錢唐亮 張玉婷 侯秀娟 劉小平 鄭煒 康天倫 王海瑜

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性、侵襲性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫疾病，30至50歲為其發(fā)病高峰[1]。根據(jù)發(fā)病年齡可將其分為兩類，其中青年發(fā)病并遷延至老年的RA患者稱為青壯年發(fā)病類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(younger onset rheumatoid arthritis，YORA)；60歲及以后發(fā)病的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，稱為老年期發(fā)病類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(elderly onset rheumatoid arthritis，EORA)[2]。EORA相比于YORA往往發(fā)病更急，關(guān)節(jié)腫脹的臨床癥狀更加嚴(yán)重。在治療上，EORA相比于YORA對(duì)抗風(fēng)濕藥物的耐藥性差，需要更多的聯(lián)合用藥[3-4]，這就增加了老年患者本已不佳的身體負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)在許多臨床研究發(fā)現(xiàn)了中醫(yī)藥在RA治療中發(fā)揮著重要的作用[5]。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)加味芍甘附子湯在改善RA患者的關(guān)節(jié)功能和生活質(zhì)量方面療效確切[6]，其主要通過調(diào)節(jié)Egr2為核心的炎性通路而達(dá)到免疫調(diào)節(jié)作用[7]。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討加味芍甘附子湯對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)老年鼠早期生長反應(yīng)蛋白2(early growth response protein 2，Egr2)表達(dá)及其下游炎癥因子的影響，比較EORA與YORA臨床特征差異化的內(nèi)在機(jī)理，探索RA群體的治療方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雌性Wistar大鼠96只，其中青年鼠[3～4月齡，體質(zhì)量(256.9±12.7)g]48只，老年鼠[12～13月齡，體質(zhì)量(391.15±58.5)g]48只，均購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

加味芍甘附子湯：白芍15 g、制附子15 g、雞血藤15 g、甘草10 g、青風(fēng)藤15 g(以上藥物由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一采購)，全部藥材經(jīng)煎煮、過濾、水浴蒸發(fā)至每mL藥液含生藥材1.42 g。雷公藤多苷片(湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司，規(guī)格：10 mg，生產(chǎn)批號(hào)：6936492500053)，用蒸餾水配制為1 mg/mL。

1.3 主要儀器及試劑

牛Ⅱ型膠原(美國Chondrex公司)；不完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)；TRIZOL(Invitrogen，型號(hào)10296028)；UltraPure Agarose(ABI-invitrogen，型號(hào)16500100)；SuperScript III RT 反轉(zhuǎn)錄kit(ABI-invitrogen)；高速分散器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(21RTHERMO)；核酸濃度測(cè)定儀(THERMO)；qPCR儀(美國Applied biosystems)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組及給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分別將老年鼠與青年鼠分成正常組、模型組、對(duì)照組、中藥組，每組各12只。正常組常規(guī)飼養(yǎng)，其余3組復(fù)制CIA大鼠模型后分別給予生理鹽水、雷公藤多苷片及加味芍甘附子湯灌胃4周，每日灌胃劑量：雷公藤多苷片6.25 mg/kg，加味芍甘附子湯12.5g /kg，生理鹽水0.2 mL/kg。每周評(píng)價(jià)各組大鼠關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)(arthritis index，AI)。

1.4.2 復(fù)制CIA大鼠模型 CIA模型根據(jù)徐淑云《藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法》，將牛Ⅱ型膠原溶于乙酸，與等量完全弗氏佐劑溶液混合，制備牛Ⅱ型膠原終濃度2 mg/mL混合物。將上述混合物置于15 mL離心管并垂直置于冰水中，離心管置于高速分散器下，以1 000～3 000 r/分鐘攪拌2分鐘，暫停30秒冷卻，避免高速分散器轉(zhuǎn)頭攪拌過程中產(chǎn)熱導(dǎo)致蛋白變性，并反復(fù)數(shù)次使蛋白充分乳化。期間檢驗(yàn)蛋白乳化情況，即用針頭挑取一滴混合物滴入水中不散，形成“油包水”狀。隨后按每只0.1 mL于大鼠左足及尾根部多點(diǎn)真皮內(nèi)注射。壓迫注射部位使乳化物完全吸收。7天后以相同方法和相同劑量在大鼠尾根部皮內(nèi)加強(qiáng)免疫一次。根據(jù)AI評(píng)分剔除模型不成功的大鼠。每組剔除4只，剩余8只。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 AI評(píng)分 根據(jù)大鼠四肢各肢體腫脹程度及個(gè)數(shù)累計(jì)積分，以AI評(píng)分≥4分判定為模型復(fù)制成功，每周評(píng)價(jià)1次。AI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無關(guān)節(jié)紅腫；1分，小趾關(guān)節(jié)腫脹；2分，趾關(guān)節(jié)及足跖關(guān)節(jié)腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹；4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。AI評(píng)分最高分為16分。

