許丁帆， 劉艷軍， 張 彤， 黃俊軒， 武春霞， 李建科

(天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院， 天津 300392)

垂絲海棠(Malushalliana)屬薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)落葉小喬木，為我國特有種，花開艷麗，花梗柔軟下垂，枝干峭立，樹形優(yōu)美，且生性強(qiáng)健，對土壤酸堿性要求不嚴(yán)，廣泛應(yīng)用于園林綠化中，還可作盆花栽培[1]。垂絲海棠還具有一定的食用和藥用功能，其果實(shí)酸甜可食，其花可調(diào)經(jīng)和血，主治血崩[2]。同時，垂絲海棠也是一種抗寒、耐旱、耐鹽堿、耐缺鐵的蘋果砧木資源[3-4]。目前，垂絲海棠的繁殖方式主要有種子繁殖、扦插繁殖和嫁接繁殖，生產(chǎn)上多采用嫁接繁殖，雖應(yīng)用廣泛，但繁殖效率較低、優(yōu)良性狀難以保存，限制了垂絲海棠優(yōu)樹選育和規(guī)模化的擴(kuò)繁[5]。近年來，隨著市場對垂絲海棠需求量的不斷增大，利用組培快繁技術(shù)進(jìn)行垂絲海棠繁育，具有繁殖速度快、繁殖系數(shù)高、后代遺傳穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)，可在短時間內(nèi)獲得大量優(yōu)質(zhì)種苗，還可對母本的優(yōu)良性狀進(jìn)行保持、提純或復(fù)壯。

垂絲海棠屬木本植物，其組織培養(yǎng)難度較大，目前對其他海棠品種的組織培養(yǎng)研究較多[6-8]。近年來，已開展一定的垂絲海棠組織培養(yǎng)研究。張慶田等[9]誘導(dǎo)垂絲海棠葉片分化不定芽，對垂絲海棠組培再生研究取得初步成功；許紀(jì)龍等[10]用帶芽嫩莖作外植體建立了垂絲海棠無菌繁育體系；張玲玲等[11]研究了垂絲海棠外植體消毒的影響因素、芽誘導(dǎo)啟動最適培養(yǎng)基和植物生長激素濃度組合；許以太等[12]以垂絲海棠當(dāng)年生莖段為外植體，探討不同植物激素對試管苗增殖以及植株再生的影響。但這些研究中再生體系建立不完善，很多研究仍存在有效增殖系數(shù)低、生根和組培苗移栽方面研究不夠等缺陷。本研究以春梢嫩枝莖段為外植體進(jìn)行垂絲海棠組織培養(yǎng)快速繁殖研究，通過篩選最適外植體、最佳消毒時間、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基及移栽馴化方法，建立完整高效穩(wěn)定的垂絲海棠組培快繁體系，為垂絲海棠工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料取自天津市薊州區(qū)天津市海潤澤苗木有限公司種植基地的健壯植株，于11月下旬，剪取植株上部無病蟲害的一年生休眠枝條，保濕帶回實(shí)驗(yàn)室；于翌年6月上旬，剪取植株春梢上端無病蟲害、生長旺盛、腋芽未萌發(fā)的半木質(zhì)化嫩枝，去除葉片和頂芽，保留葉柄，保濕帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1外植體消毒

將取回的枝條用流水沖洗1 h后，在超凈工作臺中，將枝條剪成長約1.5 cm的帶腋芽莖段，用70%乙醇溶液浸泡30 s，再用含2%有效氯的次氯酸鈉溶液消毒，消毒時間分別為6、8、10、12、14、16、18 min，期間不斷搖動，消毒后用無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干外植體表面水分，并剪去莖段兩端褐化部分，分別接種至1/2 MS培養(yǎng)基上。每個消毒時間處理接種30瓶，每瓶接種1個莖段，重復(fù) 3次，初代培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計(jì)外植體污染率、存活率和死亡率。

1.2.2基本培養(yǎng)基篩選

將消毒好的帶兩個腋芽的嫩枝莖段接種至1/2 MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后，將未污染的外植體移到不同培養(yǎng)基上誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)。以MS、1/2 MS、Anderson、B 5、WPM為不同基本培養(yǎng)基，均添加10 mg/L GA3。每處理接種10瓶，每瓶接種4個莖段，試驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)20 d后，觀察莖段腋芽生長情況并統(tǒng)計(jì)平均腋芽長度。

1.2.3增殖培養(yǎng)

