果兩個(gè)蛋白相互作用，則觸發(fā)下游報(bào)告基因的表達(dá)。昆蟲雙雜交依靠熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)來反映昆蟲細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用特性，因而在研究昆蟲蛋白質(zhì)相互作用方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

昆蟲雙雜交(I2H)是在酵母雙雜交(Y2H)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種蛋白質(zhì)互作分析技術(shù)，使那些無法用Y2H分析的蛋白，尤其是那些受到翻譯后修飾(如糖基化、磷酸化和乙?；?的蛋白，可以用I2H進(jìn)行互作檢測(cè)(Stynenetal., 2012)；I2H還可用于分析Y2H系統(tǒng)中自激活蛋白(Monetal., 2009; Stynenetal., 2012)。

假性是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常見的現(xiàn)象，然而，I2H實(shí)驗(yàn)中的假性現(xiàn)象則少有報(bào)導(dǎo)。本文作者在家蠶蛋白I2H實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了BmHSP83和BmMAD3蛋白導(dǎo)致的假性現(xiàn)象。HSP83(Heat shock protein 83，熱休克蛋白83)也被稱為HSP90，它是一種伴侶蛋白，幫助其它蛋白質(zhì)正常折疊，穩(wěn)定蛋白質(zhì)抵抗熱應(yīng)激，并幫助蛋白質(zhì)降解(Biebl and Buchner, 2019)。盡管對(duì)HSP83的研究已有幾十年的歷史，但家蠶BmHSP83的報(bào)道卻很少。為了進(jìn)一步了解BmHSP83的功能，本研究根據(jù)蛋白數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)的預(yù)測(cè)結(jié)果，研究了BmHSP83與蛋白二硫鍵異構(gòu)酶A5(BmPDIA5，XP_004933309.1，得分>0.8)的相互作用。MAD3是Smads家族蛋白，在將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中作為轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)某些基因表達(dá)(Verrecchia and Mauviel, 2002)。為了研究家蠶BmMAD3蛋白的功能，本研究參考哺乳動(dòng)物和人類中MAD3可以與MAN1(內(nèi)核膜蛋白MAN1)相互作用(Panetal., 2005; Morettietal., 2017; Miyazonoetal., 2018)事實(shí)，研究了BmMAD3與BmMAN1二者的相互作用。有趣的是，在利用I2H系統(tǒng)研究上述蛋白互作過程中發(fā)現(xiàn)了BmHSP83和BmMAD3引起I2H假陽性現(xiàn)象，并進(jìn)一步分析了這種現(xiàn)象的原因?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下，希望有助于I2H技術(shù)的應(yīng)用。

圖1 昆蟲雙雜交技術(shù)原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of I2H analysis principle注：A，如果兩種蛋白質(zhì)相互作用，報(bào)告基因就會(huì)被轉(zhuǎn)錄激活；B，如果兩個(gè)蛋白質(zhì)不相互作用，報(bào)告基因就不能表達(dá)；C，昆蟲雙雜交載體pIE2-DBD，pIE2-AD和報(bào)告基因結(jié)構(gòu)示意圖(仿Mon et al., 2009)。Note: A, If the two proteins interacted, the reporter gene was activated; B, If two proteins did not interact, the reporter gene could not express; C, Schematic diagram of pIE2-DBD, pIE2-AD and reporter genes of insect two-hybrid vectors (modified on the basis of Mon et al., 2009).

