別玉龍 宋博策 謝蓓莉 劉明旺 史大卓 趙福海

肝臟是脂肪轉化、代謝的重要場所，當循環(huán)中血脂升高之后，大量脂質在肝臟實質細胞內沉積，導致肝細胞發(fā)生脂肪變性，形成大量脂滴，進一步加劇炎癥反應和氧化應激損傷，加劇肝細胞損傷，導致肝臟功能異常[1]。肝脂酶(hepatic lipase，LIPC)屬于脂肪分解酶家族成員，由肝細胞合成分泌，參與甘油三酯和磷脂的水解過程[2]。同時LIPC位于肝細胞及肝內皮細胞表面，能夠促進高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein, HDL-c)及載脂蛋白-B的攝取，調節(jié)肝臟脂肪代謝。研究證明，LIPC與動脈粥樣硬化及冠心病等代謝疾病關系密切[3-4]。

莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物是從中藥莪術中發(fā)現(xiàn)的一種新的活性成分。前期研究發(fā)現(xiàn)，莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物具有保護血管內皮細胞、抗氧化應激損傷等作用[5]。但莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物是否具有調節(jié)脂質代謝、保護肝臟中的作用，尚缺少報道。因此，本研究觀察莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對高脂飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠血脂、肝臟脂質沉積及肝功能的影響，為其臨床轉化應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物 SPF級雄性ApoE-/-小鼠30只，同源雄性C57/BL小鼠10只，體質量(20±2)g，北京維通利華公司提供，合格證書號：SYKX(京)2016-0006。實驗方案獲得西苑醫(yī)院動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑及儀器

試劑：莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物，由中國科學院大連化學物理研究所提供。改良蘇木素—伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)試劑盒(批號：9161033)、飽和油紅O染色液(北京索萊寶生物科技有限公司，批號：410K034)；兔抗LIPC抗體(北京博奧森生物技術有限公司，批號：AG03292292)；羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：200061221)；谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST/GOT)測試盒(批號：20201219)、堿性磷酸酶(alanine aminotransferase,AKP)測試盒(批號：20201222)、谷丙轉氨酶(alkaline phosphatase,ALT/GPT)測試盒(批號：20201218)，均購自南京建成生物工程研究所；高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒(批號：201361)、低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒(批號：201441)、甘油三酯測定試劑盒(批號：198021)、膽固醇測定試劑盒(批號：192061)，均購自北京中生北控生物科技股份有限公司；其他試劑為國產分析純。

儀器：多功能酶標儀(美國 biotek公司，型號：synergy2，分析軟件：gen 5)；冰凍切片機(美國Thermo公司，型號：Cryotom e)；全景掃描顯微鏡(日本 Olympus公司，型號：VS120)。

1.3 動物分組與給藥

動物適應性喂養(yǎng)1周后，將ApoE-/-小鼠隨機分為模型組、倍半萜組和阿托伐汀治療組，每組各10只，給予高脂飲食(膽固醇3%、膽酸鈉0.5%、蛋黃粉6%、白糖4%、豬油18%、丙基硫氧嘧啶0.3%、標準飼料68.2%)。正常對照組為同源C57/BL6 小鼠10只，給予普通飼料。小鼠自由飲食、水，明、暗光交替12小時，恒溫、恒濕環(huán)境喂養(yǎng)。倍半萜組小鼠給予10 mg/kg劑量生理鹽水混懸，灌胃；阿托伐汀治療組給予10 mg/kg劑量生理鹽水混懸，灌胃；正常對照組、模型組小鼠給予等體積的生理鹽水灌胃。各組小鼠每天灌胃給藥一次，連續(xù)給藥12周后取材、處死。

1.4 檢測指標

實驗12周后，4%水合氯醛以0.10 mL/10 g腹腔注射麻醉，固定，打開腹腔，取出肝左外葉，置于4%多聚甲醛固定液中，4℃，24小時充分固定，梯度蔗糖水溶液(10%～30%)脫水，使用OCT冷凍包埋，冰凍切片機切片，厚度為6 μm。

