劉博群，方蘭蘭

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖與遺傳專科醫(yī)院，鄭州 450052)

生長分化因子8(GDF-8)在全身各個(gè)組織廣泛分布且發(fā)揮著重要作用，其參與調(diào)節(jié)骨骼肌發(fā)育、脂類和蛋白質(zhì)代謝。自從2012年首次報(bào)道血清GDF-8水平與PCOS患者腹部肥胖呈正相關(guān)[1]，此后，越來越多的研究關(guān)注于GDF-8在女性生殖系統(tǒng)中的作用和機(jī)理。GDF-8參與調(diào)控女性生殖生理過程，如卵泡發(fā)育、排卵、卵巢類固醇激素合成、胚胎著床及胎盤發(fā)育，同時(shí)，還參與生殖相關(guān)疾病的發(fā)生，如多囊卵巢綜合征(PCOS)[2]、子宮肌瘤[3]、先兆子癇[4]。此外，GDF-8還參與不孕癥患者妊娠結(jié)局的調(diào)控。本文將從GDF-8對(duì)卵泡發(fā)育、排卵、胎盤功能調(diào)控、女性生殖疾病調(diào)控和輔助生殖技術(shù)應(yīng)用中的作用等方面進(jìn)行綜述，以期為女性生殖生理機(jī)制的深入研究以及相關(guān)疾病診療新策略的提出提供重要科學(xué)依據(jù)。

一、GDF-8的概況

1.GDF-8的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)：McPherron等[5]首次發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)家族的新成員GDF-8，GDF-8敲除小鼠的肌肉量大約是野生型小鼠的2倍，鑒于GDF-8作用是抑制骨骼肌生長和分化，因此又被稱為肌肉生長抑制素(Myostatin)。隨后，在牛、羊、狗等物種中也發(fā)現(xiàn)GDF-8缺陷促使肌肉量增加[6]。Schuelke等[7]在患有肌肉肥大的患兒中發(fā)現(xiàn)了GDF-8突變，說明GDF-8在人體中同樣具有抑制骨骼肌生長的作用。

GDF-8屬于TGF-β超家族成員，由位于人類2號(hào)染色體長臂32.2位的MSTN基因編碼。最初合成的GDF-8前體蛋白大小為52 kDa，其具有N端分泌信號(hào)、前肽結(jié)構(gòu)域和C端RSRR(Arg-Ser-Arg-Arg)蛋白水解位點(diǎn)，該前體蛋白需要經(jīng)過兩次蛋白水解才能形成有活性的GDF-8[8]。成熟的GDF-8分子量為25.0 kDa，為二聚體分泌型多肽，在人類、小鼠、大鼠、豬、雞、火雞和狗中具有高度同源性。

2.GDF-8的受體和信號(hào)通路：TGF-β家族受體包含高親和力的Ⅱ型受體和低親和力的Ⅰ型受體，兩種受體亞型具有相似的結(jié)構(gòu)和絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。目前，已知有7種Ⅰ型受體，分別為激活素受體樣激酶1-7(ALK1-7)和5種Ⅱ型受體，分別為ACVR2A、ACVR2B、TβR2、BMPR2和AMHR2[9]。與GDF-8結(jié)合的Ⅰ型受體是ALK4和ALK5，與GDF-8結(jié)合的Ⅱ型受體是ACVR2A和ACVR2B[6]。

GDF-8可激活Smad依賴和Smad非依賴信號(hào)通路[8]。GDF-8與Ⅱ型受體結(jié)合激活Ⅰ型受體，磷酸化Smad2/3并與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物調(diào)控核內(nèi)靶基因，抑制性Smad7可消除GDF-8信號(hào)。此外，GDF-8還可以激活ERK、p38 MAPK和JNK等Smad非依賴信號(hào)通路[8]。

