李 政， 林奕翰， 孫 哲， 張鑫瑞， 李澳旋， 喬永剛

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山西 太谷 030801)

房山紫堇(CorydalisfangshanensisT. C. Tang ex S. Y. He)是罌粟科紫堇屬植物[1]，產(chǎn)于北京房山、河北(正定、平山、內(nèi)丘、邯鄲、涉縣)、河南(林縣、輝縣、修武)等地，一般生長于海拔500～1 600 m的石灰?guī)r陡峭石壁上[2]。紫堇屬植物通常生命力較為旺盛，對環(huán)境要求較低，具有防風(fēng)固沙、水土保持的生態(tài)價(jià)值[3]。房山紫堇也作藥用，以全草入藥，具有清熱解毒，治療疥瘡、發(fā)熱等功效，有很高的藥用價(jià)值與廣闊的開發(fā)前景[8]。目前，房山紫堇仍為野生，在引種栽培相關(guān)研究與人工馴化開發(fā)方面未見報(bào)道。紫堇屬植物的種子在自然條件下普遍存在休眠現(xiàn)象，發(fā)芽率低[9]，前期研究發(fā)現(xiàn)，房山紫堇也存在同樣的問題，另外房山紫堇原生于巖壁，使得其引種馴化較為困難。房山紫堇野生資源現(xiàn)存量十分有限，2008年已被列為北京市二級保護(hù)野生植物物種[2]，急需通過引種馴化，在保護(hù)的基礎(chǔ)上開發(fā)利用。

研究房山紫堇種子形態(tài)，尋找解除種子休眠，提高萌發(fā)率的方法，可以為馴化栽培與開發(fā)利用提供參考。本試驗(yàn)對房山紫堇種子形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并探究自然條件下房山紫堇發(fā)芽最適溫度，以及不同GA3濃度破除種子休眠的效果，以期找到解除房山紫堇種子休眠的方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

房山紫堇(CorydalisfangshanensisT. C. Tang ex S. Y. He)種子采集自山西省陵川縣丈河村，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)喬永剛副教授鑒定，標(biāo)本種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物種質(zhì)資源圃。選取生長良好的房山紫堇植株采集種子。室內(nèi)考種，選取飽滿無蟲害的種子，并貯藏備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1種子外部形態(tài)特征與吸水性

使用體視顯微鏡對房山紫堇種子的形態(tài)進(jìn)行觀察并描述，將種子浸泡于蒸餾水中，每隔2 h使用游標(biāo)卡尺、天平等對種子的大小，千粒重等參數(shù)進(jìn)行測量。觀察種子形態(tài)時(shí)種臍朝上，露出種臍附屬物。種子大小以長度、寬度、高度表示。使用百粒法測量種子千粒重，設(shè)5次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)試驗(yàn)隨機(jī)取種子100粒并稱重，以5次重復(fù)試驗(yàn)的平均值計(jì)算千粒重。

1.2.2種子石蠟切片與形態(tài)學(xué)觀察

選取飽滿無蟲害的房山紫堇種子，用FAA固定液(70%酒精∶冰乙酸∶甲醛=18∶1∶1，現(xiàn)配現(xiàn)用)固定，并將處理好的種子分別放入裝有FAA固定液的2 mL離心管中，封口膜封蓋，并用真空泵抽氣下沉，待下沉后蓋住離心管蓋，放入4 ℃冰箱內(nèi)冷藏過夜。使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(YD-1508 R)做常規(guī)石蠟切片[10]。切片厚度為8 μm，切片方式為縱切。使用番紅-甲苯胺藍(lán)溶液染色，并用中性樹膠封片，將切片結(jié)果置于Leica顯微成像系統(tǒng)(型號DM 6 B)下進(jìn)行觀察，以全面了解房山紫堇種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

1.2.3赤霉素浸種、培養(yǎng)溫度對發(fā)芽的影響

采用紙上發(fā)芽法，除ck外，將50粒房山紫堇種子在相應(yīng)處理下吸脹12 h，回干后均勻地平鋪在有2層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱(相對濕度為60%)，在黑暗條件下進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。每隔12 h記錄發(fā)芽種子數(shù)并更換濾紙。試驗(yàn)期間及時(shí)補(bǔ)充水分。