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與培養(yǎng)

家蠶卵巢組織Bm12細(xì)胞系來自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)曹陽教授課題組，采用TNM-FH培養(yǎng)基(Hyclone，美國匹茲堡)，添加10%胎牛血清(Gibco，美國馬薩諸塞州)培養(yǎng)；草地貪夜蛾SpodopterafrugiperdaSF-9細(xì)胞系采用SFX昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(Hyclone，美國猶他州)和5%胎牛血清(Gibco，美國馬薩諸塞州)培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度27℃，細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)取用。

1.2 載體構(gòu)建

采用Gateway技術(shù)構(gòu)建載體(包括入門載體與目的載體)(Katzen, 2007)。首先，用總RNA試劑盒Ⅱ(Omega Bio-Tek，美國佐治亞州)從Bm12細(xì)胞中提取總RNA(Khuradetal., 2009)，用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Takara，中國北京)按照產(chǎn)品提示說明合成cDNA，根據(jù)目標(biāo)蛋白的基因序列設(shè)計(jì)引物，并在5′端加入4個(gè)堿基序列(CACC)(表1)，采用2×PrimeSTAR Max Premix試劑盒(Takara，中國北京)及其所提示方法PCR克隆這4個(gè)基因，反應(yīng)體系50 μL：25 μL 2×PrimeSTAR Max Premix、1 μL引物、1 μL模板，加無菌雙蒸水至50 μL；反應(yīng)條件為：98℃變性10 s，58℃退火15 s，72℃延伸2 min，32個(gè)循環(huán)；然后將純化的PCR產(chǎn)物連接到pENTR-TOPO克隆載體(Invitrogen，美國加利福尼亞州)并轉(zhuǎn)化TOP10菌株(中國北京青科)，在含卡那霉素的LB平板上篩選陽性菌落，PCR并測(cè)序其產(chǎn)物，驗(yàn)證基因序列，得到4個(gè)入門載體。

表1 供試家蠶蛋白質(zhì)信息

將上述入門載體與I2H載體pIE2-AD、pIE2-DBD(Addgene，美國馬薩諸州)反應(yīng)，得到I2H目的載體pIE2-AD-BmPDIA5、pIE2-AD-BmHSP83、pIE2-AD-BmMAN1、pIE2-AD-BmMAD3、pIE2-DBD-BmPDIA5、pIE2-DBD-BmHSP83、pIE2-DBD-BmMAN1和pIE2-DBD-BmMAD3，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α(中國北京青科)，挑取單菌落，PCR并測(cè)序其產(chǎn)物，驗(yàn)證基因序列。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將上述目的載體與報(bào)告基因載體pUAS-Luc轉(zhuǎn)染SF-9細(xì)胞，首先，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔板上，每孔100 μL培養(yǎng)基，當(dāng)90%以上細(xì)胞貼壁時(shí)方可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。然后，將FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑(Promega，美國威斯康辛州)4 μL和上述載體1 μg混合，并在室溫下靜置10 min。轉(zhuǎn)染時(shí)，向96孔板中每孔添加10 μL FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑/載體混合物，吹打均勻后繼續(xù)培養(yǎng)60 h，再進(jìn)行發(fā)光值檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 發(fā)光值檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析

將100 μL細(xì)胞從96孔板中移入空白96孔板，并加入熒光素酶Bright-Gloμ Luciferase Assay System(Promega，賽默飛中國)100 μL，孵育10 min后，用Synergy H1全功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek，美國弗吉尼亞州)檢測(cè)發(fā)光值，并計(jì)算相對(duì)光單位(Relative light unit, RLU)，即實(shí)際發(fā)光值與對(duì)照組(僅轉(zhuǎn)染報(bào)告質(zhì)粒pUAS-Luc)的發(fā)光值之比，采用新復(fù)極差法比較平均數(shù)顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體的構(gòu)建

入門載體：從4個(gè)入門載體中通過PCR分別擴(kuò)增了目標(biāo)基因片斷，其分子量大小與BmMAN1(2 328 bp)、BmHSP83(2 151 bp)、BmPDIA5(1 899 bp)和BmMAD3(1 335 bp)基因的堿基序列長(zhǎng)度一致(圖2)。將PCR產(chǎn)物回收并連接到pENTR-TOPO克隆載體中，選擇陽性克隆轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)測(cè)序比對(duì)，測(cè)序結(jié)果與目的基因序列一致，說明入門載體構(gòu)建成功。

