趙粉琴 趙艷 劉潔穎 胡芝霞 茍雅姣 謝知慧 李淑萍

放射治療手段已經(jīng)成為惡性腫瘤延緩生命的一種方法，尤其是盆腔放射治療對(duì)對(duì)卵巢造成不可逆的損傷成為卵巢功能早衰(premature ovarian failure，POF)的主要原因之一[1-2]，嚴(yán)重影響女性生殖健康。雌激素補(bǔ)充治療雖然可以治療POF引起的一系列癥狀，改善生育以及維持骨量有一定意義[3]。但是長(zhǎng)期用藥可導(dǎo)致內(nèi)膜癌和乳腺癌[4-5]，因此，限制其在臨床的使用。腎藏精，主生殖，為天癸之源，故《傅青主女科》有“經(jīng)水出諸腎”之說(shuō)[6]。左歸丸作為經(jīng)典的滋補(bǔ)腎陰的藥物，臨床用來(lái)治療骨質(zhì)疏松[7-8]、閉經(jīng)以及圍絕經(jīng)期綜合征[9-11]取得很好療效。但是左歸丸對(duì)于輻射損傷卵巢的保護(hù)作用機(jī)制方面研究目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，基于腎主生殖的中醫(yī)理念，本實(shí)驗(yàn)采用模擬臨床腫瘤治療的放射劑量對(duì)大鼠進(jìn)行照射，用左歸丸進(jìn)行干預(yù)處理，觀察大鼠血清性激素水平、卵巢組織凋亡率，以及p53蛋白表達(dá)情況，探討左歸丸對(duì)于輻射損傷卵巢的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以及模型制備

雌性SPF級(jí)8周齡SD大鼠60只，體質(zhì)量(220±20)g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(甘)2015-0005。在自然光照條件下(白/晝12小時(shí)/12小時(shí))飼養(yǎng)，3天后用于實(shí)驗(yàn)研究。隨機(jī)分為照射組(50只)：照射條件：γ射線6.0 Gy，6 mV，劑量率3 Gy/分鐘，照射時(shí)長(zhǎng)：2.2分鐘， (甘肅省人民醫(yī)院放療科，高能直線加速器，型號(hào)：ONCOR Impression Plut)，照射源皮距為100 cm，在10 cm×10 cm特制鉛模中，照射野大小為2.0 cm×2.0 cm照射范圍；正常組(10只)：不進(jìn)行照射常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 主要儀器與試劑

倒置顯微鏡(日本OLYMPUSC×31，型號(hào)：CX21FS1);蛋白電泳儀(Bio-rad，型號(hào)：164-5050)；ELISA激素水平檢測(cè)試劑盒(CUSABIO，96T)；卵泡雌激素(follicular stimulating hormone，F(xiàn)SH)批號(hào)：CSB-E06869r；黃體生成素(luteinizing hormone，LH)批號(hào)：CSB-E12654r；雌二醇(estrogen，E2)批號(hào)：CSB-E05110r；p53蛋白單克隆抗體(CUSABIO，96T)批號(hào)：CSB-RP155094r，規(guī)格：20 μL; DAB 顯色試劑盒(中杉金橋)；二抗(中杉金橋)：生物素標(biāo)記山羊抗鼠免疫球蛋白(SP-9002)、生物素標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白(SP-9001)；三抗(中杉金橋)：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液(SP-9001)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組以及藥物制備

