陳超 繆艷燕 李慧君 李衛(wèi)崗 張文生

陳皮分“陳皮”和“廣陳皮”，為中醫(yī)藥臨床常用藥，具有理氣健脾，燥濕和胃的作用。陳皮用藥載于《廣州府志》：“入藥以廣陳皮為貴，出新會者最良?！辈柚Ω淌切聲惼さ钠贩N來源[1]，又名新會柑。明代劉文泰在《本草品匯精要》中提到橘皮“謹(jǐn)按青橘、黃橘”，“功用既殊，性味亦異”，但在采摘時(shí)間上提及黃橘“十月取實(shí)”，在《中華本草》中，規(guī)定陳皮十至十二月果實(shí)成熟時(shí)取下?！吨兴幋笤~典》注解橘皮來源于“10月以后采摘成熟果實(shí)”，其所含的揮發(fā)油、多糖、多酚、黃酮等成分具有較強(qiáng)的藥理活性作用[2]。從陳皮中分離并鑒定的140種化學(xué)成分中，除揮發(fā)油外，黃酮類化合物是主要的生物活性和特征成分[3]。現(xiàn)代藥理研究表明，黃酮類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化、抗菌、抗腫瘤及心腦血管保護(hù)作用[4]，其中又以橙皮苷[5]、川陳皮素[6-7]、橘皮素[8]及多甲氧基黃酮[9]等成分的藥理研究較多?；诖?，全面解析新會陳皮黃酮類成分的質(zhì)量標(biāo)志物(quality marker,Q-marker)[10]對提高新會陳皮的臨床應(yīng)用具有重要意義。

本研究首先通過新會陳皮代謝組學(xué)鑒定出黃酮類化合物，查找主要作用靶點(diǎn)，構(gòu)建從分子到蛋白，從蛋白到疾病的分子網(wǎng)絡(luò)；之后利用基因本體注釋(gene ontology，GO)[11]和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)[12]等生物信息富集分析，從信息學(xué)角度探索主要黃酮類化合物與其藥用價(jià)值的關(guān)聯(lián)性；最后采用分子對接技術(shù)，以核心靶點(diǎn)蛋白的配體作為對照，評估黃酮化合物與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合的可能性，并耦合文獻(xiàn)檢索證據(jù)為黃酮類化合物作為新會陳皮Q-marker提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

超高效液相色譜(SHIMADZU Nexera X2)串聯(lián)質(zhì)譜(Applied Biosystems 4500 QTRAP)，美國安捷倫公司；烘箱(UF160plus)，Memmert；離心機(jī)(5425 R)，Eppendor；超低溫冰箱(902GP-ults)，Thermo Fisher。

1.2 試藥

茶枝柑果皮經(jīng)干燥后作為樣品，采樣時(shí)間為2020年11月中旬，地點(diǎn)為新會東甲村果園(新會站北200米)。甲醇(色譜純，Merck)，乙醇(色譜純，Merck)，標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純，BioBioPha/Sigma-Aldrich)。

1.3 陳皮成分UPLC-MS/MS前處理

新會陳皮樣品干燥后用研磨儀研磨至粉末狀。精確稱取粉末0.1 g，溶于含70%甲醇的提取液1.2 mL中。渦旋6次，每次30秒，間隔時(shí)間30分鐘，并放置4°C過夜萃取。使用時(shí)，12000 r/分鐘離心10分鐘，取上清，用0.22 μm微孔濾膜過濾后，存于進(jìn)樣瓶。

1.4 陳皮成分UPLC-MS/MS分析

液相色譜條件：色譜柱：AgilentSB-C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；流動相：A相為0.1%的甲酸的超純水，B相為含0.1%的甲酸的乙腈；洗脫梯度為5%～95%，9分鐘。10～11分鐘時(shí)，B相比例降為5%，并以5%平衡至14分鐘；流速0.35 mL/分鐘，柱溫40°C。

