倪煒華，陳妍，王麗麗，薛羽晴

(1.嘉興市食品藥品與產品質量檢驗檢測院，浙江嘉興 314000； 2.北方民族大學生物科學與工程學院，銀川 750030)

動物性食品中的獸藥或非法添加藥物殘留對人體健康有著不容小覷的影響。雞蛋作為優(yōu)質的高蛋白動物源食品，因其價格、營養(yǎng)、口感等多方面的因素，成為人們不可或缺的食物，因此雞蛋中獸藥或非法添加藥物殘留問題引起人們高度關注。氟苯尼考為氯霉素的第三代改良版藥物。氯霉素是公眾熟知的一種抗生素，但它可以導致人體再生障礙性貧血［1］，2002 年3 月15 日，我國農業(yè)部發(fā)布《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》，將氯霉素列為禁止使用的抗生素。而后，在氯霉素的基礎上，研發(fā)了甲砜霉素，其毒性相對氯霉素減弱，藥效增強。而氟苯尼考是在甲砜霉素的基礎上，保留了甲砜基，以氟取代α-甲基位的羥基產生的衍生物，其藥效更強［2］。隨著進一步研究發(fā)現，氟苯尼考具有胚胎毒性，大量、不規(guī)范使用易在畜禽、水產等動物性食品中殘留，直接影響消費者的健康，并導致耐藥菌的產生［3］。GB 31650—2019 《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定，雞蛋中不允許檢出氟苯尼考殘留。金剛烷胺和金剛乙胺均屬于金剛烷類，是廣譜類抗病毒藥物，可用于動物的疾病預防和治療［4］，但此類藥物殘留通過食物鏈進入人體后，可在人體積累富集，對人的神經系統(tǒng)造成危害。農業(yè)部農醫(yī)發(fā)【2005】33 號文《關于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》中規(guī)定，禁止將金剛烷胺、金剛乙胺用于防治由高致病性禽流感等一類病原微生物引起的病毒性疫病。雖然國家已明確禁止金剛烷類藥物的使用，但部分養(yǎng)殖場濫用金剛烷類藥物的情況仍然時有發(fā)生，例如在2012 年的“速成雞”事件中，就檢測到雞肉中存在金剛烷胺殘留［5］。

目前測定氟苯尼考、金剛烷胺和金剛乙胺的方法主要有免疫分析法［6-7］、氣相色譜法［8-9］、氣相色譜-串聯質譜法［10-11］、液相色譜法［12-13］以及液相色譜-串聯質譜法［14-16］等。液相色譜-串聯質譜法因具有高分離能力、高選擇性和高靈敏度等優(yōu)勢，廣泛應用于藥物、食品、環(huán)境分析等領域。王亞會等［17］利用高效液相色譜-串聯質譜法測定雞肉中的金剛烷胺；李詩言等［18］利用高效液相色譜-串聯質譜法快速測定烏鱧肌肉中金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛殘留；李雅寧等［19］建立了超高效液相色譜-串聯質譜法檢測禽蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留物的方法。目前采用高效液相色譜-串聯質譜法同時測定雞蛋中的氟苯尼考、金剛烷胺和金剛乙胺3 種藥物還未見報道。筆者選擇QuEChERS 試劑盒對樣品進行凈化提取，通過優(yōu)化儀器條件，建立了同時測定雞蛋中氟苯尼考、金剛烷胺和金剛乙胺殘留的液相色譜-質譜串聯方法，該方法快速、靈敏，可為保障食品安全提供有效的監(jiān)控手段。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜質譜聯用儀：Agilent 1290 Infinity-6460 型，美國安捷倫科技有限公司。

氮氣發(fā)生器：CLAIND NIGEN LCMS40-1 型，楷來(上海)科技有限公司。氮吹儀：N-EVAP 型，美國orgnomation 公司。電子天平：JJ600 型，感量為0.01g，常熟雙杰測試儀器廠。