待垂絲海棠腋芽長至3.5～4.0 cm高時，剪取長約3.0 cm的新梢接種到增殖培養(yǎng)基。增殖培養(yǎng)基以WPM為基本培養(yǎng)基，附加一定濃度配比的IAA和BA，探索IAA和BA濃度對腋芽增殖的影響。每個處理接種10瓶，每瓶接種4個新梢，試驗(yàn)重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計(jì)每個處理的有效增殖系數(shù)及再生芽生長情況。

1.2.4生根培養(yǎng)

剪取增殖培養(yǎng)獲得的2.0 cm以上的健壯苗進(jìn)行生根誘導(dǎo)，以WPM為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的IAA或NAA。每個處理接種10瓶，每瓶接種3個苗，試驗(yàn)重復(fù)3次。30 d后觀察每個處理的生根情況，統(tǒng)計(jì)生根率、平均根條數(shù)。

1.2.5組培苗移栽與馴化

選取生長健壯、根系良好的垂絲海棠組培苗，室內(nèi)自然光下馴化煉苗5 d，將無菌苗取出，自來水清洗根部殘余培養(yǎng)基，移栽到裝有草炭∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1(體積比)混合基質(zhì)的雙色育苗缽(外徑9 cm，高8 cm)中，基質(zhì)于使用前1周高壓滅菌備用；采用許丁帆等[13]發(fā)明的組培苗移栽保濕裝置培育15 d，后轉(zhuǎn)入室內(nèi)自然條件下培養(yǎng)，于移栽第30天觀察記錄生長狀況并統(tǒng)計(jì)移栽存活率。

1.2.6培養(yǎng)條件

以上培養(yǎng)基均采用100 mL廣口三角瓶為容器，每個三角瓶加入約40 mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)基均添加7.0 g/L瓊脂，20 g/L蔗糖，滅菌前調(diào)節(jié)pH值為5.8～6.0，121 ℃、0.1 MPa下滅菌20 min。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，24 h光照，光照強(qiáng)度2 000 lx。

1.2.7計(jì)算及統(tǒng)計(jì)分析

污染率(%)=(污染的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

存活率(%)=(未污染存活的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

死亡率(%)=(未污染死亡的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

有效增殖系數(shù)=有效芽數(shù)/接種芽數(shù)(有效芽為高度大于1.0 cm的芽)；

生根率(%)=(生根苗數(shù)/接種苗數(shù))×100%；

平均根條數(shù)=生根植株的總根數(shù)/生根植株數(shù)；

移栽成活率(%)=(成活苗數(shù)/移栽苗數(shù))×100%；

采用Excel 2013軟件和SPSS Statistic 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時間對不同時期外植體消毒效果的影響

由表1可知，不同時期的外植體在外植體消毒效果上存在明顯差異。以一年生休眠枝條莖段為外植體時，外植體污染率雖隨消毒時間的延長而顯著降低(外植體污染率最低為65.56%)，但仍處于較高水平的污染；

表1 不同外植體在不同消毒時間下的消毒效果

延長外植體消毒時間，污染率未見顯著降低，而死亡率增高，過長的消毒時間會導(dǎo)致外植體褐化死亡，存活率降低，說明垂絲海棠一年生休眠枝條莖段不是外植體消毒的理想材料。當(dāng)以春梢嫩枝莖段為外植體時，隨著消毒時間的延長，外植體污染率顯著下降，而外植體存活率隨消毒時間的延長而呈先上升后下降趨勢，外植體死亡率隨消毒時間的延長而顯著升高。當(dāng)采用次氯酸鈉消毒春梢嫩枝莖段12 min時，外植體存活率最高達(dá)96.67%，顯著高于其他處理，且此時污染率與死亡率均較低；延長外植體消毒時間，外植體存活率顯著降低，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。因此，采用春梢嫩枝莖段為外植體，并以2%有效氯次氯酸鈉溶液消毒處理12 min，外植體消毒效果最佳。