3.GDF-8在生殖系統(tǒng)中的表達(dá)：GDF-8及其受體在人卵巢中均有表達(dá)，且在顆粒細(xì)胞中的含量最高[10]，卵泡液中也可以檢測到GDF-8[11]。研究發(fā)現(xiàn)，GDF-8在人胎盤中的表達(dá)量隨孕周的增加而顯著下降[12]，在人子宮肌層和內(nèi)膜中也有GDF-8及其受體的表達(dá)[13-14]，而人輸卵管中是否有GDF-8表達(dá)尚未有報(bào)道。

二、GDF-8參與生殖生理活動(dòng)調(diào)控

1.GDF-8參與顆粒細(xì)胞增生：結(jié)締組織生長因子(CTGF)在人卵泡顆粒細(xì)胞中高表達(dá)，是卵泡膜細(xì)胞招募、卵泡發(fā)育和黃體血管形成過程中的關(guān)鍵蛋白[15]。Chang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，GDF-8和CTGF顯著抑制人黃素化顆粒細(xì)胞(HGL)的增殖，GDF-8通過ALK 4/5介導(dǎo)的Smad 2/3信號(hào)通路上調(diào)CTGF的表達(dá)，該促進(jìn)作用與GDF-8濃度呈正相關(guān)，此外，靶向敲除CTGF可以逆轉(zhuǎn)GDF-8對(duì)HGL細(xì)胞的抑制作用，從而證實(shí)了GDF-8對(duì)HGL細(xì)胞增殖負(fù)性調(diào)節(jié)作用的機(jī)制。

2.GDF-8對(duì)卵巢類固醇激素生成的調(diào)控作用：Cheewasopit等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在牛顆粒細(xì)胞中GDF-8增加基礎(chǔ)芳香化酶(Aromatase)的表達(dá)和E2分泌，降低基礎(chǔ)和FSH誘導(dǎo)的3β-羥類固醇脫氫酶(3β-HSD)的表達(dá)和孕酮分泌；在卵泡膜細(xì)胞中，GDF-8抑制基礎(chǔ)和LH刺激的雄激素分泌，而不影響孕酮分泌。我們團(tuán)隊(duì)之前研究發(fā)現(xiàn)，在HGL細(xì)胞中GDF-8通過ALK5介導(dǎo)Smad2/3信號(hào)通路上調(diào)Aromatase的表達(dá)并增加E2水平[18]，增加FSH受體水平來增強(qiáng)FSH的效應(yīng)。同時(shí)，GDF-8通過ALK5介導(dǎo)的Smad3和ERK1/2信號(hào)通路，下調(diào)類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)的表達(dá)并減少孕酮的產(chǎn)生。GDF-8通過減少LH受體水平來減弱LH的效應(yīng)，且不影響細(xì)胞中P450側(cè)鏈切割酶和3β-HSD的表達(dá)。GDF-8通過抑制排卵前卵泡晚期孕酮的生成，在預(yù)防黃體過早形成發(fā)揮著關(guān)鍵作用，這一重要的生理功能用于維持卵泡生長和體細(xì)胞增殖[19-20]。GDF-8對(duì)HGL細(xì)胞類固醇激素合成的調(diào)控過程見圖1。

圖1 GDF-8對(duì)HGL細(xì)胞類固醇激素合成的調(diào)控過程示意圖

3.GDF-8參與卵丘擴(kuò)張：正五聚體蛋白(PTX3)是PTX家族的經(jīng)典蛋白，有聚合作用，參與形成穩(wěn)定的透明質(zhì)酸網(wǎng)絡(luò)，有助于細(xì)胞外基質(zhì)組裝與卵丘擴(kuò)張[21]。El-magd等[22]用腺相關(guān)病毒攜帶MSTN前肽(AAV-MSTNP)作為GDF-8抑制劑，發(fā)現(xiàn)在水牛卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)中，AAV-MSTNP下調(diào)PTX3并抑制卵丘擴(kuò)張。而我們研究證實(shí)，在人顆粒細(xì)胞中GDF-8通過ACVR2A/ACVR2B-ALK5介導(dǎo)的Smad信號(hào)通路下調(diào)PTX3的表達(dá)，抑制卵丘擴(kuò)張，在排卵前減數(shù)分裂停滯后起著維持卵丘的作用[11]。