電子天平：BS210S 型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯公司。

離心機：TCL-10B 型，上海安亭科學儀器廠。恒溫水浴振蕩器：SH-B 型，上海精密儀器儀表有限公司。

超純水儀：PURELAB Chorus 1 型，英國埃爾格公司。

乙腈、甲醇：均為色譜純，德國默克公司。

甲酸：色譜純，美國ACS 恩科化學公司。

氟苯尼考標準品：純度（質量分數）為99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司。

金剛烷胺、金剛乙胺標準品：純度（質量分數）均大于99.0%，北京曼哈格生物科技有限公司。

金剛烷胺-D6、美金剛-D6標準品：純度（質量分數）均大于98.0%，加拿大DRC 公司。

QuEChERS 試劑盒：CQS-2 型，山東青云實驗耗材有限公司。

雞蛋樣品：市售。

1.2 溶液配制

氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺、金剛烷胺-D6、美金剛-D6單標儲備溶液：100 μg/mL，分別稱取氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺、金剛烷胺-D6、美金剛-D6標準品各10.0 mg(精確至0.1 mg)，置于5 只100 mL 容量瓶中，分別加入甲醇溶解并定容至標線，混勻，于-20 ℃下避光保存。

金剛烷胺-D6、美金剛-D6混合內標溶液：質量濃度均為1.0 μg/mL，分別移取金剛烷胺-D6、美金剛-D6單標儲備溶液各1.0 mL，置于同一只100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至標線，混勻，于4 ℃下避光保存。

氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺混合標準儲備溶液：質量濃度均為1.0 μg/mL，分別移取氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺單標儲備溶液各1.0 mL，置于同一只100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至標線，混勻。

氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺系列混合標準工作液：用甲醇溶液逐級稀釋氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺混合標準儲備溶液，并加入一定量的金剛烷胺-D6、美金剛-D6混合內標溶液，配制成氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺的質量濃度均分別為0.5、2、5、10、20 ng/mL 的系列混合標準工作溶液，其中內標金剛烷胺-D6、美金剛-D6的質量濃度均為5 ng/mL。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent EC-C18柱(100 mm×3.0 mm，2.7 μm，美國安捷倫科技有限公司)；流動相：A 相為0.2%甲酸水溶液，B 相為甲醇；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0～2 min 時B 相體積分數為20%，2～3 min 時B 相體積分數由20%等度過渡到80%，3～6 min 時B 相體積分數為80%，6.01 min 時B 相體積分數直接切換為20%，6.01～8 min 時B 相體積分數為20%；流量：0.3 mL/min；進樣體積：5 μL。

1.3.2 質譜條件

電離模式：電噴霧(ESI)正負離子切換模式；監(jiān)測方式：多級反應監(jiān)測(MRM)模式；毛細管電壓：4.0 kV；霧化氣：氮氣，純度（體積分數）為99.9%，溫度為350 ℃，流量為11 L/min。氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺質譜參數見表1。

表1 氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺質譜參數

1.4 樣品處理

稱取5.00 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL QuEChERS 萃取管中，加入20 μL 質量濃度為1.0 μg/mL 的金剛烷胺-D6、美金剛-D6混合內標溶液，加入20 mL 含1%甲酸的乙腈-水(體積比為80∶20)溶液，渦旋振蕩3 min，以8 000 r/min 轉速離心8 min，取5 mL 上清液于QuEChERS 凈化管中，旋渦混勻1 min，以8 000 r/min 轉速離心5 min，上清液全部轉移至試管中，于40 ℃水浴中氮吹至近干，用1 mL 甲醇溶解，過0.22 μm 濾膜，待測。

2 結果與討論

2.1 提取劑選擇

分別用0.5%三氯乙酸-乙腈(體積比為1∶1)溶液、1%甲酸-甲醇(體積比為1∶1)溶液［20］和含1%甲酸的乙腈-水(體積比為80∶20)溶液作為提取劑，考察不同提取溶劑對3 種待測化合物的提取效果。結果發(fā)現，3 種提取劑的提取效率基本一致，以0.5%三氯乙酸-乙腈溶液作為提取劑時，提取液離心后易出現絮狀沉淀；以1%甲酸-甲醇溶液作為提取劑時，出現雜峰且色譜峰形拖尾；以含1%甲酸的乙腈-水溶液作為提取劑時，離心后提取液澄清，目標物色譜峰形尖銳且無雜峰，提取效率高，故選擇含1%甲酸的乙腈-水(體積比為80∶20)溶液作為提取劑。