輻照24小時(shí)后隨機(jī)分成模型組、補(bǔ)佳樂(lè)組、左歸丸高劑量組、左歸丸低劑量組和左歸丸高劑量+補(bǔ)佳樂(lè)組。灌胃藥物劑量計(jì)算：補(bǔ)佳樂(lè)(按70 kg的成人一天服用左補(bǔ)佳樂(lè)1 mg計(jì)算，大鼠劑量0.09 g/(kg·d)，制備成0.09 mg/mL)，按照0.018 g/200(g·d)給藥，給藥時(shí)稱重，調(diào)整用藥劑量；左歸丸劑量(按70 kg的成人一天服用左歸丸的生藥量為105 g 計(jì)算，大鼠劑量9.45 g/(kg·d)，制備左歸丸低濃度煎劑為0.945 g生藥/mL(相當(dāng)于臨床等效給藥量)、高劑量為5倍4.725 g生藥/mL)，左歸丸(熟地黃、炒山藥、山茱萸、牡丹皮、澤瀉、茯苓，草藥由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供)，按照0.189 g生藥/200 g和0.946 g生藥/200 g給藥。各組大鼠進(jìn)行無(wú)菌飼養(yǎng)(房間用1∶5000濃度的高錳酸鉀噴灑消毒，空氣用紫外線燈照射30分鐘，2次/日，飼料、水及墊料均經(jīng)高壓滅菌)。連續(xù)用藥21天。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 大鼠血清性激素水平的檢測(cè) 治療結(jié)束后，心臟取血1.5 mL，在4℃以3000 r/min離心10分鐘，吸取上層血清移入EP管，用96孔ELISA試劑盒檢測(cè)血清中FSH、E2和LH的水平。

1.4.2 卵巢組織病理學(xué) 治療結(jié)束后大鼠采用頸椎脫位處死。取卵巢固定，蘇木精—伊紅染色觀察卵巢內(nèi)不同發(fā)育階段卵泡數(shù)量的變化。用10%戊二醛0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.3)固定2小時(shí)。常規(guī)包埋，取4 μm切片，HE染色。顯微鏡下觀察卵巢組織卵泡變化情況，每個(gè)卵巢觀察5張切片，計(jì)算所有切片卵泡數(shù)量以及正常卵泡和閉鎖卵泡比例。

1.4.3 通過(guò)AnnexinV-FITC/PI法分析細(xì)胞凋亡(流式細(xì)胞儀檢測(cè)) 取一側(cè)卵巢組織約0.5 cm2，用眼科剪剪成肉糜狀，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，離心，冷乙醇固定，終濃度70%～75%，留取懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞終濃度1×106個(gè)/mL，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，測(cè)定各期細(xì)胞比例及凋亡率。

1.4.4 免疫組化法檢測(cè)卵巢組織內(nèi)p53蛋白的表達(dá)情況 取固定好的一側(cè)卵巢組織，切片，脫水。3%過(guò)氧化氫室溫避光作用20分鐘，蒸餾水洗，正常山羊血清封閉液室溫作用30分鐘，倒掉封閉液后，滴加一抗(p53)工作液(1∶100)，4℃孵育過(guò)夜。分別滴加生物素化二抗(SP試劑盒)、三抗，分別室溫作用30分鐘，再滴加DAB顯色液(1∶20)室溫避光作用5分鐘，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，一旦出現(xiàn)最佳顏色，使用蒸餾水停止其顯色反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，中性樹(shù)膠封片。同時(shí)設(shè)染色對(duì)照，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不同區(qū)域。使用Image-Pro Plus軟件(6.0版)測(cè)量卵巢內(nèi)組織中雌激素受體、卵泡雌激素受體和黃體生成素受體陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠卵巢組織病理切片分析

正常對(duì)照組大鼠卵巢可見(jiàn)各級(jí)生長(zhǎng)卵泡生長(zhǎng)活躍，顆粒細(xì)胞排列整齊，卵泡體積較大，卵泡液多。輻射模型組大鼠卵巢體積明顯縮小，卵泡卵母細(xì)胞固鎖，周邊顆粒細(xì)胞固鎖，顆粒細(xì)胞層較正常減少且排列紊亂，與正常對(duì)照組比較，正常卵泡/所有卵泡比例明顯減少(P<0.01)；給予補(bǔ)佳樂(lè)、左歸丸處理后，卵巢中竇狀卵泡可見(jiàn)，初級(jí)卵泡減少，仍有部分卵泡閉鎖，顆粒細(xì)胞層次較模型組有所增多。尤以左歸丸高劑量+補(bǔ)佳樂(lè)組竇狀卵泡數(shù)量增加，正常卵泡/所有卵泡比例與輻射模型組比較明顯增加(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠卵巢竇狀卵泡所占比例分析

