籍瑞芳，劉會(huì)

（濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，濟(jì)南 250102）

舒膽片是由大黃、虎杖、梔子、枳殼、芒硝、木香、郁金、茵陳和厚樸9 味藥材制成的常用中成藥，具有清熱化濕、利膽排石，行氣止痛的功效［1］，用于治療急慢性膽囊炎，在臨床上常與拉氧頭孢鈉聯(lián)合使用，療效顯著［2］。

舒膽片中的君藥大黃具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)，利濕退黃的功效，主要含有多種蒽醌類、多糖類和鞣質(zhì)類等化合物［3］，常見(jiàn)的蒽醌類物質(zhì)為大黃素、大黃酚、大黃酸等?；⒄染哂欣麧裢它S，清熱解毒，散瘀止痛，止咳化痰的功效，主要含有蒽醌類、二苯乙烯類、黃酮類和香豆素類等化合物［4］，虎杖苷是其重要的特征物質(zhì)。石春林等［5］研究表明虎杖苷能增強(qiáng)THP-1 巨噬細(xì)胞的增殖能力，抑制炎癥因子的表達(dá)。梔子具有瀉火除煩，清熱利濕，涼血解毒的功效，主要含有環(huán)烯醚萜類、二萜類和黃酮類等化合物［6］，梔子苷是其主要的活性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明［7］，梔子苷具有抗炎、抗氧化、提高免疫力等生物活性。枳殼具有理氣寬中、行滯消脹的功效，主要含有黃酮類、揮發(fā)油類、生物堿類等化合物［8］，柚皮苷和新橙皮苷是其中含量最高的黃酮類物質(zhì)。各成分相互協(xié)同，共同發(fā)揮藥效。因此對(duì)組方進(jìn)行多指標(biāo)分析，不僅能全面評(píng)價(jià)產(chǎn)品的質(zhì)量水平，而且能為臨床用藥提供參考。

舒膽片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑：第二十冊(cè)》［1］中。該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有大黃及梔子苷的薄層色譜鑒別分析，沒(méi)有對(duì)舒膽片中各成分進(jìn)行含量測(cè)定，無(wú)法全面、準(zhǔn)確地控制產(chǎn)品的質(zhì)量。目前文獻(xiàn)對(duì)舒膽片的質(zhì)量研究主要是關(guān)于蒽醌類物質(zhì)的測(cè)定，田惠玲等［9］利用HPLC 法測(cè)定了舒膽片中的大黃素和大黃酚的含量；籍瑞芳等［10］曾利用一測(cè)多評(píng)法對(duì)舒膽片中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚進(jìn)行了含量測(cè)定，但未見(jiàn)對(duì)舒膽片中其它成分進(jìn)行測(cè)定的報(bào)道。筆者采用波長(zhǎng)切換方式，以各成分的最大吸收波長(zhǎng)作為其檢測(cè)波長(zhǎng)，建立了HPLC 法同時(shí)測(cè)定舒膽片中梔子苷、虎杖苷、柚皮苷和新橙皮苷含量的方法。該方法操作簡(jiǎn)單實(shí)用、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，為實(shí)現(xiàn)舒膽片的多指標(biāo)質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-2030 Plus 型，LabSolutions工作站，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司。

電子天平：（1）MS205DU 型，感量為0.01 mg；（2）MS204TS/02 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE 型，昆山市超聲儀器有限公司。

梔子苷、虎杖苷、柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品：批號(hào)分別為110749-201919、111575-200502、110722-201714、111857-201102，純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別為97.1%、100%、93.4%、99.6%，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

舒膽片樣品：共5 批，市售。

乙腈：色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

甲醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，瑞典諾力昂公司）；流動(dòng)相：乙腈-水；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：乙腈初始體積分?jǐn)?shù)為10%，0～15 min 時(shí)乙腈體積分?jǐn)?shù)由10%逐漸增加至25%，保持10 min；流量：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：初始波長(zhǎng)為238 nm，保持13 min，然后切換至306 nm，保持4 min，最后切換至283 nm，保持8 min；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3 對(duì)照品溶液制備

首先將虎杖苷和新橙皮苷置于五氧化二磷減壓干燥器中干燥24 h，然后精密稱取梔子苷、柚皮苷和新橙皮苷對(duì)照品各約12 mg、虎杖苷對(duì)照品約16 mg，置于同一只200 mL 容量瓶中，加入80%甲醇溶液溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備溶液5 mL 于10 mL容量瓶中，加入80%甲醇溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻，配制成梔子苷、虎杖苷、柚皮苷和新橙皮苷的質(zhì)量濃度分別為31.70、40.48、29.89、31.03 μg/mL 的對(duì)照品溶液。

1.4 供試品溶液制備

取舒膽片樣品20 片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，精密稱取約0.45 g（約一片的量），置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲處理45 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

