胡啟豪，戴玉玲，裴夢圓，肖妍虹，趙丹琿，余小強，盧玉珍

(華南師范大學生命科學學院，廣東省昆蟲發(fā)育生物學與應用技術重點實驗室，廣州 510631)

家蠶是我國重要的經(jīng)濟益蟲，經(jīng)過長期的馴化和人工育種，目前已經(jīng)培育出大批具備優(yōu)良性狀的家蠶品種。遺傳雜交是人工育種的關鍵步驟，其中雄性家蠶精子質(zhì)量的高低直接影響著后代的性狀。精巢作為精子發(fā)生的場所，其發(fā)育機制的研究對于家蠶遺傳育種有著重要的意義。

Fox家族蛋白存在于植物以外的生物類群當中，具有一個約含100個氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域，根據(jù)不同F(xiàn)ox蛋白的保守性，可分為19個亞族：FoxA～FoxS(Weigeletal., 1989; Kerschneretal., 2014)。不同F(xiàn)ox蛋白已被證明在哺乳動物和昆蟲的組織發(fā)育和先天免疫等多種生物學過程中發(fā)揮關鍵作用。在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中，F(xiàn)oxN3(CHES-1-like)的過表達會導致精巢形態(tài)異常，并抑制精子發(fā)生的過程(Yuetal., 2016)。甜菜夜蛾SpodopteraexiguaSeFox蛋白結(jié)構(gòu)與家蠶BmFoxA相似，并且在精巢中有一定水平的表達(Zhaoetal., 2014)。家蠶的BmFoxG-1可能通過調(diào)節(jié)BmCyclinA等細胞周期基因的表達，從而調(diào)節(jié)家蠶精巢的發(fā)育(胡啟豪等, 2021)。Song等通過基因芯片(Microarray)的方法分析發(fā)現(xiàn)不同F(xiàn)ox基因在家蠶精巢中都有不同程度的表達(Songetal., 2015)。這些研究都說明Fox基因的功能可能與精巢發(fā)育相關，但其具體作用機制仍不清楚。

本研究通過qRT-PCR檢測了不同BmFox基因在家蠶5齡第5天(L5D5)幼蟲和預蛹期精巢中的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BmFoxL2亞族基因在兩個時間點均有高水平表達。本研究利用生物信息學方法對家蠶FoxL2亞族蛋白的結(jié)構(gòu)進行了分析，并進一步分析BmFoxL2-1和BmFoxL2-2在家蠶不同發(fā)育階段精巢中的表達情況以及在Bm12中的表達定位。最后，在家蠶Bm12細胞中分別過表達BmFoxL2-1和BmFoxL2-2蛋白，并分析了BmVasa等生殖和細胞周期相關基因的表達變化。本研究的結(jié)果初步說明BmFoxL2亞族蛋白參與了家蠶精巢發(fā)育及精子發(fā)生的過程。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

本研究使用的大造家蠶品種由廣東省蠶業(yè)技術推廣中心提供，家蠶的培養(yǎng)條件參考的方法胡啟豪等( 2021)。家蠶Bm12細胞、大腸桿菌DH5α和細胞過表達載體IE1-pEGFP-N1等均為本實驗室保存材料。

Trizol總RNA提取試劑購自中國艾科瑞生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑購自康為世紀生物技術有限公司；細胞轉(zhuǎn)染試劑購自Qiagen公司；引物由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成；去內(nèi)毒素質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司；實驗所用其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 生物信息學分析

從家蠶基因組數(shù)據(jù)庫SilkDB中獲得BmFoxL2-1(BGIBMGA000635)和BmFoxL2-2(BGIBMGA000838)基因及蛋白質(zhì)序列。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預測通過ExPASy進行，磷酸化位點及糖基化位點利用Cbs網(wǎng)站進行分析，蛋白結(jié)構(gòu)域利用SMART進行分析。

1.3 不同發(fā)育階段家蠶精巢cDNA制備

收集5齡第3天(L5D3)幼蟲至成蟲第3天的雄性家蠶，在PBS緩沖液中進行解剖并取出精巢。采用Trizol法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應按照康為世紀HiFiScript gDNA removal RT Master Mix 說明書進行，cDNA保存于-20℃。

1.4 不同F(xiàn)ox基因在家蠶不同發(fā)育階段精巢中的表達量檢測

以稀釋后的cDNA為模板，采用qRT-PCR方法分析目標基因的表達情況，以家蠶rp49作為內(nèi)參基因。qRT-PCR循環(huán)條件如下：95°C 5 min；95°C 10 s，60°C 30 s，40個循環(huán)。本研究所用引物序列見表1。