質(zhì)譜條件(邁特維爾生物科技有限公司，武漢)：由Analyst 1.6.3軟件(AB Sciex)控制運(yùn)行正負(fù)兩種離子模式。電噴霧電離源(ESI)操作參數(shù)如下：離子源，渦輪噴霧；源溫度550°C；離子噴霧電壓(IS)5500 V(正離子模式)/-4500 V(負(fù)離子模式)。離子源氣體I(GSI)，氣體II(GSII)和簾氣(CUR)分別設(shè)置為50、60和25.0 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級桿和線性離子阱模式下分別用10 μmol/L和100 μmol/L聚丙二醇溶液進(jìn)行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準(zhǔn)。三重四級桿掃描使用多反應(yīng)檢測掃描模式，并將碰撞氣體(氮?dú)?設(shè)置為中等。

1.5 陳皮化學(xué)成分鑒定

質(zhì)控樣本由樣本混合制備而成，在測樣時(shí)混入確保儀器檢測時(shí)的穩(wěn)定性。用MultiaQuant 2.0軟件進(jìn)行色譜峰的積分和校正工作(去除雜峰)，用色譜峰的峰面積代表陳皮中化合物的相對含量，并通過本地?cái)?shù)據(jù)庫鑒定所測黃酮類化合物的相對含量。

1.6 成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[13]和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫[14]中檢索新會陳皮候選化合物靶點(diǎn)，合并數(shù)據(jù)后，規(guī)范靶點(diǎn)基因名，得到有美國化學(xué)文摘服務(wù)社(chemical abstracts service, CAS)登記號的化合物和靶點(diǎn)蛋白，用Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將預(yù)測的化合物靶向蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫[15]，物種參數(shù)設(shè)置為人，互作評分參數(shù)大于0.9，去除網(wǎng)絡(luò)圖譜中的單一節(jié)點(diǎn)后，用Cytoscape重構(gòu)靶向蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.8 GO與KEGG富集分析

運(yùn)用R包c(diǎn)lusterProfiler[16]對靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO分析，包括生物過程(biological process, BP)、細(xì)胞組成(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)，用多重假設(shè)檢驗(yàn)(Benjaminiand hochberg,BH)方法控制假陽性(BH<0.001)。KEGG通路富集分析時(shí)使用BH<0.001。

1.9 核心成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將關(guān)注的陳皮重要成分、預(yù)測的重要蛋白靶點(diǎn)及其相應(yīng)的關(guān)鍵KEGG通路在Cytoscape中構(gòu)建成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.10 核心靶點(diǎn)組織分布

從人類蛋白質(zhì)圖譜(The Human Protein Atlas)數(shù)據(jù)庫[17]下載基于免疫組化的組織微陣列的人類組織蛋白質(zhì)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選核心靶點(diǎn)蛋白組織表達(dá)數(shù)據(jù)后，用Cytoscape整理核心靶點(diǎn)組織表達(dá)數(shù)據(jù)，構(gòu)建核心靶點(diǎn)組織分布網(wǎng)絡(luò)圖。

1.11 分子對接分析

從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(protein data bank，PDB)[18]中選擇辨析度較高的晶體結(jié)構(gòu)作為候選靶點(diǎn)蛋白的3-D結(jié)構(gòu)，下載PDB格式文件后，用Autodock分離蛋白中的配體，作為對照結(jié)合化合物。配體分子結(jié)構(gòu)(Mol2格式)從ZINC數(shù)據(jù)庫[19]下載。

用AutoDockTools 4.2.6對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行去水分子、加氫、加電荷預(yù)處理。通過AutoDockVina實(shí)現(xiàn)配體與受體的分子對接計(jì)算，獲得結(jié)合能。

2 結(jié)果

2.1 陳皮黃酮類化合物鑒定及其靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)分析

2.1.1 陳皮主要黃酮類化合物鑒定 圖1中每個不同顏色的質(zhì)譜峰代表一種化學(xué)物質(zhì)(只展示QC的負(fù)離子模式)，通過UPLC-MS/MS本地?cái)?shù)據(jù)庫鑒定所測黃酮類化合物的相對含量，共獲得新會陳皮黃酮化合物197種，取相對含量前25%作為候選標(biāo)志物。