2.2 不同基本培養(yǎng)基對垂絲海棠生長的影響

由表2可知，在添加10 mg/L GA3的不同基本培養(yǎng)基上莖段腋芽均能萌發(fā)，但不同基本培養(yǎng)基上腋芽生長情況明顯不同。在Anderson培養(yǎng)基上莖段腋芽萌發(fā)率最高，但腋芽生長情況較差，平均腋芽高度低。在Anderson和1/2 MS培養(yǎng)基上，腋芽萌后可生長一段時間，但隨著培養(yǎng)時間延長，再生芽也逐漸停止生長，并出現(xiàn)生長點(diǎn)死亡的現(xiàn)象，不適合垂絲海棠生長。在MS和B 5培養(yǎng)基上，腋芽萌發(fā)率、平均腋芽高度均較低，且腋芽萌發(fā)展葉后基本停止生長，說明這兩種培養(yǎng)基不適合垂絲海棠生長。在WPM培養(yǎng)基上，莖段腋芽萌發(fā)后生長健壯，葉色淡綠；平均腋芽高度最高，顯著高于其他基本培養(yǎng)基；腋芽萌發(fā)率也較高，為89.17%，與Anderson培養(yǎng)基上腋芽萌發(fā)率無顯著差異。因此，WPM培養(yǎng)基適合垂絲海棠生長。

表2 不同基本培養(yǎng)基對垂絲海棠腋芽萌發(fā)與生長的影響

2.3 不同植物激素處理組合對增殖培養(yǎng)的影響

由表3可知，在試驗(yàn)不同激素處理組合上，垂絲海棠均可增殖，但增殖方式不同。具體來看，在不添加激素的WPM培養(yǎng)基上，外植體上有少數(shù)腋芽直接萌發(fā)成芽，再生芽生長正常，但增殖系數(shù)較低。培養(yǎng)基中添加一定濃度IAA后，增殖系數(shù)顯著提高，且隨著IAA濃度的增加而提高；添加0.5 mg/L IAA時，多數(shù)腋芽萌發(fā)并正常生長；添加1.0 mg/L IAA時，腋芽直接萌發(fā)，但生長速度較快，導(dǎo)致莖細(xì)弱，不利于后續(xù)試驗(yàn)。在培養(yǎng)基中添加一定濃度的分裂素BA，外植體腋芽部位出現(xiàn)芽叢，但芽叢上再生芽生長速度緩慢，有效增殖系數(shù)低，多數(shù)再生芽不能正常生長；且BA濃度為1.0 mg/L 時，芽叢上部分再生芽玻璃化，單獨(dú)使用BA不能獲得理想的增殖效果。當(dāng)IAA和BA配合使用時，外植體腋芽部位出現(xiàn)芽叢；當(dāng)培養(yǎng)基中添加1.0 mg/LIAA和0.5 mg/L BA時，有效增殖系數(shù)最高，但再生芽生長緩慢，部分再生芽頂端玻璃化。因此，理想的垂絲海棠增殖培養(yǎng)基為：WPM+0.5 mg/L IAA。

表3 不同濃度IAA和BA對增殖培養(yǎng)的影響

2.4 生長素種類及濃度對組培苗生根的影響

由表4可知，在不加生長素的WPM培養(yǎng)基上，垂絲海棠的生根率和平均根條數(shù)較低，根細(xì)長，根毛少，生長緩慢。在WPM培養(yǎng)基中添加生長素對誘導(dǎo)生根有顯著的影響，但不同的生長素對生根的影響效果不同。培養(yǎng)基中添加IAA，誘導(dǎo)產(chǎn)生的根生長緩慢，且根粗短、肉質(zhì)，無根毛，這種根一般不具備主動吸收功能，不利于后續(xù)移栽試驗(yàn)。而在培養(yǎng)基中添加NAA時，不同濃度水平下垂絲海棠生根率和平均根條數(shù)差異顯著；添加0.25 mg/L NAA時，組培苗生根率、平均根條數(shù)最高，生根率為92.22%，平均根條數(shù)為5.84條，顯著高于其他處理下的生根率與平均根條數(shù)，且根粗壯，根毛多，生長速度較快；但增加NAA使用濃度后，組培苗生根率、平均根條數(shù)降低，根毛逐漸變少，在根莖處會形成愈傷組織。因此，垂絲海棠最佳生根培養(yǎng)基配方為WPM+0.25 mg/L NAA。

表4 不同生長素種類及濃度對組培苗生根的影響

2.5 組培苗移栽馴化

共選取90株生長健壯、根系良好的垂絲海棠組培苗，室內(nèi)自然光下馴化煉苗5 d后，移入草炭∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1(體積比)的混合基質(zhì)中培養(yǎng)，移栽30 d后有86株垂絲海棠長勢良好，其移栽成活率為95.56%。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過對外植體消毒、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和馴化移栽等關(guān)鍵技術(shù)的研究，建立垂絲海棠組培快繁體系。以垂絲海棠生長健壯的當(dāng)年春梢莖段為外植體，70%酒精30 s+2%次氯酸鈉消毒12 min，接種至WPM+10 mg/L GA3上誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)；待腋芽萌發(fā)，剪取新梢接種至WPM+0.5 mg/L IAA上進(jìn)行增殖培養(yǎng)獲得再生芽；剪取再生芽于WPM+0.25 mg/L NAA上生根；生根后自然光下馴化煉苗5 d，移栽到草炭∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1(體積比)的消毒基質(zhì)中，移栽成活率可達(dá)95.56%。本試驗(yàn)結(jié)果為垂絲海棠工廠化育苗及后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