表1 實驗所用引物的序列

1.5 BmFoxL2-1/-2細胞過表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)BmFox2-1/-2的cDNA序列，設計上下游引物(表1)，克隆方法參考的方法胡啟豪等(2021)。利用SacⅠ和BamHⅠ對目的片段及pEGFP-N1-GFP載體進行雙酶切，DNA凝膠回收后用T4連接酶將兩者連接構(gòu)建重組載體，經(jīng)PCR與雙酶切驗證后轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5α中保存。采用去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒供轉(zhuǎn)染使用。

1.6 BmFoxL2-1/BmFoxL2-2在 Bm12細胞株的過表達及細胞定位分析

將Bm12細胞用新鮮培養(yǎng)基懸浮，分裝至6孔板中，并補足培養(yǎng)基至每孔2 mL，當每孔細胞密度達到80%以上時，參考Qiagen轉(zhuǎn)染試劑說明書的方法將BmFoxL2-1-EGFP和BmFoxL2-2-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Bm12細胞。

轉(zhuǎn)染48 h后，去除細胞培養(yǎng)液，加入適量PBS清洗細胞。用4%多聚甲醛固定細胞，用1‰ PBT(含1‰ Triton X-100的PBS)對固定后的細胞進行通透。往細胞中加入適量濃度的DAPI對細胞進行染色，結(jié)束后用1‰ PBT清洗多余的DAPI。制片后于激光共聚焦顯微鏡下分析BmFoxL2-1-EGFP和BmFoxL2-2-EGFP在細胞中的定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同F(xiàn)ox基因在家蠶精巢中的表達

家蠶存在有核與無核兩種形態(tài)的精子，分別在幼蟲階段和預蛹期形成，因此本研究收集了5齡第5天(L5D5)幼蟲和預蛹期(PP)家蠶精巢。定量分析顯示，在兩個時期的家蠶精巢中，BmFoxL2-2的表達水平均顯著高于其它BmFox基因，F(xiàn)oxL2亞族的BmFoxL2-1和FoxO亞族的BmFoxO-1/BmFoxO-2的表達水平次之(圖1)。因此，在后續(xù)的研究中將重點分析BmFoxL2-1和BmFoxL2-2在精巢發(fā)育中的作用。

圖1 不同BmFox基因在幼蟲和預蛹期家蠶精巢中的表達Fig.1 Expression of different BmFox genes in the testis of Bombyx mori larvae and prepupae注：A，5齡第5天幼蟲；B，預蛹。不同字母表示差異性顯著(單因素方差分析，Turkey多重比較，P<0.05)。Note: A, The day 5 of 5th instar larvae; B, Prepupae. Different letters indicated significant difference between the two groups (One way ANOVA: Tukey’s HSD tests, P<0.05).

2.2 BmFoxL2蛋白的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析

為進一步了解BmFoxL2的功能，本研究對BmFoxL2蛋白的理化性質(zhì)進行分析。結(jié)果顯示BmFoxL2-1和BmFoxL2-2蛋白的分子量分別為20.35 kDa和24.52 kDa，等電點分別為9.85和5.87，BmFoxL2-1蛋白的磷酸化和糖基化位點都高于BmFoxL2-2(表2)。利用SMART網(wǎng)站對2個BmFoxL2亞族蛋白的結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果顯示均含一個Forkhead結(jié)構(gòu)域(圖2-A)，并且Forkhead結(jié)構(gòu)域的序列與其它昆蟲以及人類FoxL2亞族蛋白的高度保守(圖2-B)。

圖2 BmFoxL2-1和BmFoxL2-2蛋白結(jié)構(gòu)、序列和定位分析Fig.2 Structural analysis, sequence aglinment and cellular localization of BmFoxL2-1 and BmFoxL2-2注：A，蛋白結(jié)構(gòu)預測；B，氨基酸序列比對；C，細胞定位分析。Note: A, Structural analysis; B, Sequence aglinment; C, Cellular localization.