如圖所示，正常對(duì)照組可見(jiàn)竇狀卵泡和多個(gè)初級(jí)卵泡，卵母細(xì)胞核清晰，周邊顆粒細(xì)胞排列有序。輻射模型組可見(jiàn)多個(gè)閉鎖卵泡，次級(jí)卵泡卵母細(xì)胞核固鎖(紅色箭頭)，周邊顆粒細(xì)胞排列紊亂，固鎖(黑色箭頭)。補(bǔ)佳樂(lè)組可見(jiàn)多個(gè)初級(jí)卵泡和竇狀卵泡(卵母細(xì)胞核清晰，周邊顆粒細(xì)胞部分固鎖)，卵母細(xì)胞溶解，顆粒細(xì)胞固鎖(紅色箭頭)，排列紊亂。左歸丸高劑量組可見(jiàn)初級(jí)卵泡(卵母細(xì)胞核清晰)和次級(jí)卵泡(卵母細(xì)胞核溶解)，周邊顆粒細(xì)胞固鎖(紅色箭頭)，排列紊亂。左歸丸低劑量組可見(jiàn)少量初級(jí)卵泡(卵母細(xì)胞核清晰)和周邊顆粒排列有序，未見(jiàn)次級(jí)卵泡。左歸丸高劑量+補(bǔ)佳樂(lè)組可見(jiàn)次級(jí)卵泡(卵母細(xì)胞核溶解)、竇狀卵泡的卵母細(xì)胞固鎖(紅色箭頭)，周邊顆粒細(xì)胞排列紊亂，部分固鎖(黑色箭頭)。見(jiàn)圖1。

2.2 各組大鼠血清FSH、LH和E2含量分析

實(shí)驗(yàn)過(guò)程除正常對(duì)照組以外，其余各組均有大鼠死亡。與正常組比較，輻射模型組大鼠血清FSH和LH增高，E2含量降低，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，補(bǔ)佳樂(lè)和左歸丸劑量組FSH降低，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，LH降低，E2增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清FSH、LH和E2含量比較

注：①原始卵泡；②次級(jí)卵泡；③竇前卵泡；④竇狀卵泡。A對(duì)照組; B模型組； C補(bǔ)佳樂(lè)組； D左歸丸高劑量組； E左歸丸低劑量組；F左歸丸高劑量+補(bǔ)佳樂(lè)組。

2.3 各組大鼠卵巢細(xì)胞凋亡率和p53蛋白含量分析

與正常對(duì)照組比較，輻射模型組流式細(xì)胞儀檢測(cè)出現(xiàn)明顯的亞二倍體峰(凋亡峰)，卵巢組織凋亡明顯，p53蛋白含量增加，比較有顯著性差異(P<0.01)；與輻射模型組比較，補(bǔ)佳樂(lè)和左歸丸高劑量組可以降低卵巢組織凋亡率(P<0.05)，尤以左歸丸高劑量+補(bǔ)佳樂(lè)組降低明顯(P<0.05)；左歸丸高劑量組、左歸丸高劑量+補(bǔ)佳樂(lè)組p53蛋白降低(P<0.05)，尤以左歸丸高劑量組+補(bǔ)佳樂(lè)組降低明顯(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3，圖2～3。

表3 各組大鼠卵巢組織凋亡和p53蛋白表達(dá)比較

注：A對(duì)照組; B模型組； C補(bǔ)佳樂(lè)組； D左歸丸高劑量組；E左歸丸低劑量組；F左歸丸高劑量+補(bǔ)佳樂(lè)組。

注：A正常組；B輻射模型組；C補(bǔ)佳樂(lè)組；D左歸丸高劑量組；E左歸丸低劑量組；F左歸丸高劑量+補(bǔ)佳樂(lè)組。p53在卵母細(xì)胞上表達(dá)，陽(yáng)性結(jié)果顯示為棕黃色顆粒(黑色箭頭)。