1.4.1 HE染色 切片置于蒸餾水中洗滌10分鐘，蘇木素染色液染色5分鐘，弱酸分化1分鐘，氨水返藍處理2分鐘，伊紅染液染色5分鐘，95%～100%梯度酒精脫水，二甲苯透明1分鐘，2次；中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察肝臟結構并記錄。

1.4.2 油紅O染色 切片置于蒸餾水中洗滌10分鐘；油紅O染液染色15分鐘；60%異丙醇分化5秒后去除雜色；蒸餾水洗滌5分鐘；Mayer蘇木素染色液染色5分鐘，復染細胞核；蒸餾水充分洗滌2分鐘；氨水返藍處理2分鐘，蒸餾水洗滌2分鐘；甘油明膠封片，光學顯微鏡下觀察脂肪滴面積，拍照記錄，每張切片取三個不同視野求平均值，每組取3只小鼠進行分析，Image-Pro plus 6.0軟件分析肝臟脂肪滴占細胞面積比例。

1.4.3 LIPC免疫組織化學染色 切片置于PBS緩沖液洗滌10 分鐘， 3%過氧化氫溶液封閉10 分鐘，10%山羊血清室溫封閉1小時，一抗(1∶200)4℃，12小時，PBS緩沖液洗滌5 分鐘，3次，二抗(1∶200)室溫孵育1小時，PBS緩沖液洗滌5分鐘，3次，DAB顯色液顯色2分鐘，蘇木素染色5分鐘，蒸餾水洗滌，95%～100%梯度酒精脫水，二甲苯透明1分鐘，2次，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察LIPC蛋白表達情況，拍照。每張切片取三個不同視野，每組取3只小鼠進行分析，Image-Pro plus 6.0軟件分析肝臟LIPC表達情況。

1.4.4 血脂、肝功能檢測 小鼠麻醉后主動脈取血，離心取血清，使用中生北控試劑盒進行檢測，酶標儀檢測，具體流程按照說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對小鼠體質量的影響

各組小鼠體質量結果見表1。與入組第1周相比，各組小鼠在第5周后體質量均增加明顯(P<0.01)；與第5周相比，模型組和倍半萜治療組小鼠體質量增加明顯(P<0.05，P<0.01)，空白對照組和阿托伐他汀組小鼠體質量增加不明顯(P>0.05)；和第7周相比，正常對照組和阿托伐他汀組小鼠體質量增加明顯(P<0.01，P<0.05)，倍半萜組和模型組體質量無明顯增加(P>0.05)。各組小鼠體質量同時點相比沒有統(tǒng)計差異(P>0.05)。

表1 莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對小鼠體質量的影響

2.2 莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對小鼠血脂水平的影響

各組小鼠血脂水平見表2。與正常對照組相比，模型組小鼠甘油三酯(triacylglycerol, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-c)明顯增加(P<0.01)，HDL-c明顯下降(P<0.01)；與模型組相比，倍半萜組和阿托伐他汀組TC、LDL-c明顯下降(P<0.01)。

表2 莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對小鼠血脂水平的影響

2.3 莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對小鼠肝臟脂肪滴沉淀的影響

油紅O染色結果見圖1和表3。正常對照組小鼠肝臟切片僅有少量脂肪沉積，肝細胞致密排列整齊；與正常對照組相比，模型組小鼠肝臟脂肪滴占細胞總面積比例明顯升高(P<0.05)，肝細胞稀疏，排列紊亂；與模型組相比，倍半萜治療組小鼠肝臟脂肪滴細胞總面積比例明顯減少(P<0.05)，部分區(qū)域細胞排列紊亂情況有所恢復。阿托伐他汀組小鼠肝臟切片顯示存在大量脂肪滴，細胞間隙增大，排列紊亂。

注： A正常對照組；B模型組；C倍半萜組；D阿托伐他汀組。圖中紅色顆粒為脂肪滴，藍色為細胞核。

表3 莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對小鼠肝臟脂肪沉積的影響

2.4 莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對小鼠肝細胞損傷的影響

HE染色觀察莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對小鼠肝細胞損傷影響，結果顯示：正常對照組小鼠肝臟肝竇區(qū)細胞排列緊密，成條索樣分布，結構清晰。模型組小鼠肝臟細胞稀疏，結構紊亂，大量肝細胞呈典型的“氣球樣”改變。倍半萜治療組小鼠肝臟組織中部分區(qū)域紊亂明顯恢復。阿托伐他汀組小鼠肝臟細胞稀疏，肝竇結構紊亂加劇。見圖2。

