張光云，黃旋，陳莉，姚兵*

(1. 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210023；2. 中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南京 210002)

卵巢過度刺激綜合征(OHSS)是輔助生殖治療過程中控制性促排卵時常見的一種醫(yī)源性并發(fā)癥，以卵巢增大、血清高激素水平、血管通透性增加、第三體腔積液及相關(guān)的病理生理過程為主要特征。輕度OHSS的發(fā)生率約占1/3，中重度的發(fā)生率為3.1%～8%[1]，其發(fā)病機制主要與人絨毛膜促性腺激素(HCG)作用下血管活性因子增多導(dǎo)致的血管內(nèi)皮屏障破壞相關(guān)[2-4]。

有研究報道，自噬、氧化應(yīng)激與卵巢功能密切相關(guān)[5-8]。自噬是細(xì)胞在應(yīng)激條件下防止損傷并促進細(xì)胞存活；多種環(huán)境和化學(xué)刺激等導(dǎo)致活性氧大量產(chǎn)生，氧化應(yīng)激可以激活自噬，自噬通過負(fù)反饋作用保護細(xì)胞。氧化應(yīng)激、自噬同時對細(xì)胞凋亡有調(diào)節(jié)作用。

研究采用孕馬血清促性腺激素(PMSG)聯(lián)合HCG建立OHSS模型[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，OHSS超生理水平的激素釋放與卵巢顆粒細(xì)胞增殖相關(guān)[10]。另外文獻報道稱糾正卵巢氧化應(yīng)激可以預(yù)防和治療OHSS[11]。但是，氧化應(yīng)激、自噬、凋亡在OHSS發(fā)生發(fā)展中的具體作用尚未見報道。本實驗旨在觀察OHSS模型中氧化應(yīng)激、自噬及細(xì)胞凋亡的作用并探討其可能調(diào)節(jié)機制。

材料與方法

一、研究對象

1.實驗動物：22日齡雌性Sprague-Dawley清潔級大鼠20只(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心)，體重(60±10)g。飼養(yǎng)于18℃～25℃、相對濕度 40%～60%、晝夜比為12 h∶12 h 的環(huán)境中，自由攝食飲水。本研究涉及的實驗大鼠研究包括大鼠的樣本收集等過程均得到東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理學(xué)會的批準(zhǔn)和指導(dǎo)(倫理批號：20140729)，所有操作過程符合AAALAC和IACUC指南規(guī)定。

2.主要試劑：PMSG及HCG(寧波第二激素廠)，大鼠血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、睪酮(T)水平檢測采用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析法(Backman Coulter，Inc.，Brea CA，USA)，大鼠FSH(CK-E30623R)、LH(CK-E30597R)、活性氧(ROS)(SEB971Hu)、超氧化物歧化酶(SOD)(SES134Hu)ELISA試劑盒(Cloud-Clone，USA)，一抗兔源LC3(#12741)、Atg3(#3415)、Beclin-1(#3495)、Nrf2(#12721)、Cleaved Caspase-3(#9664)、P-ERK1/2(#4695)及ERK1/2抗體(#4370)(CST，USA)，一抗Bax(ab69643)、Bcl-2(ab194583)及p53(ab1431)(Abcam，UK)，一抗p62(sc-48389)(SANTA，USA)，β-actin抗體(CST，USA)。

二、研究方法

1.動物分組：大鼠隨機分為對照組、模型組，每組10只，以大鼠日齡為實驗記錄時間。對照組(CTL組)：第22～23天每天注射等體積(0.3 ml)0.9%生理鹽水，第24天注射PMSG 10 U(10 U/0.3 ml)，第26天注射 HCG 10 U(10 U/0.3 ml)；模型組(卵巢過度刺激綜合征組，OHSS組)：第22～25天每天連續(xù)腹腔注射PMSG 50 U(50 U/0.3 ml)，在第26 天注射HCG 150 U(150 U/0.3 ml)。實驗結(jié)束后處死大鼠，眼眶取血，2 000 轉(zhuǎn)/min離心10 min，收集血清，分離卵巢組織，右側(cè)-80℃凍存?zhèn)溆?，左?cè)固定于4%多聚甲醛備用。