1.5.2 組織病理學(xué)檢測(cè) 每組隨機(jī)選取2只大鼠，根據(jù)大鼠體質(zhì)量每100 g給予0.3 mL 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剝離大鼠后肢的關(guān)節(jié)外周組織，使膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)充分暴露，保留好關(guān)節(jié)囊，以膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)為中心，用骨鉗剪斷關(guān)節(jié)上下約0.5 cm，迅速放入0.4%的甲醛中固定。后期進(jìn)行免疫組化及蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色制作切片，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.5.3 外周血白細(xì)胞介素-17A檢測(cè) 取大鼠腹主動(dòng)脈血清，采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)、細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、干擾素-γ(interferon-γ，INF-γ)，根據(jù)試劑盒說明操作。

1.5.4 膝關(guān)節(jié)滑膜Egr2 mRNA表達(dá)情況 取膝關(guān)節(jié)滑膜組織置于液氮中保存，按照TRIzol使用說明書進(jìn)行總RNA提?。话凑辗崔D(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；每個(gè)樣本分別用待檢測(cè)基因和內(nèi)參基因引物擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)重復(fù)；統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)量；引物均在北京Invitrogen公司合成，見表1。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 AI評(píng)分

給藥期間，各組老年鼠AI評(píng)分均降低。給藥1周和2周時(shí)，中藥組與模型組AI評(píng)分比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥3周和4周時(shí)，對(duì)照組和中藥組AI評(píng)分均低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且中藥組AI評(píng)分低于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 老年鼠各組CIA大鼠給藥期間AI評(píng)分比較

給藥期間，各組青年鼠AI評(píng)分均降低。給藥1周和2周時(shí)，對(duì)照組和中藥組AI評(píng)分均低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥3周和4周時(shí)，對(duì)照組和中藥組AI評(píng)分均低于模型組(P<0.05)，且中藥組AI評(píng)分低于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表3 青年鼠各組CIA大鼠給藥期間AI評(píng)分比較

2.2 組織病理學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示，老年鼠及青年鼠正常組的踝關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)和滑膜組織正常。老年鼠模型組的關(guān)節(jié)腔明顯狹窄，滑膜組織增生明顯，大量滑膜細(xì)胞增生及炎性細(xì)胞浸潤，局部壞死脫落。青年鼠模型組的關(guān)節(jié)腔可見明顯狹窄，滑膜組織明顯增厚，少量炎性細(xì)胞浸潤，局部壞死脫落。老年鼠對(duì)照組可見關(guān)節(jié)腔狹窄，滑膜組織增厚，較多滑膜細(xì)胞增生及炎性細(xì)胞浸潤。青年鼠對(duì)照組關(guān)節(jié)腔輕度狹窄，關(guān)節(jié)面光滑，滑膜組織原纖維增生，少量炎性細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)面局部血管翳侵入。老年鼠中藥組關(guān)節(jié)腔未見明顯狹窄，滑膜細(xì)胞輕微增生，少量炎性細(xì)胞浸潤。青年鼠中藥組關(guān)節(jié)腔未見明顯狹窄，滑膜組織增生增厚，滑膜膠原纖維增生明顯，少量炎性細(xì)胞浸潤。見圖1～4。

注：A 正常組；B 模型組；C 對(duì)照組；D 中藥組。

注：A 正常組；B 模型組；C 對(duì)照組；D 中藥組。

注：A 正常組；B 模型組；C 對(duì)照組；D 中藥組。

注：A 正常組；B 模型組；C 對(duì)照組；D 中藥組。

2.3 滑膜組織Egr2 mRNA表達(dá)水平

與老年鼠正常組比較，老年鼠模型組、對(duì)照組、中藥組滑膜組織Egr2 mRNA的表達(dá)水平增高(P<0.05)；與老年模型組比較，老年鼠對(duì)照組和中藥組滑膜組織Egr2 mRNA的表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)。與青年鼠正常組比較，青年鼠模型組、對(duì)照組、中藥組滑膜組織Egr2 mRNA表達(dá)水平增高(P<0.05)；與青年鼠模型組比較，青年鼠對(duì)照組滑膜組織Egr2 mRNA表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)。老年鼠模型組滑膜組織Egr2 mRNA表達(dá)水平低于青年鼠的模型組(P<0.05)，老年鼠中藥組滑膜組織Egr2 mRNA表達(dá)水平高于青年鼠中藥組(P<0.05)。見表4。