表2 BmFoxL2-1和BmFoxL2-2蛋白理化性質(zhì)分析

為了進一步確認BmFoxL2-1/BmFoxL2-2的亞細胞定位，將構(gòu)建好的BmFoxL2-1-EGFP和BmFoxL2-2-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染家蠶Bm12細胞株(圖2-C)。結(jié)果顯示BmFoxL2-1定位于細胞核，BmFoxL2-2在細胞核與細胞質(zhì)中都有分布，這可能是由于BmFoxL2-1和BmFoxL2-2上所含的磷酸化和O-糖基化位點數(shù)目不一所導致的。以上結(jié)果說明BmFoxL2-1和BmFoxL2-2的功能可能存在差異。

2.3 BmFoxL2亞族基因在精巢中的表達

為進一步分析BmFoxL2亞族基因的功能，本文檢測了兩個FoxL2亞族基因在5齡第5天家蠶幼蟲精巢和卵巢中的表達變化，發(fā)現(xiàn)兩個BmFoxL2亞族基因在精巢中的表達均顯著高于卵巢(圖3-A)。由于精巢是精子發(fā)生的主要場所，因此本研究對5齡第5天家蠶幼蟲精巢的精巢膜和精巢內(nèi)容物進行分離。對精巢膜和內(nèi)容物的基因表達檢測顯示兩個BmFoxL2亞族基因在精巢內(nèi)容物中的表達水平均顯著高于精巢膜(圖3-B)，說明BmFoxL2蛋白可能參與精子發(fā)生。

圖3 BmFoxL2-1 和BmFoxL2-2基因在家蠶中的表達Fig.3 Expression of BmFoxL2-1 and BmFoxL2-2 transcripts in silkworm注：A，BmFoxL2-1和BmFoxL2-2基因在家蠶精巢和卵巢中的表達；B，BmFoxL2-1和BmFoxL2-2基因在精巢內(nèi)容物與精巢膜中的表達；C，BmFoxL2-1和BmFoxL2-2基因在不同發(fā)育階段的精巢中的表達變化。柱上標有星號表示兩組的表達差異顯著(*，P<0.05；***，P<0.001；t檢驗)。Note: A, Expression of BmFoxL2-1 and BmFoxL2-2 transcripts in the testis and ovary of silkworm at day 5 of 5th instar larvae; B, Expression of BmFoxL2-1 and BmFoxL2-2 mRNAs in different parts of the testis at day 5 of 5th instar larvae; C, Expression of BmFoxL2-1 and BmFoxL2-2 transcripts in the testis of silkworm at different developmental stages. The asterisk above the column indicated significant difference between the two groups (*, P<0.05; ***, P<0.001; t-test).

為了分析BmFoxL2基因在精巢中的表達模式，本研究在5齡第3天幼蟲到成蟲第1天的家蠶精巢中通過qPCR檢測兩個BmFoxL2基因的表達量。結(jié)果顯示，BmFoxL2-1的表達水平隨著精巢的發(fā)育逐漸升高，但在幼蟲階段增速緩慢，而進入蛹期后，上升速度開始加快。BmFoxL2-2的表達水平在5齡幼蟲末期(L5D5)達到一個高峰，在變態(tài)發(fā)育階段逐漸下降(L5D5-PP)，在蛹期階段(P0-P5)緩慢回升，到了成蟲階段迅速下降。但BmFoxL2-2在不同發(fā)育階段精巢中的表達均高于BmFoxL2-1(圖3-C)。該結(jié)果進一步暗示BmFoxL2-2可能在有核精子的形成中發(fā)揮作用，而BmFoxL2-1和BmFoxL2都可能與無核精子的形成相關。

2.4 BmFoxL2亞族蛋白對精巢生殖細胞發(fā)育的影響

細胞周期蛋白與生殖細胞有絲分裂和減數(shù)分裂等過程有著密不可分的關系。報道顯示BmFoxG-1可能通過調(diào)節(jié)細胞周期等基因的表達，參與精子發(fā)生過程。本研究在Bm12細胞株中過表達了BmFoxL2-1基因，發(fā)現(xiàn)細胞周期基因BmCyclinA的表達顯著上調(diào)，而生殖干細胞發(fā)育關鍵基因BmNanos的表達也發(fā)生了顯著上調(diào)(圖4)。而過表達BmFoxL2-2基因后，BmCyclinA、BmCyclinB和BmCyclinB3等細胞周期基因的表達顯著上調(diào)，BmNanos和BmVasa等生殖干細胞發(fā)育關鍵基因的表達也發(fā)生了顯著上調(diào)(圖5)。以上結(jié)果說明，兩個BmFoxL2亞族蛋白都可能通過調(diào)節(jié)生殖干細胞的發(fā)育及精細胞分裂等過程，影響家蠶精子的發(fā)生，而且BmFoxL2-2的調(diào)控功能更加顯著。

圖4 BmFoxL2-1蛋白對精子發(fā)生相關基因表達的影響Fig.4 Effect of BmFoxL2-1 overexpression on the expression of genes related to spermatogenesis注：柱上標有星號表示兩組的表達差異顯著；NS兩組的表達差異不顯著(*，P<0.05；**，P<0.01；t檢驗)。Note: Asterisks above the columns indicated significant difference between the two groups, “NS” indicates non-significant between the two groups (*, P<0.05; **, P < 0.01; t-test).