2.卵巢組織學(xué)檢查：卵巢組織4%多聚甲醛固定24 h后，經(jīng)過梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟等處理后進行石蠟包埋備用。5 μm厚度連續(xù)切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色后光鏡觀察。各級卵泡計數(shù)：對整個卵巢組織進行連續(xù)切片，于最大切面為待檢平面，前后每隔5張取一張固定于載玻片中(共10張)，進行卵泡計數(shù)。HE染色后，對卵巢切片中初級卵泡(PF)、竇狀卵泡(AF)、排卵前卵泡(POF)、閉鎖卵泡(Atret.F)、黃體(CL)等各級卵泡分別進行計數(shù)，為防重復(fù)計數(shù)，計數(shù)時只計核著色的卵泡，并進行統(tǒng)計分析。

3.血清生殖激素水平檢測：由東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中心實驗科檢測血清E2、P、T水平，E2、P、T的檢出限分別為65.8～714.4 pmol/L、0.6～3.8 nmol/L和0.34～2.55 nmol/L，批內(nèi)和批間系數(shù)變量分別為5.13%和6.23%，8.18%和7.89%，以及2.71%和5.65%。采用ELISA試劑盒檢測血清FSH、LH水平。

4.免疫組織化學(xué)染色：將卵巢組織切片，60℃烤片后經(jīng)過程序性酒精脫蠟、水化，檸檬酸鈉緩沖液中進行抗原修復(fù)(高火1 min，中火2 min，低火7 min)，利用3% H2O2失活內(nèi)源過氧化氫酶，打孔液(PBS∶Tween 20∶Triton 100=1 000∶10∶5)室溫處理15 min，正常型山羊血清(AR900)濕盒內(nèi)室溫封閉1 h，1% BSA配制兔源LC3抗體(1∶200)濕盒中4℃過夜，沖洗后室溫孵育二抗(1∶200)1 h，加DAB工作液顯色、蘇木素復(fù)染核1 min，再次清洗、分化，乙醇脫水。顯微鏡下對切片進行觀察拍照。

5.卵巢組織ROS、SOD含量測定：按照試劑盒操作說明，進行ROS濃度及SOD酶活性檢測，檢測范圍分別為62.5～4 000 pg/ml、0.156～10 ng/ml；最低檢測濃度分別為27.7 pg/ml、0.055 ng/ml；批內(nèi)與批間變異系數(shù)分別小于10%和15%。

6.Western blot檢測卵巢組織相關(guān)蛋白的表達：采用RIPA蛋白裂解液裂解卵巢組織并提取總蛋白，BCA法對蛋白濃度進行定量，加入上樣緩沖液后煮沸10 min。而后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%BSA室溫封閉1 h，加入5%BSA稀釋(一抗1∶1 000稀釋)過的Atg3、Beclin-1、LC3、p62、Nrf2、Bax、Bcl-2、p53、Cleaved Caspase-3、P-ERK1/2、ERK1/2及β-actin抗體于4℃孵育過夜，TBST清洗三遍后加入二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜三次后采用ECL發(fā)光液，于Tanon-5200成像系統(tǒng)掃描進行成像，保存掃描圖像進行分析。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、卵巢過度刺激對大鼠生長曲線及卵巢大體形態(tài)的影響

比較CTL組和OHSS組大鼠體重變化，結(jié)果顯示兩組大鼠體重?zé)o顯著差異(P>0.05)(圖1 A)；與CTL組相比，OHSS組卵巢體積及重量顯著增加[(0.341 9±0.081 4)g vs.(0.064 3±0.015 0)g，P<0.001)]，OHSS組卵巢組織中可見較多血體(圖1B)；另外，OHSS組卵巢器質(zhì)比(卵巢重量/體重，g/g×100%)顯著增加[(0.313 1±0.085 6)vs.(0.056 7±0.015 1)，P<0.001](圖1C)。