4.GDF-8與卵母細(xì)胞成熟：在豬卵母細(xì)胞IVM中，培養(yǎng)基補(bǔ)充GDF-8會(huì)激活P38 MAPK信號(hào)通路從而改變卵母細(xì)胞成熟相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，使細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟[23]。之后研究者還發(fā)現(xiàn)，GDF-8也可以通過Smad2/3信號(hào)通路促進(jìn)減數(shù)分裂和細(xì)胞質(zhì)成熟[24]。在水牛卵母細(xì)胞IVM中，通過觀察卵母細(xì)胞IVM效率和卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體中特異性基因的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，GDF-8抑制劑可顯著降低卵母細(xì)胞的成熟率，使達(dá)到減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞減少，并伴隨著相關(guān)凋亡基因的表達(dá)上調(diào)，抗凋亡基因的表達(dá)下調(diào)[22]。在人卵巢中GDF-8可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞賴氨酸氧化酶(LOX)的表達(dá)及活性[25]，而LOX在卵泡發(fā)育過程中可以穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)，是優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞的標(biāo)志物[26]，提示GDF-8參與促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。

5.GDF-8參與調(diào)控胚胎發(fā)育：Yoon等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在豬胚胎體外培養(yǎng)中外源性GDF-8通過改變基因的轉(zhuǎn)錄模式，從而增強(qiáng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)標(biāo)記物SOX2的表達(dá)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)/滋養(yǎng)外胚層比例以提高體外受精中的囊胚質(zhì)量。El-magd等[22]研究表明，GDF-8抑制劑作用于體外培養(yǎng)的水牛卵母細(xì)胞后，其受精效率、卵裂率和囊胚率顯著下降。此外，Wong等[28]研究發(fā)現(xiàn)，GDF-8可以促進(jìn)金倉鼠體外培養(yǎng)的胚胎滋養(yǎng)層的增殖與孵化、抑制附著，其抑制附著是通過干擾胚胎著床蛋白酶表達(dá)或減弱子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生的白血病抑制因子發(fā)揮作用的。因此，GDF-8參與植入前胚胎發(fā)育過程，而GDF-8在人體胚胎調(diào)控中的作用尚無研究。

6.GDF-8參與調(diào)控胎盤功能：Peiris等[29]用不同濃度的GDF-8處理人原代絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞(EVT)及其細(xì)胞系(HTR-8/Svneo)發(fā)現(xiàn)，GDF-8促進(jìn)EVT和HTR-8的增殖與遷移，EVT和HTR-8的增殖與GDF-8劑量相關(guān)，而遷徙無劑量依賴性。GDF-8在調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲中的作用尚有爭議。卵泡抑制素樣3(FSTL3)是GDF-8拮抗劑[30]，可顯著促進(jìn)滋養(yǎng)層的侵襲和脂質(zhì)儲(chǔ)存，抑制滋養(yǎng)層的凋亡，而研究發(fā)現(xiàn)，GDF-8通過ALK5-Smad2/3信號(hào)通路上調(diào)FSTL3的表達(dá)并促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲[31-32]。Mitchell等[12]通過體外放射標(biāo)記脫氧葡萄糖評(píng)估胎盤組織葡萄糖攝取發(fā)現(xiàn)，GDF-8促進(jìn)人胎盤組織的葡萄糖代謝，有助于胎盤葡萄糖穩(wěn)態(tài)，可能是治療胎盤功能不全、妊娠糖尿病等疾病的靶點(diǎn)。Antony等[33]研究發(fā)現(xiàn)，GDF-8抑制絨毛膜癌細(xì)胞系(BeWo細(xì)胞)的葡萄糖攝取。以上兩項(xiàng)研究結(jié)果的差異可能由于原代滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞系在基因表達(dá)、甲基化模式和HLA分子表達(dá)方面存在差異。