圖5 BmFoxL2-2蛋白對精子發(fā)生相關基因表達的影響Fig.5 Effect of BmFoxL2-2 overexpression on the expression of genes related to spermatogenesis注：柱上標有星號表示兩組的表達差異顯著；NS兩組的表達差異不顯著(*，P<0.05；t檢驗)。Note: Asterisks above the columns indicated significant difference between the two groups; “NS” indicated non-significant between the two groups (*, P<0.05; t-test).

3 結(jié)論與討論

FoxL2為Fox家族蛋白的一員，被認為是動物性別分化的關鍵因子。在小鼠中，F(xiàn)oxL2純合突變可以導致次級卵泡的缺失和卵母細胞的閉鎖(Uhlenhautetal., 2009)。在褐飛虱Nilaparvatalugens和沙漠飛蝗Schistocercagregaria中也發(fā)現(xiàn)FoxL2在卵巢中有較高水平的表達，并影響卵巢的發(fā)育(De Loofetal., 2010; Yeetal., 2017)。盡管也有研究顯示FoxL2在泥蟹Scyllaparamamosain等動物精巢中的表達高于卵巢，家蠶Microarray數(shù)據(jù)也顯示FoxL2-2基因在精巢中的表達高于卵巢，但FoxL2蛋白在精巢中的功能仍不清楚(Songetal., 2015; Wanetal., 2021)。本研究通過qRT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)兩個家蠶BmFoxL2基因在精巢中的表達水平顯著高于卵巢，并且主要在精巢內(nèi)容物中表達。

在家蠶精子發(fā)生過程中，精原細胞可以分化為有核精子與無核精子。在無核精子的輔助下，有核精子與家蠶卵結(jié)合形成受精卵(Sahara and Kawamura, 2002; Pereira and Santos, 2015)。家蠶精子的二型分化具有嚴格的時期特異性，即有核精子在幼蟲階段開始發(fā)生，而無核精子的發(fā)生則要到預蛹期(PP)才能開始，這些過程受到不同基因的嚴格調(diào)控(Sahara and Kawamura, 2002)。本研究分析了BmFoxL2-1和BmFoxL2-2在不同發(fā)育階段家蠶精巢中的表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BmFoxL2-1在幼蟲精巢中的表達水平較低，在預蛹期開始上升；而BmFoxL2-2的表達在5齡幼蟲末期達到高峰后開始下降，到了預蛹期后逐漸上升。這些表達變化與二型精子發(fā)生的時期相近，推測兩個BmFoxL2亞族基因的功能可能與家蠶精子的二型分化相關。

精子發(fā)生的過程是一個復雜且精細的過程，在黑腹果蠅中，生殖干細胞通過增殖與分化首先形成性原細胞。一個性原細胞經(jīng)歷有絲分裂和減數(shù)分裂后形成64個精細胞，這些過程受到Vasa、Nanos以及細胞周期相關基因的調(diào)控(Fabian and Brill, 2012; Fairchildetal., 2016)。研究顯示，與黑腹果蠅相似，家蠶生殖干細胞增殖與分化的過程同樣需要Vasa和細胞周期等基因的參與(賀真等, 2020)。本研究的結(jié)果顯示，在Bm12細胞中過表達BmFoxL2-2蛋白可以顯著上調(diào)細胞周期基因BmCyclinA、BmCyclinB、BmCyclinB3和BmCyclinA，以及生殖干細胞發(fā)育關鍵基因BmNanos和BmVasa的表達(圖5)。另外，過表達BmFoxL2-1蛋白也可以上調(diào)BmCyclinA和BmNanos的表達，但效果不如BmFoxL2-2的顯著(圖4)。由此推測家蠶FoxL2亞族蛋白都可以參與精子發(fā)生過程。但由于BmFoxL2-1和BmFoxL2-2蛋白的理化性質(zhì)和亞細胞定位均存在差異(圖2)，導致了兩者對精子發(fā)生相關基因的表達調(diào)控存在差異。

綜上，本研究結(jié)果說明BmFoxL2亞族蛋白的功能與精子發(fā)生過程相關。以上結(jié)果完善了FoxL2亞族基因在雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育中的功能，同時也為研發(fā)通過提高精子質(zhì)量優(yōu)化家蠶性狀的技術提供理論依據(jù)。