3 討論

放射治療對(duì)在女性生殖系統(tǒng)損傷中，卵巢最為敏感[12-13]，6.0 Gy就可導(dǎo)致卵巢功能衰竭[14]。放療對(duì)卵巢損傷主要在早期卵泡DNA損傷，卵母細(xì)胞凋亡，刺激卵泡閉鎖，卵泡儲(chǔ)備顯著下降，發(fā)展為POF[15]。完整卵泡由三部分組成，包括卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞以及卵泡膜細(xì)胞。顆粒細(xì)胞起著關(guān)鍵作用，分泌E2，維持卵泡發(fā)育，顆粒細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致卵泡閉鎖的主要原因[16]。

顆粒細(xì)胞凋亡有多種途徑，當(dāng)細(xì)胞氧化應(yīng)激，輻射引起DNA損傷時(shí)，激活p53，抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，細(xì)胞停滯在G1/S期，引發(fā)凋亡[17]。p53基因與卵泡閉鎖機(jī)制密切相關(guān)[18]，在介導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡引起的卵泡閉鎖過(guò)程中起重要作用[19]。輻照劑量為6.0 Gy 是依據(jù)臨床輻照模型[20]，探討輻射對(duì)卵母細(xì)胞損傷以及中醫(yī)藥治療的作用機(jī)制。電離輻射屬于中醫(yī)學(xué)的“火邪”，具有直中臟腑導(dǎo)致熱毒內(nèi)蓄損傷人體氣血津液、脾腎造化不及作用而產(chǎn)生病證。

研究顯示輻射導(dǎo)致POF的主要機(jī)制是促進(jìn)顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞凋亡，激發(fā)卵泡閉鎖，同時(shí)激活細(xì)胞凋亡的p53途徑，加快生長(zhǎng)卵泡凋亡，導(dǎo)致卵巢分泌雌激素水平下降，反饋刺激垂體釋放促性腺激素(FSH和LH)，加速卵巢內(nèi)殘余原始卵泡的發(fā)育，如果多次反復(fù)輻射，生長(zhǎng)卵泡則進(jìn)一步凋亡，最終導(dǎo)致POF發(fā)生。

中醫(yī)認(rèn)為腎主生殖，腎氣虧損造成卵泡閉鎖，是POF主要機(jī)制。左歸丸出自張仲景的《景岳全書》，具有滋補(bǔ)腎陰，填精益髓等功效。研究表明左歸丸具有修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷、促進(jìn)生殖發(fā)育、改善骨代謝、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用[21]，但在輻射損傷卵巢功能恢復(fù)方面研究較少。

本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，各藥物組處理后大鼠卵巢組織中有初級(jí)和次級(jí)卵泡發(fā)育，但也存在多個(gè)閉鎖卵泡，血清FSH、FSH/LH明顯降低，E2明顯增高，p53蛋白表達(dá)明顯下降，尤以左歸丸高劑量和補(bǔ)佳樂(lè)組作用最顯著。推測(cè)可能是：(1)左歸丸通過(guò)補(bǔ)腎填精促進(jìn)顆粒細(xì)胞增值繼而促進(jìn)卵泡的發(fā)育，促進(jìn)卵巢合成雌激素，負(fù)反饋抑制下丘腦—垂體—卵巢軸，降低了FSH、FSH/LH分泌；(2)輻射導(dǎo)致POF，雌激素水平下降，反饋性促進(jìn)垂體分泌FSH，促進(jìn)參與原始卵泡發(fā)育；(3)左歸丸通過(guò)下調(diào)卵巢組織p53蛋白的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。與前期研究左歸丸含藥血清促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖一致[22]。Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn)左歸丸可以改善低雌激素狀態(tài)，與補(bǔ)腎藥物可以改善卵巢功能低下?tīng)顟B(tài)功能一致[24]。

因此，放療損傷引起的POF是一種不可逆的損傷，尤其是對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育。經(jīng)典補(bǔ)腎藥物左歸丸對(duì)POF在臨床以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，其可以促進(jìn)卵巢功能恢復(fù)，調(diào)理女性生殖內(nèi)分泌[25]，為左歸丸臨床應(yīng)用防治輻射損傷卵巢保護(hù)作用提供依據(jù)。