圖1 MRM代謝物檢測多峰圖(負(fù)離子模式)

2.1.2 候選化合物靶點(diǎn)預(yù)測 新會陳皮候選化合物中有50種相對含量較高(相對含量前25%)，包括5-羥基-3,7,3′,4′-四甲氧基黃酮，7,8-二羥基-5,6,4′-三甲氧基黃酮，高車前素-7-O-葡萄糖苷，金圣草黃素-8-C-葡萄糖苷(金雀花素)，山奈酚-3-O-新橙皮糖苷等。用CAS號在TCMSP和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中檢索化合物靶點(diǎn)，去重合并數(shù)據(jù)后，規(guī)范靶點(diǎn)基因名，得到有CAS號的39個化合物及其相關(guān)蛋白492個。導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0后，使用CentiScaPe 2.2插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)圖的中心“度”，見圖2。其中CAS 478-01-3(川陳皮素)、10236-47-2(柚皮素-7-O-新橙皮糖苷)、1245-15-4(5-羥基-3,7,3′,4′-四甲氧基黃酮)的度值較大分別為129、127、125。

注：藍(lán)色圓形代表化合物，大小代表度值大小；其中CAS 478-01-3(川陳皮素)、10236-47-2(柚皮素-7-O-新橙皮糖苷/柚皮苷)、1245-15-4(5-羥基-3,7,3′,4′-四甲氧基黃酮)的度值分別為129、127、125。

2.1.3 候選化合物靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 將預(yù)測的化合物靶向蛋白共492個導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫[15]，去除網(wǎng)絡(luò)圖譜中的單一節(jié)點(diǎn)后，用Cytoscape重構(gòu)靶向蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖3。選取壓力中心度前10(壓力大小表明這個分子參與細(xì)胞過程的重要性)的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵分子，分別為細(xì)胞腫瘤抗原(cellular tumor antigen p53，TP53，壓力144524.0)、原癌基因酪氨酸—蛋白激酶(proto-oncogene tyrosine-protein kinase，SRC，壓力126236.0)、熱休克蛋白(heat shock protein HSP90-alpha，HSP90-α，壓力113134.0)、有絲分裂原激活蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3，壓力80444.0)、有絲分裂原激活蛋白激酶1(MAPK1，壓力78814.0)、轉(zhuǎn)錄因子-1(transcription factor AP-1，JUN，壓力73930.0)、視黃酸受體(retinoic acid receptor RXR-alpha，RXRα，壓力72566.0)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-α serine/threonine-protein kinase，AKT1，壓力64714.0)、雌激素受體(estrogen receptor 1，ESR1，壓力62910.0)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，CDK1，壓力58386.0)。

注：藍(lán)色箭頭代表在該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中壓力中心度較大的10種蛋白。

2.2 陳皮黃酮類化合物網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.2.1 GO與KEGG富集分析 運(yùn)用R包c(diǎn)lusterProfiler對10個靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，包括生物過程(biological process, BP)、細(xì)胞組成(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)，用BH方法控制假陽性(BH<0.001),共獲得BP 207個，CC 4個，MF 13個，將各自的前5個條目繪制于表1。生物過程富集最顯著的是對DNA代謝過程的正調(diào)控、端粒酶活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、鎘離子反應(yīng)，細(xì)胞組成為小窩、質(zhì)膜筏、核染色質(zhì)、偽基質(zhì)，分子功能包含蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、磷酸酶結(jié)合、支架蛋白結(jié)合、磷蛋白結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合。

表1 GO注釋功能富集分析

KEGG分析(BH<0.001)共獲得92條通路，前10條KEGG通路為內(nèi)分泌抵抗、化學(xué)致癌—受體激活、脂質(zhì)和動脈硬化、甲狀腺激素信號傳導(dǎo)途徑、雌激素信號傳導(dǎo)途徑、乳腺癌、催乳素信號通路、乙型肝炎、非小細(xì)胞肺癌、ErbB信號傳導(dǎo)途徑。說明篩選出的10個靶點(diǎn)蛋白可能通過這些通路發(fā)揮藥理活性，改善疾病病理變化。見表2。