外植體消毒是建立組織培養(yǎng)快繁體系的第一步。試驗(yàn)以垂絲海棠莖段為外植體，分別選取一年生休眠枝條莖段和當(dāng)年春梢嫩枝莖段進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，以春梢嫩枝莖段為外植體，并以70%酒精30 s結(jié)合2%次氯酸鈉溶液消毒處理12 min，其消毒效果理想。這可能與外植體的帶菌狀況與生理狀態(tài)有關(guān)，冬季休眠枝中內(nèi)源微生物較多，細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，消毒相對困難；而6月上旬植株生長時間短，自身和表面帶菌少，且細(xì)胞活性強(qiáng)，消毒相對容易。同時，前人建立垂絲海棠無菌體系均以升汞為消毒劑，雖然升汞消毒效果較好，但由于升汞具有較大的毒性，使用受到管控，目前已較少使用。本試驗(yàn)以低毒、環(huán)保的次氯酸鈉溶液作為消毒劑，得到了替代升汞且污染率、死亡率較低，存活率較高的消毒方法。

基本培養(yǎng)基提供了植物生長發(fā)育所需的營養(yǎng)元素，但因?yàn)楦鞣N植物的遺傳特性、生物學(xué)特性和生態(tài)學(xué)特性不一致，它們對營養(yǎng)的要求各不相同，甚至同種間不同品種對基本培養(yǎng)基的需求也不相同[14-15]。MS通用培養(yǎng)基被廣泛應(yīng)用，但這并不能說明MS培養(yǎng)基適用于所有植物。有研究表明，MS對木本植物有一定的毒害作用；一般速生樹種宜用高鹽培養(yǎng)基，慢生樹種需要適當(dāng)降低鹽濃度[16-17]。本試驗(yàn)以MS、1/2 MS、Anderson、B 5、WPM五種植物常用基本培養(yǎng)基，研究不同基本培養(yǎng)基對垂絲海棠腋芽萌發(fā)與生長的影響，結(jié)果表明，WPM培養(yǎng)基適合垂絲海棠生長，這與張玲玲等[11]的研究結(jié)果一致，說明低鹽濃度培養(yǎng)基更適合用于垂絲海棠腋芽啟動萌發(fā)與生長。

一般認(rèn)為，植物器官的分化取決于內(nèi)源激素的平衡，外源激素通過改變內(nèi)源激素的平衡而產(chǎn)生作用，外加的細(xì)胞分裂素及生長素達(dá)到一定的濃度和比例，才使器官發(fā)生達(dá)到預(yù)期目的[18]。本試驗(yàn)在垂絲海棠增殖培養(yǎng)過程中出現(xiàn)2種增殖方式：通過腋芽產(chǎn)生叢生芽或腋芽直接萌發(fā)成芽。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用外源生長素IAA垂絲海棠增殖方式為腋芽直接萌發(fā)成芽；而單獨(dú)使用外源分裂素BA或IAA與BA配合使用時，垂絲海棠通過腋芽產(chǎn)生叢生芽進(jìn)行增殖，這與蔡文博等[19]認(rèn)為，生長素類物質(zhì)在2種方式中均是必需的結(jié)論不一致，可能是外植體的內(nèi)源激素水平不一致，而與其認(rèn)為細(xì)胞分裂素類物質(zhì)在促發(fā)叢生芽的方式中是必需的，但在腋芽萌發(fā)成新梢中不是必需的結(jié)論相一致。試驗(yàn)選擇以腋芽直接萌發(fā)成芽的方式進(jìn)行增殖，雖然增殖系數(shù)相對較低，但大多數(shù)再生苗生長健壯，可直接進(jìn)行生根培養(yǎng)。因此，從組培效率看，腋芽直接萌發(fā)成芽的增殖方式效率更高，并且在一定程度上保證了垂絲海棠在組培快繁過程中的遺傳性狀的穩(wěn)定性。