A：生長曲線；B：卵巢重量及大體形態(tài)；C：卵巢器質(zhì)比。與CTL組比較，*P<0.001。

二、卵巢過度刺激對卵巢結(jié)構(gòu)和血清生殖激素水平的影響

1.卵巢過度刺激對卵巢結(jié)構(gòu)的影響：HE染色結(jié)果顯示，OHSS組大鼠卵巢中黃體數(shù)目顯著增多(圖2A)。各級卵泡計數(shù)結(jié)果顯示，OHSS組總卵泡數(shù)目較CTL組顯著增加[(60.87±4.36)個vs.(52.07±4.96)個，P<0.05]，其中初級卵泡(PF)、竇狀卵泡(AF)、排卵前卵泡(POF)、閉鎖卵泡(Atret.F)數(shù)目均顯著減少，黃體數(shù)目則顯著增加[(51.47±3.05)個vs.(8.87±4.78)個，P<0.001)](圖2)。

A：卵巢組織HE染色；B：卵泡總數(shù)目；C：各級卵泡數(shù)目。PF：初級卵泡；AF：竇狀卵泡；POF：排卵前卵泡；Atret.F：閉鎖卵泡；CL：黃體。圖中箭頭所示為黃體。與CTL組比較，#P<0.05，*P<0.001。

2.卵巢過度刺激對大鼠血清生殖激素的影響：OHSS組大鼠血清中FSH、LH水平較對照CTL組顯著增加(P<0.05)，E2、P、T水平也顯著增加(P<0.001)(圖3)。

與CTL組比較，#P<0.05，*P<0.001。

三、卵巢過度刺激對卵巢自噬的影響

LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值變化反映自噬的程度，Beclin-1和Atg3是自噬的標(biāo)志蛋白。蛋白免疫印跡及灰度值分析結(jié)果顯示：與對照CTL組相比，OHSS組大鼠卵巢組織中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值顯著增加(P<0.05)，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和Atg3的表達水平也較對照組顯著增高(P<0.05)；凋亡相關(guān)通路pERK1/2蛋白表達水平顯著上調(diào)(P<0.001)(圖4A～C)。免疫組化結(jié)果表明，在OHSS大鼠卵巢組織中LC3主要分布于黃體組織，且表達水平顯著高于對照CTL組(圖4D)。

A：兩組大鼠卵巢組織自噬相關(guān)蛋白(Atg3、Beclin-1、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ)的Western blot圖；B：凋亡相關(guān)通路蛋白pERK1/2、ERK1/2的Western blot圖；C：蛋白條帶灰度值分析圖；D：卵巢組織LC3的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。與CTL組比較，#P<0.05，*P<0.001。

四、卵巢過度刺激對卵巢氧化應(yīng)激及凋亡的影響

1.兩組大鼠卵巢組織氧化應(yīng)激水平變化比較：ELISA法檢測卵巢組織中ROS水平，結(jié)果顯示OHSS組卵巢ROS水平顯著高于CTL組(P<0.05)，而發(fā)揮清除氧自由基作用的SOD水平顯著低于CTL組(P<0.05)(圖5A、B)。Western blotting及蛋白條帶灰度值分析結(jié)果顯示，與CTL組相比，具有抗氧化作用、保護細(xì)胞免受應(yīng)激損傷的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在OHSS組卵巢組織中表達水平顯著增高(P<0.001)(圖5C、D)。

A、B：兩組大鼠卵巢組織氧化應(yīng)激水平比較；C、D：兩組大鼠卵巢組織Nrf2蛋白的Western blot結(jié)果圖及蛋白條帶灰度分析。與CTL組比較，#P<0.05，*P<0.001。

2.兩組大鼠卵巢組織凋亡相關(guān)蛋白的比較：活性氧的增加容易引起細(xì)胞凋亡增加。與CTL組相比，OHSS組卵巢內(nèi)促凋亡蛋白Bax表達顯著減少(P<0.05)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著增加(P<0.05)；p53蛋白、活性caspase-3表達水平同樣顯著減少(均P<0.05)(圖6)。

A：兩組大鼠卵巢組織凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl-2、p53、Cleaved-caspase3)的western blot結(jié)果；B：兩組大鼠卵巢組織凋亡相關(guān)蛋白的蛋白條帶灰度值分析。與CTL組比較，#P<0.05。

討 論

本研究采用PMSG聯(lián)合HCG構(gòu)建OHSS模型大鼠[9]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OHSS組大鼠卵巢組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變，卵巢組織自噬水平、氧化應(yīng)激水平顯著增加，而抗氧化能力及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白均顯著下降。本研究首次提出自噬、氧化應(yīng)激及凋亡在OHSS發(fā)生中的作用及相關(guān)調(diào)節(jié)機制。