表2 KEGG信號通路富集結(jié)果

2.2.2 核心成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將3個重要成分，10個預(yù)測蛋白靶點(diǎn)和10個KEGG通路在Cytoscape中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，詳見圖4。

以Centiscape插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)圖的中心“度”值為參考，成分柚皮苷(Naringin)、川陳皮素 (Nobiletin)較5-羥基-3,7,3′,4′-四甲氧基黃酮(Retusin)有更高的“中心”度，AKT1、MAPK3、MAPK1、SRC 四個基因的度值均大于10(10～13)，對網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)聯(lián)通的貢獻(xiàn)度較其它基因更高。KEGG通路中化學(xué)致癌—受體激活通路(chemical carcinogenesis-receptor activation)和脂質(zhì)和動脈硬化通路(lipid and atherosclerosis)的度值均為8，較其它通路高。

注：藍(lán)色V形代表化學(xué)成分、青色矩形代表關(guān)鍵靶點(diǎn)、綠色橢圓代表KEGG通路，節(jié)點(diǎn)大小代表度值大小。Nobiletin：川陳皮素；Naringin：柚皮苷；Retusin ：5-羥基-3,7,3′,4′-四甲氧基黃酮。

2.2.3 核心靶點(diǎn)組織分布 從The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫[17]下載基于免疫組化的組織微陣列的人類組織蛋白質(zhì)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選AKT1、MAPK3、MAPK1、SRC四種蛋白組織表達(dá)數(shù)據(jù)，共獲取277項(xiàng)表達(dá)數(shù)據(jù)。用Cytoscape整理核心靶點(diǎn)組織表達(dá)數(shù)據(jù)，見圖5。AKT1在85種組織中檢測到，MAPK3在81種組織中檢測到，MAPK1在81種組織中檢測到，SRC在30種組織中檢測到。度值最大的分別為大腦皮層(cerebral cortex)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中(glial cells)、皮膚1(skin 1)中的黑色素細(xì)胞(melanocytes)、睪丸(testis)精管中的細(xì)胞(cells in seminiferous ducts)。

2.3 陳皮黃酮類化合物分子對接靶點(diǎn)分析及文獻(xiàn)檢索

2.3.1 黃酮類化合物分子關(guān)鍵靶點(diǎn)及其配體結(jié)構(gòu)獲取 從PDB數(shù)據(jù)庫中選擇辨析度較高的晶體結(jié)構(gòu)作為AKT1、MAPK3、MAPK1、SRC四種蛋白的3-D結(jié)構(gòu)，依次為1h10、4qtb、6slg、2hb8。下載PDB格式文件后，用Autodock分離蛋白中的配體，作為對照化合物，見表3。柚皮苷(Naringin)、川陳皮素(Nobiletin)的分子結(jié)構(gòu)(Mol2格式)從ZINC數(shù)據(jù)庫下載。

注：黃色圓形代表核心基因、綠色圓形代表人體組織或器官，節(jié)點(diǎn)大小代表度值大小，連線的粗細(xì)表示蛋白表達(dá)在組織中的高、中、低3個層次。AKT1：RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；MAPK3：有絲分裂原激活的蛋白激酶3；MAPK1：有絲分裂原激活的蛋白激酶1；SRC：原癌基因酪氨酸蛋白激酶。

表3 靶點(diǎn)—對照化合物信息

2.3.2 分子對接 用AutoDock Tools 4.2.6對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行去水分子、加氫、加電荷預(yù)處理。通過AutoDock Vina實(shí)現(xiàn)配體與受體的分子對接計(jì)算，獲得結(jié)合能后，將配體各構(gòu)象與蛋白的最低結(jié)合能數(shù)據(jù)列于表4。

表4 受體與配體結(jié)合的吉布斯自由能

“廣陳皮”已被列入《中華人民共和國藥典(一部)》，橙皮苷、川陳皮素和橘皮素作為質(zhì)量檢測物質(zhì)用于控制藥材與飲片質(zhì)量。因此，本文只用Pymol 2.5軟件展示柚皮苷分子對接結(jié)果，結(jié)合位點(diǎn)用籠型球體標(biāo)注可能的氫鍵位置，見圖6。