三、GDF-8參與的女性生殖疾病

1.多囊卵巢綜合征(PCOS)：PCOS是不孕癥患者最常見的原因之一，其鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)[34]為稀發(fā)排卵或無排卵、臨床/生化高雄激素血癥、多囊卵巢的超聲表現(xiàn)，滿足兩個(gè)及以上者即可診斷。研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者卵巢竇卵泡中GDF-8及其受體水平增加[10]，卵泡液中GDF-8水平較高[2]，而血清GDF-8水平無顯著變化[1，35]。有研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者卵泡液GDF-8表達(dá)水平高于血清，說明其作為卵巢源性因子參與PCOS的發(fā)生[2]。Bai等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在PCOS患者中GDF-8通過ALK5介導(dǎo)的Smad2/3信號(hào)通路上調(diào)人纖溶酶原激活物抑制劑1(SERPINE1)的表達(dá)，從而對(duì)顆粒細(xì)胞造成葡萄糖代謝損傷，并使得PCOS患者代謝紊亂。

2.卵巢癌：在卵巢癌中E-鈣黏蛋白(E-cadherin)下調(diào)參與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程，即上皮細(xì)胞失去粘附而獲得遷移和侵襲特性[37]。Zhao等[38]研究發(fā)現(xiàn)，GDF-8激活A(yù)LK4/5-Smad2/3信號(hào)通路下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，上調(diào)EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug的表達(dá)，參與卵巢癌細(xì)胞的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。

3.子宮肌瘤：子宮平滑肌瘤是女性最常見的良性腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，GDF-8在人類平滑肌瘤中較正常子宮肌細(xì)胞表達(dá)升高[39]。Islam等[3]用GDF-8處理子宮原代肌層細(xì)胞和肌瘤細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，GDF-8通過激活Smad2/3信號(hào)通路降低子宮肌層細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原和Ki-67表達(dá)，發(fā)揮抗纖維化的作用，而不影響肌瘤細(xì)胞的增殖，有可能為子宮肌瘤分子診療措施的提出提供依據(jù)。

4.子宮腺肌癥：子宮腺肌癥好發(fā)于絕經(jīng)前婦女，主要癥狀有異常子宮出血(AUB)，低生育能力和較高的流產(chǎn)率[40]。研究發(fā)現(xiàn)，GDF-8及其Ⅱ型受體在子宮腺肌癥中高表達(dá)，推測GDF-8受體擴(kuò)增可能在腺肌癥導(dǎo)致的不孕中發(fā)揮作用[41]。Harmsen等[42]研究發(fā)現(xiàn)，腺肌癥組患者GDF-8的表達(dá)水平高于對(duì)照組，這提示GDF-8參與子宮脆性和滲透性較高血管的生成過程，可能與腺肌病相關(guān)的AUB和生育能力低下有關(guān)，為該疾病提供了一個(gè)可能的治療靶點(diǎn)。

5.子宮內(nèi)膜腫瘤：GDF-8及其受體在正常子宮內(nèi)膜以及內(nèi)膜良惡性腫瘤中表達(dá)存在差異。GDF-8及受體在良性腫瘤，如卵巢子宮內(nèi)膜瘤(OMA)和子宮內(nèi)膜息肉中表達(dá)升高。GDF-8在深浸潤性子宮內(nèi)膜異位癥(DIE)和子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)最高，而GDF-8受體在子宮內(nèi)膜癌和腺癌中的表達(dá)最高。GDF-8及其受體的這種差異性分布提示，GDF-8參與了人類子宮內(nèi)膜相關(guān)病理[14]，但為了更好地理解GDF-8及其相關(guān)蛋白在子宮內(nèi)膜生理和病理中的作用，還需要進(jìn)一步的研究。