2.2 流動相選擇

氯霉素類化合物常用的流動相為甲醇-水、乙腈-10 mmol/L 乙酸銨水溶液等，金剛烷類常用甲醇-乙酸水溶液或甲醇-甲酸水溶液［21］作為流動相。本試驗選擇甲醇-甲酸水溶液作為流動相?？紤]到金剛烷胺、金剛乙胺在正離子模式下具有良好的電離效果，而氟苯尼考在負離子模式下有良好的電離效果，而流動相中加入甲酸有利于正離子模式下化合物的電離，對負離子模式下化合物的電離稍有抑制作用。通過對比不同體積分數甲酸水溶液作為流動相時的試驗結果，發(fā)現用甲醇-0.2%甲酸水溶液作為流動相對被測物進行梯度洗脫，氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺均能得到響應較高的離子碎片，且色譜峰形良好，滿足檢測要求。雞蛋空白樣品和加標樣品總離子流圖如圖1 和圖2 所示，氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺的多反應監(jiān)測色譜圖如圖3～圖5 所示。

圖1 空白樣品總離子流圖

圖2 加標樣品總離子流圖

圖3 氟苯尼考MRM 色譜圖

圖5 金剛乙胺MRM 色譜圖

2.3 質譜條件優(yōu)化

圖4 金剛烷胺MRM 色譜圖

根據氟苯尼考、金剛烷胺和金剛乙胺的結構特點，金剛烷胺、金剛乙胺選擇ESI+電離模式，生成較強的［M+H］+準分子離子，氟苯尼考選擇ESI-電離模式，生成較強的［M-H］-準分子離子，適合進行多級質譜分析。將氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺混合標準儲備溶液以流動注射方式在正離子模式下進行金剛烷胺、金剛乙胺母離子全掃描，在一級全掃描質譜中得到準分子離子［M+H］+，調節(jié)相應參數，使［M+H］+峰的豐度最大；然后對［M+H］+進行二級質譜分析，選擇最佳子離子，同時優(yōu)化碰撞電壓，最后確定定量、定性離子對。氟苯尼考相關參數在負離子模式下得到。優(yōu)化結果見表1。

2.4 線性方程與檢出限

在1.3儀器工作條件下，分別對1.2中氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺系列混合標準工作液進行測定，以質量濃度為橫坐標（x）、以色譜峰面積（氟苯尼考）或色譜峰面積與內標色譜峰面積比值（金剛烷胺和金剛乙胺）為縱坐標（y）繪制標準工作曲線，計算線性回歸方程及相關系數。以3 倍信噪比對應的待測化合物的質量濃度作為方法檢出限，根據樣品質量、提取體積、稀釋倍數和定容體積換算為樣品中的質量分數。氟苯尼考、金剛烷胺和金剛乙胺質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數及檢出限見表2。由表2 可知，3 種化合物的質量濃度在0.5～20 ng/mL范圍內均具有良好的線性關系，相關系數均不小于0.998，方法檢出限為1.0 μg/kg，滿足分析要求。

表2 線性范圍、線性方程、相關系數及檢出限

2.5 加標回收與精密度試驗

準確稱取5.0 g 雞蛋空白基質，分別加入氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺混合標準儲備溶液5、25、50 μL（氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺的質量分數分別為1.0、5.0、10.0 μg/kg），然后加入金剛烷胺-D6、美金剛-D6混合內標溶液20 μL，按1.4 樣品處理方法，每種加標濃度水平平行處理6 份樣品溶液，在1.3 儀器工作條件下分別進行測定，計算平均回收率和測定結果的相對標準偏差，結果見表3。根據NY/T 1896—2010 《獸藥殘留實驗室質量控制規(guī)范》和GB/T 27404—2008 《實驗室質量控制規(guī)范食品理化檢測》規(guī)定，平均回收率應在60%～120%的范圍內，測定結果的相對標準偏差應小于30%。由表3 可知，該方法平均回收率為84.0%～117.9%，測定結果的相對標準偏差為5.6%～12.0%，符合標準要求。

表3 加標回收與精密度試驗結果

3 結語

建立了基于QuEChERS 凈化提取的液相色譜-串聯質譜法測定雞蛋中氟苯尼考、金剛烷胺和金剛乙胺的方法。該方法便捷，高效，準確度和精確度較好，滿足雞蛋中氟苯尼考、金剛烷胺和金剛乙胺同時測定要求。