表4 各組CIA大鼠滑膜組織Egr2 mRNA表達(dá)水平比較

2.4 外周血炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平

與老年鼠正常組比較，老年鼠模型組外周血IL-17A、INF-γ、IL-6的表達(dá)水平增高(P<0.05)；與老年鼠模型組比較，老年鼠對(duì)照組和中藥組的外周血IL-17A的表達(dá)水平降低(P<0.05)，老年鼠對(duì)照組的外周血INF-γ、IL-6的表達(dá)水平降低(P<0.05)；與老年鼠對(duì)照組比較，老年鼠中藥組的外周血IL-17A的表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表5。

表5 老年鼠各組CIA大鼠外周血IL-17A、INF-γ、IL-6水平比較

與青年鼠正常組比較，青年鼠模型組外周血IL-17A、INF-γ、IL-6的表達(dá)水平增高(P<0.05)；與青年鼠模型組比較，青年鼠對(duì)照組和中藥組外周血IL-17A、INF-γ的表達(dá)水平降低(P<0.05)，青年鼠對(duì)照組外周血IL-6的表達(dá)水平降低(P<0.05)；與青年鼠對(duì)照組比較，青年鼠中藥組外周血IL-17A的表達(dá)水平增高(P<0.05)。見表6。

表6 青年鼠各組CIA大鼠外周血IL-17A、INF-γ、IL-6水平比較

老年鼠與青年鼠外周血炎性細(xì)胞因子水平比較，老年鼠模型組外周血IL-17A的表達(dá)水平明顯高于青鼠模型組(P<0.05)，老年鼠對(duì)照組外周血IL-17A的表達(dá)水平明顯高于青鼠對(duì)照組，老年鼠對(duì)照組外周血IL-6的表達(dá)水平明顯低于青鼠的對(duì)照組(P<0.05)，老年鼠中藥組外周血IL-17A的表達(dá)水平明顯低于青年鼠中藥組(P<0.05)。見表7。

表7 老年鼠與青年鼠各組CIA大鼠外周血IL-17A、INF-γ、IL-6水平比較

3 討論

有研究表明EORA患者的血沉和C反應(yīng)蛋白均高于YORA[8]，且受IL-6、IL-17A等炎性因子的影響。相比于YORA患者，EORA患者往往發(fā)病更急，且關(guān)節(jié)腫脹的臨床癥狀更加嚴(yán)重，可能與人體衰老而導(dǎo)致的機(jī)體炎癥相關(guān)[9]。目前關(guān)于EORA差異于YORA臨床表現(xiàn)的發(fā)病機(jī)理尚不明確，對(duì)該群體的特征化治療還在不斷的探索中。中醫(yī)藥治療老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提倡從整體出發(fā)，兼顧老年人脾腎虧虛、正氣不足的生理特點(diǎn)，靈活辨證，從而改善臨床癥狀，降低實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，達(dá)到緩解病情，改善預(yù)后的目的，臨床應(yīng)用價(jià)值較高。

加味芍甘附子湯是在《傷寒論》芍甘附子湯基礎(chǔ)上加用藤類藥物雞血藤、青風(fēng)藤，諸藥合用共奏溫經(jīng)散寒、通絡(luò)止痛之功效，臨床常用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎寒濕痹阻型的患者。多個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)寒濕痹阻證在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎各個(gè)證型中占首位[10-12]。本課題組前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，加味芍甘附子湯聯(lián)合傳統(tǒng)抗風(fēng)濕藥能夠改善RA患者關(guān)節(jié)疼痛、晨僵等癥狀，改善RA疾病活動(dòng)度評(píng)分和中醫(yī)證候評(píng)分，降低血沉、C反應(yīng)蛋白等炎性指標(biāo)，在研究過程中還發(fā)現(xiàn)該方不會(huì)引起患者肝腎功能異常[13]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明加味芍甘附子湯可抑制CIA老年大鼠的炎性因子IL-17A與IL-6的表達(dá)，從而對(duì)減緩其關(guān)節(jié)及肺臟組織炎癥方面有良好的效果[14]，且Egr2在CIA模型鼠的中藥中劑量組中高表達(dá)[15]，這也為本次實(shí)驗(yàn)中藥劑量的選擇提供了基礎(chǔ)。前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)加味芍甘附子湯聯(lián)合傳統(tǒng)抗風(fēng)濕藥通過調(diào)節(jié)Egr2為核心的炎性通路而達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的功效，從而抑制了炎性因子IFN-γ、IL-17A、IL-6的表達(dá)，達(dá)到抑制RA寒濕痹阻證患者的炎性反應(yīng)，延緩病情的作用[16]。