圖2 入門載體PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis profile of PCR products of entry vectors注：M，DNA標(biāo)記DL5000，marked DL5000；A-1，BmMAN1；B-1，BmHSP83；C-1，BmPDIA5；D-1，BmMAD3。

目的載體：將入門載體與I2H載體pIE2-AD、pIE2-DBD反應(yīng)構(gòu)建I2H目的載體，選擇陽性菌落并進(jìn)行PCR鑒定(圖3)，測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列一致，表明成功構(gòu)建了目的載體pIE2-AD-BmPDIA5、pIE2-AD-BmHSP83、pIE2-AD-BmMAN1、pIE2-AD-BmMAD3、pIE2-DBD-BmPDIA5、pIE2-DBD-BmHSP83、pIE2-DBD-BmMAN1和pIE2-DBD-BmMAD3。

圖3 目的載體PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis profile of PCR products of objective vectors注：M，DNA標(biāo)記DL5000,marked DL5000；A1-A3，pIE2-AD-BmHSP83；B1-B3，pIE2-DBD-BmHSP83；C1-C3，pIE2-AD-BmPDIA5；D1-D3，pIE2-DBD-BmPDIA5；E1-E3，pIE2-AD-BmMAN1；F1-F3，pIE2-DBD-BmMAN1；G1-G3，pIE2-AD-BmMAD3；H1-H3，pIE2-DBD-BmMAD3。

2.2 發(fā)光值檢測(cè)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染60 h后測(cè)定發(fā)光值(圖4)。當(dāng)單獨(dú)轉(zhuǎn)染pIE2-DBD-BmHSP83時(shí)，相對(duì)發(fā)光單位(RLU)達(dá)到7.37，但顯著低于pIE2-AD-BmPDIA5和pIE2-DBD-BmHSP83共轉(zhuǎn)染時(shí)10.25的RLU值。然而，當(dāng)轉(zhuǎn)染單個(gè)pIE2-AD-BmPDIA5、pIE2-DBD-BmPDIA5和pIE2-AD-BmHSP83，或pIE2-AD-BmHSP83與pIE2-DBD-BmPDIA5共轉(zhuǎn)染時(shí)，其RLU與對(duì)照(單獨(dú)轉(zhuǎn)染報(bào)告基因載體)的RLU無顯著性差異。

同樣，轉(zhuǎn)染pIE2-DBD-BmMAD3或聯(lián)合轉(zhuǎn)染pIE2-AD-BmMAN1和pIE2-DBD-BmMAD3激活了報(bào)告基因的表達(dá)，RLU分別為92.49和123.04，兩者差異顯著。同時(shí)，單個(gè)pIE2-AD-BmMAN1、pIE2-DBD-BmMAN1和pIE2-AD-BmMAD3的轉(zhuǎn)染，以及pIE2-AD-BmMAD3和pIE2-DBD-BmMAN1的共轉(zhuǎn)染時(shí)，RLU值與對(duì)照的比沒有顯著變化(圖4)。

圖4 不同載體轉(zhuǎn)染SF-9細(xì)胞時(shí)的發(fā)光值檢測(cè)Fig.4 Luminescent value detection of SF-9 cells transfected by different vectors注：柱狀圖頂端不同字母表示顯著性差異(新復(fù)極差法)。Note: Different letters on the colum indicated the significant difference (Duncan’s multiple-range test, DMRT).