2.5 莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對小鼠肝臟LIPC蛋白表達的影響

免疫組化法觀察莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對小鼠肝臟LIPC蛋白表達的影響，結果顯示：與正常對照組小鼠相比，模型組小鼠肝臟LIPC表達明顯降低(P<0.05)。和模型組相比，倍半萜干預后LIPC表達明顯升高(P<0.05)。見圖3、表4。

注：A正常對照組；B模型組；C倍半萜組；D阿托伐他汀組。箭頭表示肝細胞氣球樣變。

注： A 正常對照組；B 模型組；C 倍半萜組；D 阿托伐他汀組。圖中棕色顆粒為LIPC，藍色為細胞核。

表4 莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對小鼠肝臟LIPC表達的影響

2.6 莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對小鼠肝功能的影響

各組小鼠ALT、ALP、AST表達水平見表5。與正常對照組相比，模型組小鼠ALT、AST、ALP水平升高明顯(P<0.01，P<0.05)。與模型組比較，倍半萜組小鼠ALT、AST均明顯下降(P<0.01)，阿托伐他汀組小鼠以上指標均無統(tǒng)計學意義。

表5 莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜對小鼠肝功能的影響

3 討論

莪術為活血破瘀藥，具有行氣破血、消積止痛的功效，常用于胸痹心痛、飲食積滯、脘腹脹滿等的治療。莪術中包括姜黃素、莪術醇、β-欖香烯等多種活性成分[6]，研究發(fā)現(xiàn)莪術醇具有降低肝指數、血清ALT、AST活性，保護肝細胞，抑制轉化生長因子β1發(fā)揮抑制肝臟纖維化的作用[7]；舒泳翔等[8]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠抑制炎癥因子釋放，抑制肝細胞凋亡。本課題組從莪術中分離出來一種新型莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物，其結構與姜黃素、莪術醇、β-欖香烯不同，同時發(fā)現(xiàn)該成分能抑制支架內再狹窄，有良好的保護血管內皮細胞和抑制血管平滑肌細胞增殖的作用[9-10]。此外，進一步研究發(fā)現(xiàn)還具有抗氧化活性，能夠保護氧化應激損傷導致的內皮細胞凋亡[5]。

為進一步明確莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物調節(jié)脂質代謝，抑制肝臟脂肪變性的作用機制，本實驗觀察了莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對高脂飼料ApoE-/-小鼠血脂水平和肝臟病理變化的影響。在此基礎上觀察了莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對肝功能及肝臟脂肪代謝關鍵酶LIPC蛋白表達的影響。結果表明，該成分能明顯降低TC和LDL-c、ALT、AST含量；油紅O染色結果顯示莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物能夠抑制肝臟細胞內脂肪滴形成；HE染色結果發(fā)現(xiàn)莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物干預后肝臟組織結構有所恢復，說明該化合物能夠降低高脂飲食誘導的小鼠血清水平，抑制肝細胞脂肪變性，同時能夠保護肝細胞，促進肝功能恢復。為了進一步研究莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物調節(jié)脂代謝的機制，課題組采用免疫組化染色方法檢測肝臟組織中LIPC蛋白表達，發(fā)現(xiàn)莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物能夠明顯提高肝細胞中LIPC蛋白的表達。LIPC的高表達能夠促進TC和TG分解代謝，提高脂蛋白攝取，調節(jié)脂代謝紊亂。本實驗也發(fā)現(xiàn)在莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物干預后小鼠肝臟組織中LIPC蛋白表達升高。因此LIPC可能是其發(fā)揮調解脂質代謝、減輕肝臟脂肪變性的一個潛在的靶點。綜上，莪術愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物是一種較好的具有調節(jié)脂質代謝，保護肝臟功能的新成分，具有進一步研發(fā)價值。