本研究結(jié)果顯示，加味芍甘附子湯可降低CIA老年鼠和青年鼠的AI評(píng)分，且在4周后中藥組的評(píng)分最低，提示加味芍甘附子湯可有效減輕關(guān)節(jié)腫脹。各組大鼠組織病理學(xué)提示除正常組外，均有滑膜組織增生及炎性細(xì)胞浸潤，老年鼠模型組的炎性細(xì)胞浸潤明顯重于青年鼠模型組，且中藥組都明顯輕于模型組，提示加味芍甘附子湯可顯著抑制CIA大鼠的促炎作用，控制疾病進(jìn)展。老年鼠和青年鼠滑膜組織Egr2的組內(nèi)比較均顯示對(duì)照組和中藥組的表達(dá)高于模型組，說明加味芍甘附子湯和雷公藤多苷可上調(diào)滑膜組織Egr2的表達(dá)。老年鼠與青年鼠滑膜組織Egr2的組間比較顯示，老年鼠模型組的滑膜組織Egr2的表達(dá)明顯低于青年鼠模型組，而老年鼠中藥組的滑膜組織Egr2的表達(dá)明顯高于青年中藥組，說明老年鼠的發(fā)病更重可能與Egr2的低表達(dá)相關(guān)，加味芍甘附子湯可以上調(diào)Egr2的表達(dá)，且在老年鼠更加突出。老年鼠與青年鼠炎性細(xì)胞因子的組內(nèi)表達(dá)顯示，老年鼠中藥組的IL-17A表達(dá)低于模型組與對(duì)照組，青年鼠中藥組的IL-17A、IFN-γ表達(dá)低于模型組，但高于對(duì)照組，說明加味芍甘附子湯可抑制CIA青年鼠和老年鼠外周血炎癥因子的表達(dá)，且對(duì)IL-17A抑制更顯著。老年鼠與青年鼠外周血炎性細(xì)胞因子的組間比較顯示，老年鼠模型組及對(duì)照組外周血IL-17A的表達(dá)均高于青年鼠，而老年鼠中藥組的表達(dá)低于青年鼠，說明加味芍甘附子湯抑制CIA老年鼠外周血IL-17A的表達(dá)比青年鼠更具優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，CIA老年鼠滑膜細(xì)胞Egr2的低表達(dá)為其參與炎癥過程的可能因素之一。Egr家族是一類能被多種刺激因素諸如缺氧、感染等誘導(dǎo)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，該家族包括Egr1、Egr2、Egr3和Egr4四個(gè)成員，主要參與細(xì)胞的生長、發(fā)育、增殖以及凋亡等過程[17]。其中Egr2由T細(xì)胞受體參與誘導(dǎo)，是誘導(dǎo)T細(xì)胞失能所必需的物質(zhì)[18-19]。Egr2在活化的T細(xì)胞中被高度誘導(dǎo)，負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化，以控制過度炎癥[20-21]。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)Egr2直接連接細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling，SOCS)1和SOCS3的啟動(dòng)子，并通過誘導(dǎo)其活性而上調(diào)SOCS1/SOCS3的表達(dá)水平[22-24]。SOCS1/SOCS3是信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT)1和STAT3活化的抑制劑，主要通過STAT1/STAT3正調(diào)控Th1與Th2細(xì)胞的分化來實(shí)現(xiàn)[25]，而Th1和Th17細(xì)胞可分別產(chǎn)生IFN-γ和IL-17，其中IL-17A是最主要的效應(yīng)分子，具有較強(qiáng)的促炎癥作用，可誘導(dǎo)產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，如IL-6、IL-8等，從而引發(fā)局部或全身的炎癥反應(yīng)[26]。在RA急性期IL-17A可刺激不同類型細(xì)胞分泌各種炎性細(xì)胞因子，破壞骨修復(fù)系統(tǒng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹變形，因此急性期的RA患者往往病情嚴(yán)重，骨侵蝕明顯[27-28]。EORA往往發(fā)病更急，更加嚴(yán)重的關(guān)節(jié)腫脹癥狀很有可能與IL-17A表達(dá)水平升高相關(guān)。加味芍甘附子湯可能通過對(duì)Egr2的調(diào)控而抑制IL-17A為主的炎性細(xì)胞的分泌，從而改善CIA老年鼠關(guān)節(jié)滑膜炎癥。本實(shí)驗(yàn)樣本量小，且是對(duì)中藥治療EORA的初步探索，后期還需大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究來驗(yàn)證。