龍 毅， 劉 趣， 徐文芬， 孫慶文， 趙武霞， 王 波， 陳 亮

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)， 貴陽 550025)

石吊蘭為2020年版《中國藥典》一部收載品種，也為2003年版《中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載的貴州少數(shù)民族常用藥物，又名巖豇豆，來源于苦苣苔科吊石苣苔屬植物吊石苣苔(LysionotuspauciflorusMaxim.)的干燥地上部分，具有止咳化痰、軟堅(jiān)散結(jié)、健脾消積之功效，常用于治療咳嗽痰多、瘰疬痰核等疾病，民間常用來治療慢性支氣管炎、肺結(jié)核、風(fēng)濕疼痛、跌打損傷等病癥[1-2]。其原植物主要生長于喀斯特地貌地區(qū)的巖石上或樹上，海拔300～2 000 m[3-4]。目前，市場上石吊蘭藥材主要依賴野生資源，隨著臨床需求越來越大，導(dǎo)致野生資源量逐漸減少，而石吊蘭的人工栽培馴化尚缺乏系統(tǒng)科學(xué)的研究基礎(chǔ)，嚴(yán)重影響了民族藥資源的保護(hù)與可持續(xù)利用，加之各方面基礎(chǔ)研究較薄弱，這將是制約貴州特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)穩(wěn)步健康發(fā)展的瓶頸問題。

種質(zhì)資源對藥材質(zhì)量存在根本性的影響，是中藥材規(guī)?；?guī)范化基地建設(shè)的先決條件[5-8]。因此，開展對石吊蘭野生種質(zhì)資源品質(zhì)評價(jià)，篩選其優(yōu)良種源是該藥材規(guī)范化種植研究的關(guān)鍵，本課題組開展了石吊蘭藥材引種馴化、野生撫育與品質(zhì)評價(jià)等研究，發(fā)現(xiàn)連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、5,4′-二羥基-6,7-二甲氧基-8-C-β-D-葡萄糖苷(以下簡稱Ⅰ)及7-羥基-6,8,4′-三甲氧基-5-O-β-D-葡萄糖黃酮苷(以下簡稱Ⅱ)均對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2 B體外支氣管炎有較強(qiáng)的抑制作用，其中吊蘭素是現(xiàn)行《中國藥典》收載石吊蘭質(zhì)量控制指標(biāo)。本文擬以石吊蘭素、連翹脂苷B等上述5種有效成分為指標(biāo)，采用超高效液相色譜法(UPLC)建立多指標(biāo)成分含量測定方法[9-12]，分析評價(jià)產(chǎn)自不同地域的石吊蘭種源藥材質(zhì)量，篩選出最優(yōu)石吊蘭種質(zhì)資源。本研究將為科學(xué)地種植和可持續(xù)利用石吊蘭藥材提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1試藥及供試樣品

連翹脂苷B對照品(批號：111811-201603)、毛蕊花糖苷對照品(批號：111530-201512)、石吊蘭素對照品(批號：111555-200602)均購于中國食品藥品檢定研究院；Ⅰ與Ⅱ均由實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)核磁共振、質(zhì)譜等波譜技術(shù)結(jié)合文獻(xiàn)鑒定結(jié)構(gòu)，采用UPLC峰面積歸一化法測定，其純度均達(dá)98%以上，可供含量測定用，以下分別用Ⅰ、Ⅱ表示。乙腈、甲醇(美國天地有限公司，色譜級)；甲酸、甲醇、乙醇等、均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為重蒸餾水。

供試藥材樣品(S 1～S 30)經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慶文教授鑒定為苦苣苔科吊石苣苔屬植物吊石苣苔(LysionotuspauciflorusMaxim.)的新鮮或干燥全草，凈制后于40 ℃低溫烘干、粉碎、過三號篩，備用。樣品信息見表4。

1.1.2儀 器

Agilent 1290超高效液相色譜儀(DAD檢測器，雙二元梯度泵)；AG 135電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-500 DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FN 101-2 A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(長沙儀器儀表廠)等。

1.2 方 法

1.2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸水-乙腈，梯度洗脫(洗脫程序見表1)；檢測波長為332 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量3 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.2.2溶液的制備