卵巢體積增大、生殖激素水平增高、血管通透性增加是OHSS的主要表現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，OHSS模型組卵巢體積、重量均顯著增加，血清生殖激素水平也顯著升高；HE染色結(jié)果顯示，卵巢組織形態(tài)學(xué)改變主要表現(xiàn)為黃體、血體數(shù)目的增加、各級生長卵泡和閉鎖卵泡數(shù)目的減少。前期研究發(fā)現(xiàn)，OHSS模型大鼠卵巢組織中黃體細(xì)胞增殖顯著增加。本研究還發(fā)現(xiàn)，OHSS組大鼠卵巢中促凋亡蛋白均顯著減少。卵泡的生長發(fā)育與顆粒細(xì)胞的增殖與凋亡顯著相關(guān)，顆粒細(xì)胞凋亡促進卵泡閉鎖的發(fā)生[7，12]。本研究結(jié)果顯示，OHSS大鼠卵巢組織中閉鎖卵泡顯著減少，且與促凋亡相關(guān)蛋白減少、抑制凋亡蛋白增加結(jié)果一致。因此，OHSS大鼠卵巢形態(tài)學(xué)和血清生殖激素高水平的改變可能與卵巢內(nèi)細(xì)胞增殖增加、凋亡減少有關(guān)。

在生理水平上，ROS作為細(xì)胞信號的次級信使，在卵泡發(fā)生、減數(shù)分裂和排卵中起著重要的調(diào)節(jié)作用[13]；在老齡鼠卵巢組織內(nèi)ROS產(chǎn)生增加，與卵泡發(fā)育、炎癥、凋亡密切相關(guān)[14]。應(yīng)激條件下，自噬發(fā)揮防止細(xì)胞損傷并促進細(xì)胞存活的保護功能；ROS可以激活自噬，自噬通過負(fù)反饋作用保護細(xì)胞，從而維持顆粒細(xì)胞的穩(wěn)定[15-17]。細(xì)胞凋亡和自噬之間存在著密切的聯(lián)系，一些調(diào)節(jié)凋亡的基因也可以調(diào)節(jié)自噬；反之，調(diào)節(jié)自噬的基因?qū)Φ蛲鲆灿杏绊憽Ｔ谧允砂l(fā)生的最初階段，可以清除細(xì)胞內(nèi)一些有害的的代謝產(chǎn)物，如ROS、錯誤折疊的蛋白等，進而減少凋亡[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，OHSS大鼠卵巢組織中ROS水平增高、自噬水平增加，同時凋亡相關(guān)蛋白表達減少。推測卵巢過度刺激可能通過調(diào)節(jié)卵巢中氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)自噬水平升高，并進一步減少細(xì)胞凋亡，促進卵巢黃體的形成并產(chǎn)生大量激素。

Nrf2具有廣泛的細(xì)胞保護作用，是目前認(rèn)為最重要的抗氧化通路，在應(yīng)激狀態(tài)下Nrf2迅速積累，進入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)抗氧化基因表達并發(fā)揮保護細(xì)胞的作用[19-20]。本研究中OHSS大鼠卵巢組織中Nrf2蛋白水平顯著增高，推測卵巢過度刺激可能上調(diào)Nrf2表達發(fā)揮其細(xì)胞保護作用，清除ROS、降低自噬水平，進而減少卵巢細(xì)胞凋亡。

綜上所述，自噬、氧化應(yīng)激在OHSS卵巢組織結(jié)構(gòu)和功能改變中發(fā)揮重要作用。卵巢過度刺激可能通過誘導(dǎo)活性氧增加并導(dǎo)致自噬增加，自噬、Nrf2蛋白同時發(fā)揮抗氧化作用、抑制細(xì)胞凋亡的作用，最終導(dǎo)致OHSS大鼠血清生殖激素水平顯著增加，黃體組織增多、閉鎖卵泡等生長卵泡減少。細(xì)胞自噬是一個復(fù)雜的過程，以抑制或者誘導(dǎo)自噬為理論依據(jù)的臨床應(yīng)用，需要更加詳細(xì)的體外及體內(nèi)研究證據(jù)。