圖6 柚皮苷與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合

柚皮苷、川陳皮素與AKT1、MAPK3、MAPK1的結(jié)合能均較與蛋白相結(jié)合的原有化合物的結(jié)合能更低，而與SRC的結(jié)合能較標(biāo)準(zhǔn)物高。柚皮苷與SRC的結(jié)合能是-7.7 kcal/mol，川陳皮素與SRC的結(jié)合能是-7.4 kcal/mol。一般而言，結(jié)合能值小于-4.0 kcal/mol時(shí)，表明配體有較強(qiáng)的生物活性[20-21]。因此柚皮苷、川陳皮素和AKT1、MAPK3、MAPK1及SRC的結(jié)合在自由能預(yù)測上效果較好。

2.3.3 柚皮苷、川陳皮素有效性佐證 新會陳皮中黃酮類化合物的藥效作用可以通過文獻(xiàn)佐證(見表5)。文獻(xiàn)中柚皮苷在呼吸道、神經(jīng)細(xì)胞、肺部、心血管、皮膚、睪丸等組織中均有發(fā)揮作用，川陳皮素在腸、卵巢、胎膜和子宮、皮膚、心臟、神經(jīng)和睪丸等組織中發(fā)揮作用，與柚皮苷、川陳皮素的活性作用的4個主要靶點(diǎn)的組織分布相一致。

AKT1調(diào)控途徑的破壞與癌癥、糖尿病、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[38-40]，其在多種細(xì)胞信號機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，涉及細(xì)胞代謝、生長和分裂、細(xì)胞凋亡抑制和血管生成。MAPK3和MAPK1屬于有絲分裂原激活蛋白激酶，是調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過程的關(guān)鍵信號通路，包括增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)[41]。SRC家族激酶是一個非受體蛋白酪氨酸激酶家族，它們在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)各種細(xì)胞生物過程中至關(guān)重要，如增殖、分化和凋亡[42]。

新會陳皮中“主要”黃酮類化合物靶向的重要通路是化學(xué)致癌—受體激活通路及脂質(zhì)和動脈硬化通路。非基因毒性化合物致癌過程需要細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)受體的參與，通過激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致包括基因轉(zhuǎn)錄在內(nèi)的生化反應(yīng)。該通路信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)與癌癥有關(guān)。而脂質(zhì)和動脈硬化通路的改變與多數(shù)心血管疾病及其并發(fā)癥的發(fā)生有關(guān)，包括冠狀動脈疾病、心肌梗塞和中風(fēng)等疾病。柚皮苷和川陳皮素的核心靶向通路與細(xì)胞生長、分裂、脂類代謝相關(guān)。此外，脂質(zhì)代謝失調(diào)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和紊亂十分重要[43]，而且大量與脂質(zhì)代謝有關(guān)的分子突變被認(rèn)為與運(yùn)動神經(jīng)元退行性疾病有關(guān)[44]。因此，脂質(zhì)和動脈硬化通路與柚皮苷、川陳皮素對神經(jīng)的保護(hù)作用直接相關(guān)。

3 討論

陳皮在古方劑中被廣泛應(yīng)用并一直沿用至今。如《本草綱目》載：“其治百病，總是取其理氣燥濕之功，同補(bǔ)藥則補(bǔ)，同瀉藥則瀉，同升藥則升，同降藥則降?！爆F(xiàn)代處方主要用于呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管疾病和婦科疾病等[45-46]。新會陳皮作為陳皮中的特殊地理品種有其獨(dú)特的藥理作用，《新會鄉(xiāng)土志》記載：“柑皮之獨(dú)可入藥，為他地所不及”，而清代名醫(yī)葉天士所開的“二陳湯”注明只用“新會皮”，因此有必要深入研究其化學(xué)成分的藥理作用。