1) 對照品溶液的制備：分別取連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、Ⅰ及Ⅱ的對照品適量，精密稱定，加80%甲醇溶液溶解制成質(zhì)量濃度分別為5.006 mg/mL、2.500 mg/mL、0.400 0 mg/mL、0.160 0 mg/mL及1.004 mg/mL的單一對照品溶液，作為儲備液。然后精密吸取各儲備液0.5 mL并置于容量瓶中，加80%甲醇溶液制成每1 mL分別含連翹脂苷B為100.1 μg、毛蕊花糖苷為50.00 μg、石吊蘭素為8.000 μg、Ⅰ為3.200 μg及Ⅱ?yàn)?0.08 μg的混合對照品溶液，置4 ℃下冷藏，備用。

2) 供試品溶液的制備：取粉碎過三號篩的石吊蘭藥材粉末0.5 g，準(zhǔn)確稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液15 mL，搖勻，密塞，稱定其重量，超聲處理20 min，取出，冷卻至室溫，以相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失的重量，過濾，即得供試品溶液。

1.2.3專屬性、線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率試驗(yàn)

1) 專屬性試驗(yàn)。分別取上述混合對照品溶液、供試品溶液，以80%甲醇溶液為空白溶液，按優(yōu)化確定的色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄對照品溶液、供試品溶液及空白溶液的色譜圖及待測成分色譜峰的紫外吸收光譜圖。

2) 線性關(guān)系考察。取上述單一對照品溶液，分別制備成一系列梯度濃度對照品溶液，按照優(yōu)化確定的色譜條件分別進(jìn)樣測定，記錄色譜峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

3) 精密度試驗(yàn)。取上述混合對照品溶液，按優(yōu)化確定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄各待測成分峰面積，計(jì)算其峰面積的RSD值。

4) 重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批藥材粉末(S 29)6份，每份0.5 g，精密稱定，按照供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，按優(yōu)化確定的色譜條件分別進(jìn)樣測定，將各待測成分峰面積分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量，并計(jì)算其含量的RSD值。

5) 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取石吊蘭藥材粉末(S 29)0.5 g，精密稱定，按1.2.2方法制備供試品溶液，在優(yōu)化確定的色譜條件下分別于0、4、8、12、24、36 h進(jìn)樣測定，記錄各待測成分峰面積，計(jì)算其峰面積的RSD值。

6) 加樣回收試驗(yàn)。取已知含量的石吊蘭藥材粉末(S 29)0.25 g，精密稱定，按1∶1的比例加入對照品，按照供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，按優(yōu)化確定的色譜條件分別進(jìn)樣測定，將各待測成分峰面積分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量，并計(jì)算回收率和RSD值。

1.2.4樣品測定

分別取30批貴州不同種源石吊蘭藥材，按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，并按優(yōu)化確定的色譜條件進(jìn)樣分析，分別記錄各待測成分的峰面積，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，計(jì)算干燥品石吊蘭藥材中連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、Ⅰ、Ⅱ的平均含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性、專屬性、線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性，連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、Ⅰ及Ⅱ 5種成分的色譜峰，色譜峰彼此之間及與雜質(zhì)峰之間的分離度均≥1.5，峰形對稱，且理論塔板數(shù)均不低于3 000。專屬性如圖1所示，供試品溶液中的待測成分色譜峰與對照品溶液中的連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、Ⅰ、Ⅱ及石吊蘭素的保留時(shí)間和紫外吸收光譜圖一致，且各色譜峰的純度因子均>0.991，分離度均>1.5，達(dá)到基線分離；空白溶液在相應(yīng)的保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn)，說明空白溶液對待測成分無干擾，表明該方法專屬性良好。線性關(guān)系，5種待測成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表2，結(jié)果表明，連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、Ⅰ及Ⅱ的進(jìn)樣量分別在0.004 806～15.02 μg，0.002 400～7.500 μg，0.001 920～1.200 μg，0.007 500～0.480 0 μg，0.000 963 8～3.012 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。精密度，連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、Ⅰ及Ⅱ?qū)φ掌贩迕娣e的RSD值分別為1.1%、1.8%、0.53%、1.9%、0.84%，均符合2020年版《中國藥典》四部(通則0512)系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)要求，表明儀器精密度良好。重復(fù)性，6份供試品中連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、Ⅰ及Ⅱ的平均含量分別為1.5%、0.058%、0.34%、0.008 8%、0.13%，其RSD值分別為1.1%、1.3%、1.0%、2.5%、1.2%，均符合2020年版《中國藥典》四部(通則9101)相關(guān)要求，表明此方法測定的重復(fù)性良好。穩(wěn)定性，供試品中5種待測成分峰面積的RSD值分別為1.4%、2.3%、0.35%、1.0%、0.40%，均小于3.0%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