由于虎杖苷的光穩(wěn)定性較差，在光照下易發(fā)生異構(gòu)化［11］，所以在制備對(duì)照品溶液和供試品溶液過(guò)程中，需要避光操作。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

梔子苷屬于環(huán)烯醚萜類，虎杖苷屬于二苯乙烯類，柚皮苷和新橙皮苷屬于黃酮類，各成分之間最大紫外吸收波長(zhǎng)差別較大。用PDA 檢測(cè)器對(duì)梔子苷、虎杖苷、柚皮苷和新橙皮苷在190～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示，梔子苷紫外光譜最大吸收波長(zhǎng)為238 nm；虎杖苷最大吸收波長(zhǎng)為306 nm；柚皮苷和新橙皮苷最大吸收波長(zhǎng)為283 nm。為了降低干擾，提高檢測(cè)靈敏度，采用波長(zhǎng)切換方式，以各成分的最大吸收波長(zhǎng)作為其檢測(cè)波長(zhǎng)，即梔子苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm，虎杖苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為306 nm，柚皮苷和新橙皮苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm。

2.2 色譜條件優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)［12-14］，分別考察了流動(dòng)相為乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液和甲醇-0.1%磷酸溶液時(shí)4 種待測(cè)化合物的分離效果。結(jié)果表明，以乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，基線平穩(wěn)、各成分完全分離，色譜峰形好，理論塔板數(shù)高，因此選擇乙腈-水作為流動(dòng)相。由于4 種待測(cè)化合物極性差別較大，等度洗脫分析時(shí)間較長(zhǎng)，所以采用梯度洗脫的方式，洗脫程序：乙腈初始體積分?jǐn)?shù)為10%，0～15 min 時(shí)乙腈體積分?jǐn)?shù)由10%逐漸增加至25%，保持10 min。

2.3 樣品提取條件選擇

根據(jù)文獻(xiàn)［15］，分別采用稀乙醇溶液、60%乙醇溶液、70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、95%乙醇溶液、80%甲醇溶液和甲醇作為提取溶劑，考察4 種待測(cè)化合物的提取效果。結(jié)果表明，以80%甲醇溶液作為提取溶劑時(shí)，目標(biāo)化合物提取率高，干擾雜質(zhì)峰較少，且操作簡(jiǎn)單易行，故選擇80%甲醇溶液為提取溶劑。以80%甲醇溶液為提取溶劑，分別考察超聲提取30、45、60 min 和加熱回流30、45、60 min兩種方法的提取效果，結(jié)果表明，超聲處理45 min時(shí)4 種待測(cè)化合物即可實(shí)現(xiàn)完全提取，且能耗較低，故樣品提取方法采用超聲處理45 min。

2.4 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗(yàn)

取1.3 中的對(duì)照品溶液和1.4 中的供試品溶液，按照1.2 色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可以看出，梔子苷、虎杖苷、柚皮苷和新橙皮苷完全分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)大于4 000。采用二極管陣列（PDA）檢測(cè)器對(duì)供試品溶液在190～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果表明，4 種待測(cè)化合物的光譜圖與對(duì)照品的光譜圖一致，同時(shí)進(jìn)行色譜峰純度檢查，均符合要求。

圖1 對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖

2.5 線性方程與檢出限

精密吸取1.3 中的對(duì)照品溶液1、2、5、8、10、12、15、18、20 μL，按照1.2 色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，以各待測(cè)成分的質(zhì)量（X）為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。將1.3 中的對(duì)照品溶液用80%甲醇溶液逐級(jí)稀釋，按照1.2 色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以3 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量作為檢出限，以10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量作為定量限。4 種化合物質(zhì)量線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見(jiàn)表1。

表1 4 種化合物質(zhì)量線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取舒膽片樣品，按1.4 方法制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下，分別于制備完成后第0、4、8、12、18、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.48%～1.48%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)舒膽片樣品，按1.4 方法平行制備6 份供試品溶液，在1.2 色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，梔子苷、虎杖苷、柚皮苷和新橙皮苷測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.03%，1.45%，1.11%，1.10%，表明該方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取已知含量的舒膽片樣品6 份，每份0.23 g（約半片的量），精密稱定，置于50 mL 容量瓶中，每份均精密加入1.3 中的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液12.5 mL，用80%甲醇溶液稀釋至標(biāo)線，按照1.4 方法制成供試品溶液，在1.2 色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4 可知，梔子苷、虎杖苷、柚皮苷和新橙皮苷加標(biāo)平均回收率分別為100.2%、102.8%、98.6%、100.6%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)波長(zhǎng)切換和梯度洗脫的方式，建立了同時(shí)測(cè)定舒膽片中梔子苷、虎杖苷、柚皮苷和新橙皮苷含量的方法。該方法操作簡(jiǎn)單，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，為全面考察舒膽片的質(zhì)量水平提供了參考方法和可靠依據(jù)。