設(shè)浸種GA3濃度與發(fā)芽溫度兩個(gè)因素(表1)。GA3設(shè)置為5個(gè)濃度，即0、600 mg/L、1 200 mg/L、1 800 mg/L和2 400 mg/L。0為蒸餾水浸泡，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子。另設(shè)ck組，不進(jìn)行12 h吸脹，不添加GA3溶液，其他與處理組相同。

表1 浸種濃度與發(fā)芽溫度試驗(yàn)設(shè)計(jì)

逐日統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽個(gè)數(shù)，記錄種子發(fā)芽狀態(tài)，種子的發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)為：胚根突破種皮長度在1 mm以上，發(fā)芽時(shí)間為18 d，計(jì)算發(fā)芽率。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%

利用Excel 2019軟件與SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 房山紫堇種子的形態(tài)結(jié)構(gòu)

由圖1可見，房山紫堇種子呈扁圓形或橢球形，種皮堅(jiān)硬，黑色且具有光澤，表面密布網(wǎng)點(diǎn)狀凹痕。種臍位于種子背部近中央處，并附生有較大且堅(jiān)硬的油質(zhì)體，種子大小與重量較為穩(wěn)定，大小為2.19 mm×1.56 mm×0.95 mm，種子千粒重為1.336 g，變異系數(shù)為0.035。

房山紫堇有堅(jiān)硬致密的種皮，用清水浸泡對種子的吸水性進(jìn)行研究。結(jié)果如圖2所示，房山紫堇種子隨著浸泡時(shí)間的延長，種子體積大小變化不明顯，而種子的重量在浸泡2～4 h時(shí)出現(xiàn)明顯升高，原因可能是致密的外殼并不妨礙種子的吸水性，又限于種皮的堅(jiān)硬，使得種子的體積變化較不明顯。

由圖3可以看出，房山紫堇種子內(nèi)部被營養(yǎng)細(xì)胞填充，呈灰白色或蠟白色，胚軸較小，長度約占種子長度的1/5，接近種臍。種臍處存在分泌細(xì)胞，并位于種皮外，向外分泌油狀分泌物。

注：a為分泌細(xì)胞；b為分泌物；c為胚乳；d為種皮；e為種胚；f為種臍。

2.2 GA3濃度與發(fā)芽溫度對房山紫堇種子發(fā)芽率的影響

對GA3濃度與發(fā)芽溫度進(jìn)行雙因素五水平方差分析，ck組未納入處理。其結(jié)果見表2。不同GA3濃度處理之間的差異不顯著，不同GA3濃度與發(fā)芽溫度的交互作用的差異顯著，不同發(fā)芽溫度處理間的差異極顯著。

表2 GA3濃度與發(fā)芽溫度進(jìn)行雙因素五水平方差分析結(jié)果

多重比較結(jié)果表明(表3)，除C1外，其他GA3濃度處理的發(fā)芽率均大于對照組(C6)的發(fā)芽率，最佳GA3濃度為C3、C4，平均發(fā)芽率為16%；最佳溫度為T5，平均發(fā)芽率為18.89%。在0.05的水平下，C3和C1、C4和C1、C3和C6、C4和C6差異顯著，其他GA3濃度之間差異不顯著；T1與T5之間以及T3與T5之間差異顯著，其他溫度之間差異不顯著。

表3 不同GA3濃度與溫度對房山紫堇種子發(fā)芽率的影響

由圖4與表4可看出，房山紫堇在C4T5(1 800 mg/L，30 ℃)處理時(shí)發(fā)芽率最高，可達(dá)28.3%。C3T2(1 200 mg/L，15 ℃)、C5T5(2 400 mg/L，30 ℃)與C6T4(ck，25 ℃)的發(fā)芽率次于C4T5，為26.7%，說明在較低溫度下中等濃度的GA3可以顯著提高發(fā)芽率，在高溫時(shí)，高濃度GA3可顯著提高種子發(fā)芽率。當(dāng)使用清水發(fā)芽(C1)時(shí)，在T1(10 ℃)處理中，種子發(fā)芽率顯著降低，說明在較低溫度下房山紫堇種子發(fā)芽率降低。在C3(1 200 mg/L)系列處理中，溫度為15 ℃時(shí)最適宜發(fā)芽，當(dāng)溫度為20 ℃和25 ℃時(shí)，發(fā)芽率降至較低水平，30 ℃時(shí)發(fā)芽率開始逐漸提高。在ck組(C6)中，當(dāng)發(fā)芽溫度逐漸升高至25 ℃時(shí)，發(fā)芽率最高，繼續(xù)升高溫度后發(fā)芽率呈下降趨勢，說明房山紫堇自然條件下最適發(fā)芽溫度為25 ℃。