注：A為空白溶液；B為供試品溶液；C為對照品溶液；1為連翹酯苷B；2為毛蕊花糖苷；3為5,4′-二羥基-6,7-二甲氧基-8-C-β-D-葡萄糖苷(Ⅰ)；4為7-羥基-6,8,4′-三甲氧基-5-O-β-D-葡萄糖黃酮苷(Ⅱ)；5為石吊蘭素。

表2 5種待測成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍結(jié)果

2.2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、Ⅰ、Ⅱ的回收率分別為96.75%、104.68%、101.34%、100.88%、105.31%，其RSD值分別為2.5%、1.8%、3.5%、2.8%、2.0%，均符合2020年版《中國藥典》四部(通則9101)相關(guān)要求，表明該方法測定結(jié)果的準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3 樣品測定結(jié)果

30批石吊蘭不同種源藥材干燥樣品中連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、Ⅰ、Ⅱ的含量，結(jié)果見表4和圖2。

表4 30批石吊蘭不同種源藥材中5種有效成分含量測定結(jié)果(n=3)

圖2 30批石吊蘭不同種源藥材中5種有效成分含量

3 討 論

通過測定30批貴州石吊蘭不同種質(zhì)資源藥材中連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、5,4′-二羥基-6,7-二甲氧基-8-C-β-D-葡萄糖苷(Ⅰ)及7-羥基-6,8,4′-三甲氧基-5-O-β-D-葡萄糖黃酮苷(Ⅱ)的含量，不同種源藥材中5種有效成分的含量差異均表現(xiàn)為連翹酯苷B>毛蕊花糖苷>Ⅱ>石吊蘭素>Ⅰ。結(jié)果顯示，以貴州惠水大龍鄉(xiāng)、長順代化鎮(zhèn)、冊亨戴家坡、安龍仙鶴坪產(chǎn)地的總含量較高。這一結(jié)果驗(yàn)證了不同的環(huán)境會引起同一藥材原植物性狀和代謝產(chǎn)物的差異。根據(jù)本研究結(jié)果，上述4個(gè)產(chǎn)地的石吊蘭可作為最佳引種種質(zhì)，建議可以通過引種觀察及野生馴化研究，為民族藥石吊蘭的良種選育及規(guī)?；?guī)范化種植研究提供前期基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)在前期石吊蘭指紋圖譜測定和文獻(xiàn)基礎(chǔ)上分別對流動(dòng)相、色譜柱、波長、柱溫等進(jìn)行優(yōu)化后確定色譜條件。同時(shí)為了最大限度地提取待測成分，提高檢測的靈敏度，先后對提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間、料液比進(jìn)行考察，其中以提取溶劑和料液比的影響較大，提取方法、提取時(shí)間考察結(jié)果差異不明顯，所以從提取操作方便和試劑成本角度出發(fā)，最終確定上述供試品溶液制備方法。

本研究在闡明石吊蘭抗支氣管炎藥效物質(zhì)的基礎(chǔ)上，建立了石吊蘭藥材多有效成分指標(biāo)含量測定方法，能夠較全面地反映石吊蘭藥材的內(nèi)在質(zhì)量，為石吊蘭不同種質(zhì)資源藥材質(zhì)量的客觀評價(jià)奠定了理論基礎(chǔ)。同時(shí)，所建立的方法操作簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為石吊蘭藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制和質(zhì)量評價(jià)提供了參考。