本研究測得新會陳皮中黃酮類化合物共197種，由于中藥量效關(guān)系尚未形成完整的理論體系[47]，本研究取相對含量前25%，共39種黃酮化合物作為研究對象，以排除可能“不夠量”的活性成分干擾，明晰可發(fā)揮藥效的化學(xué)成分。同時(shí)，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)共獲得39種黃酮化合物的492個靶蛋白，在核心成分與核心靶點(diǎn)存在互作關(guān)系的前提下，通過構(gòu)建核心成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖，從而辨別新會陳皮的質(zhì)量標(biāo)志物，這樣的思路與大部分中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究不同。首先，依賴現(xiàn)有成分(化合物)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫信息篩選靶點(diǎn)最多的化合物一共三個(圖2)，作為成分集合A；其次，將含量前25%的黃酮成分的所有靶點(diǎn)構(gòu)建成一個PPI網(wǎng)絡(luò)，由于PPI網(wǎng)絡(luò)的壓力中心度與該蛋白參與的細(xì)胞過程的重要性高度相關(guān)，因此我們選取壓力中心度最高的十個蛋白作為一個靶點(diǎn)集合B(圖3)，該集合中的靶點(diǎn)是新會陳皮行使生物學(xué)功能的核心靶蛋白；最后，當(dāng)集合A的成分和集合B的蛋白有相互作用時(shí)，才能構(gòu)建出核心成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)(圖4)，該網(wǎng)絡(luò)的可生成預(yù)示著這些基因與抗氧化、抗腫瘤、抗炎、祛痰、平喘、促消化、降脂、保肝、心肌保護(hù)等多種藥理作用相關(guān)，其作用機(jī)制可能源于三個度值最高的化學(xué)成分(常規(guī)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)僅依賴圖2中的度值確定質(zhì)量標(biāo)志物)。

此外，依據(jù)網(wǎng)絡(luò)中心度的概念，在核心成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)一步確定陳皮素、柚皮苷和AKT1、MAPK3、MAPK1、SRC四個靶蛋白為新會陳皮關(guān)鍵成分與靶點(diǎn)，其富集的相應(yīng)高度值通路為化學(xué)致癌—受體激活及脂質(zhì)和動脈硬化通路。除SRC在30種組織中檢測到外，AKT1、MAPK3、MAPK1可以在人體80余種組織中有較高的表達(dá)量(圖5)，預(yù)示柚皮苷和川陳皮素的功效較為廣泛，這一點(diǎn)和陳皮配伍成方劑可治療多種組織疾病一致[48]，也與文獻(xiàn)檢索結(jié)果一致(表5)。分子對接從數(shù)據(jù)模擬上驗(yàn)證了川陳皮素、柚皮苷與四個核心靶點(diǎn)的結(jié)合能力(圖6)， 揭示了其對疾病的可能干預(yù)機(jī)制，這一點(diǎn)同樣與文獻(xiàn)檢索數(shù)據(jù)一致(表5)。但是，該研究也存在一些網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究存在的共性問題，例如成分與靶點(diǎn)的互作信息來源與數(shù)據(jù)庫有關(guān)。如果能用人工智能模擬成分與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)之間在三維空間上的相互作用[49]，進(jìn)而無約束的預(yù)測化合物的相應(yīng)靶點(diǎn)，不僅可對未收入數(shù)據(jù)庫的成分和靶點(diǎn)進(jìn)行分析，且可降低數(shù)據(jù)庫對成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中的中心度值影響，這對于今后進(jìn)一步闡明新會陳皮藥理作用機(jī)制，篩選其中的質(zhì)量標(biāo)志物具有重要意義。

表5 質(zhì)量標(biāo)志物文獻(xiàn)信息

總之，本文預(yù)測新會陳皮黃酮類化合物質(zhì)量標(biāo)志物為川陳皮素和柚皮苷，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了川陳皮素和柚皮苷的作用機(jī)制及作用位置，同時(shí)耦合文獻(xiàn)檢索證據(jù)檢驗(yàn)了川陳皮素和柚皮苷的生物效應(yīng)，可為新會陳皮黃酮類成分質(zhì)量標(biāo)志物奠定工作基礎(chǔ)。