表4 不同GA3濃度與溫度條件組合之間平均發(fā)芽率

圖4 不同 GA3濃度與溫度下房山紫堇種子發(fā)芽率

3 討 論

自然界中，限制種子萌發(fā)的因素有很多，其中種皮堅(jiān)硬致密是限制因素之一，若將其種皮去除或使種皮產(chǎn)生空隙，則可以提高種子的萌發(fā)率[11]。紫堇屬植物種子普遍存在表皮堅(jiān)實(shí)，結(jié)構(gòu)致密，透水性低等特點(diǎn)，使其存在休眠與發(fā)芽率低等問題[9]。本實(shí)驗(yàn)通過外部形態(tài)、石蠟切片觀察和吸水性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)房山紫堇與其他紫堇屬植物形態(tài)相似，其種子存在堅(jiān)實(shí)致密外殼，也存在附有油狀分泌物的種臍。房山紫堇致密的外殼并不妨礙種子的吸水性，種臍具有自由吸水的特性，外殼堅(jiān)硬可能是房山紫堇自然發(fā)芽率低的原因之一。

由于種子休眠在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有諸多不便，因此產(chǎn)生了許多破除種子休眠的方法[12]。GA3為激素處理中使用較為廣泛的植物激素，其誘導(dǎo)產(chǎn)生水解酶，后者將種子中的大分子貯藏物質(zhì)分解為小分子，并為胚所用，進(jìn)而促進(jìn)種子萌發(fā)，蘆建國等[13]使用GA3結(jié)合低溫沙藏層積提高刻葉紫堇種子萌發(fā)率。溫度也是種子萌發(fā)的關(guān)鍵因素，不同物種的最適萌發(fā)溫度不同。本實(shí)驗(yàn)使用不同濃度的GA3與溫度梯度進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度處于30 ℃(T5)、GA3濃度為1 800 mg/L時(shí)發(fā)芽率最高，為28.3%。王娜等[14]研究了不同溫度與GA3濃度處理對紫堇種子萌發(fā)的影響，本研究結(jié)果與之相似。而當(dāng)溫度為25 ℃(T4)，無GA3處理時(shí)，種子發(fā)芽率也較高，為26.7%，說明在無GA3處理下，在適宜的溫度中也可達(dá)到較高的萌發(fā)率。但由于房山紫堇主要分布于太行山脈附近，其環(huán)境條件變化較大，無法常年保持適宜溫度，使得自然條件下房山紫堇種子發(fā)芽率較低。在溫度為15 ℃、25～30 ℃時(shí)，均有較高的發(fā)芽率組合。而溫度為20 ℃時(shí)，不同GA3濃度處理效果較不明顯，具體原因需要進(jìn)一步研究。

房山紫堇具有極高的生態(tài)價(jià)值與藥用價(jià)值，但由于自然條件下萌發(fā)率低使其常年供不應(yīng)求。本實(shí)驗(yàn)研究了房山紫堇種子結(jié)構(gòu)、激素與溫度對種子萌發(fā)的影響，分析了自然萌發(fā)率低下的原因，找到了可提高種子萌發(fā)率的方式，為房山紫堇的生產(chǎn)、引種繁殖等方面提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，房山紫堇相對于其他紫堇屬植物，自然發(fā)芽率低的原因主要是外殼堅(jiān)硬和自然環(huán)境溫度較低引起的。在種子引發(fā)時(shí)，發(fā)芽溫度為30 ℃且GA3濃度為1 800 mg/L時(shí)可獲得最高的發(fā)芽率。