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BmHSP83和BmMAD3在I2H試驗(yàn)中引起假性現(xiàn)象，這是怎樣形成的呢？毫無疑問，這與該兩種蛋白的功能有關(guān)。眾所周知，HSP83作為分子伴侶調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄(Khurana and Bhattacharyya, 2015)。在細(xì)菌中，HSP83與RNA聚合酶相互作用，引導(dǎo)可熱誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄(Taipaleetal., 2010)；在大多數(shù)真核生物中，HSP83可能通過與NF-Κb p65、STA-Ts、Bcl-6、SP1和NF-Il6β等轉(zhuǎn)錄因子相互作用來調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄(Wangetal.,2009; Stark and Jr. Darnell, 2012; Taipaleetal., 2012; Khurana and Bhattacharyya, 2015)。因此，HSP83似乎有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD結(jié)構(gòu)域)的功能，但是，HSP83由于缺乏DNA結(jié)合能力而不能與DNA結(jié)合(Khurana and Bhattacharyya, 2015)，因此當(dāng)它與含有DBD結(jié)構(gòu)域的pIE2-DBD載體融合表達(dá)時(shí)(pIE2-DBD-BmHSP83)，即可以觸發(fā)下游的報(bào)告基因的表達(dá)，而pIE2-AD-BmHSP83融合載體由于缺乏BDB結(jié)構(gòu)域而無法啟動(dòng)下游報(bào)告基因表達(dá)(圖5)。

同樣，MAD3是TGF-β途徑的轉(zhuǎn)錄因子，起轉(zhuǎn)錄激活劑的作用(Liuetal., 1996; Panetal., 2005)，因此pIE2-DBD-BmMAD3可以激活報(bào)告基因的表達(dá)。盡管MAD3的MH1結(jié)構(gòu)域可以與特定的DNA堿基序列結(jié)合(Shietal., 1998; Zaweletal., 1998)，但由于報(bào)告基因載體上缺少該特定序列，因此pIE2-AD-BmMAD3不能啟動(dòng)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄，而只有在與DBD結(jié)構(gòu)域融合后才能激活報(bào)告基因的表達(dá)(圖5)。

圖5 本實(shí)驗(yàn)I2H結(jié)果的分析Fig.5 Hypothesis analysisfor this experimental result

有趣的是，共轉(zhuǎn)染pIE2-DBD-BmHSP83/MAD3和pIE2-AD-BmPDIA5/BmMAN1質(zhì)粒時(shí)，其發(fā)光值顯著高于單獨(dú)轉(zhuǎn)染pIE2-DBD-BmHSP83/MAD3質(zhì)粒時(shí)的發(fā)光值，推測(cè)這可能是一種疊加效應(yīng)。一方面是因?yàn)閜IE2-DBD-BmHSP83/MAD3啟動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)造成的假陽性，另一方面，是共轉(zhuǎn)染pIE2-DBD-BmHSP83/BmMAD3和pIE2-AD-BmPDIA5/BmMAN1時(shí)因?yàn)锽mHSP83與BmPDIA5互作，或BmMAD3與BmMAN1互作造成的真陽性(圖5)。反之，共轉(zhuǎn)染pIE2-AD-BmHSP83/MAD3和pIE2-DBD-BmPDIA5/BmMAN1質(zhì)粒時(shí)，其發(fā)光值與對(duì)照比沒有變化，未啟動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)，造成了假陰性結(jié)果(圖5)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BmHSP83和BmMAD3蛋白當(dāng)與BDB結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)時(shí)，可引起I2H實(shí)驗(yàn)的假陽性，這可能與BmHSP83和BmMAD3蛋白的轉(zhuǎn)錄激活功能有關(guān)；但是，當(dāng)融合BDB結(jié)構(gòu)域的BmHSP83和BmMAD3蛋白與融合AD結(jié)構(gòu)域的BmPDIA5或BmMAN1蛋白聯(lián)合表達(dá)時(shí)，則產(chǎn)生真假陽性的疊加效應(yīng)，因此證明BmHSP83和BmPDIA5，以及BmMAD3和BmMAN1是互作蛋白；反之，當(dāng)融合AD結(jié)構(gòu)域的BmHSP83或BmMAD3蛋白與DBD結(jié)構(gòu)的BmPDIA5或BmMAN1蛋白聯(lián)合表達(dá)時(shí)，則產(chǎn)生假陰性結(jié)果。本研究結(jié)果值得那些利用I2H系統(tǒng)研究具有轉(zhuǎn)錄激活功能的蛋白質(zhì)互作分析時(shí)借鑒。