6.妊娠期糖尿病(GDM)：GDM是指妊娠期母體葡萄糖耐受不良和胰島素抵抗。Peiris等[43]研究發(fā)現(xiàn)，GDM患者血清GDF-8水平與正常妊娠組相比無顯著差異，而胎盤中GDM患者GDF-8水平顯著低于正常妊娠組。經(jīng)胰島素治療組患者胎盤GDF-8水平高于飲食療法組，更接近正常對(duì)照組。由此，Peiris等[43]提出，GDF-8于胎盤組織的表達(dá)在應(yīng)激條件下(如糖代謝異常)發(fā)生改變，通過影響胎盤組織葡萄糖穩(wěn)態(tài)，改變胎盤的功能，可能與GDM的葡萄糖耐受不良相關(guān)。

7.子癇前期(PE)和宮內(nèi)生長受限(IUGR)：PE和IUGR是導(dǎo)致母體、胎兒和新生兒預(yù)后不良的主要妊娠疾病。研究證實(shí)，GDF-8在PE、IUGR以及PE合并IUGR孕婦血清和胎盤中顯著升高[4]。在體外培養(yǎng)胎盤組織中，GDF-8治療促使妊娠早期胎盤組織產(chǎn)生的細(xì)胞因子發(fā)生改變，即從Th1細(xì)胞因子(促炎)環(huán)境轉(zhuǎn)移到成功妊娠所需的Th2細(xì)胞因子(抗炎)環(huán)境，說明GDF-8在合并PE和IUGR的復(fù)雜妊娠中發(fā)揮有利作用[4]。

四、GDF-8在輔助生殖中的作用

研究發(fā)現(xiàn)，在接受IVF助孕患者控制性超促排卵(COH)過程中，妊娠組與非妊娠組血清GDF-8水平動(dòng)態(tài)變化趨勢相似，但在HCG日和ET后14 d血清GDF-8水平有顯著差異，提示血清GDF-8水平與妊娠結(jié)果關(guān)系密切[44]。目前，已知HCG日孕酮提前升高可以降低胚胎著床率、妊娠率和活產(chǎn)率，且血清GDF-8水平與孕酮水平呈負(fù)相關(guān)[19，45]。由此，我們推測GDF-8變化預(yù)測妊娠結(jié)局的主要機(jī)制為：在HCG使用前，較高水平的GDF-8通過保持較低的血清孕酮水平對(duì)妊娠有利；而HCG作用后，低水平的GDF-8維持高水平的孕酮對(duì)早期胚胎著床至關(guān)重要，因此，血清GDF-8水平是IVF/ICSI-ET治療患者妊娠的一個(gè)有價(jià)值的預(yù)測因子[44]。

另外，在IVF過程中PCOS患者卵泡液GDF-8水平顯著高于非PCOS患者，顆粒細(xì)胞中基礎(chǔ)ALK5水平增加，而StAR水平降低，且GDF-8對(duì)StAR的抑制作用更加顯著[2]。GDF-8和ALK5的高基礎(chǔ)表達(dá)水平可能導(dǎo)致PCOS患者顆粒細(xì)胞中StAR和孕酮異常下調(diào)，這可能導(dǎo)致不良的妊娠結(jié)局。相比之下，在非PCOS患者中，通過保持相對(duì)較低StAR和孕酮水平以防止過早黃素化，較高水平的GDF-8可能對(duì)妊娠有益，因此，GDF-8在PCOS患者卵泡液中的異常表達(dá)可能是治療PCOS的潛在新靶點(diǎn)[2]。

五、總結(jié)

綜上所述，GDF-8廣泛參與卵泡發(fā)育、排卵、胎盤功能及生殖疾病調(diào)控過程，且在輔助生殖技術(shù)助孕患者妊娠調(diào)控中具有重要作用，但其在人體胚胎發(fā)育的作用以及不孕相關(guān)疾病發(fā)生的分子機(jī)制仍有待深入研究，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索女性生殖障礙疾病的新型分子靶標(biāo)和診療措施。