張希芬 林偉 李清鈺 劉榮欣 劉建陽 王美 丁應福 趙棟霖 張成省

摘 ?要：為減輕化學藥劑防治煙草疫霉帶來的弊端，提高生防菌劑效果，通過瓊脂糖擴散法篩選抗性木霉并構建木霉和枯草芽孢桿菌Tpb55共培養(yǎng)體系，采用菌絲生長速率法評價了種間互作防治煙草疫霉的效果，利用單因素法優(yōu)化共培養(yǎng)體系的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件，并通過盆栽試驗驗證其對煙草黑脛病的防治效果。結果表明，棘孢木霉HG1具有良好的抗煙草疫霉活性，與枯草芽孢桿菌Tpb55的共培養(yǎng)體系如下：HG1（106 CFU/mL）接種量為2%，與Tpb55（106 CFU/mL）接種比例為10∶1，采用序列共培養(yǎng)方式，即先接種HG1，24 h后接種Tpb55。優(yōu)化后的最適培養(yǎng)基成分為木糖10 g/L，蛋白胨和酵母粉（質量比為2∶1）5 g/L;最佳發(fā)酵為溫度25 ℃，初始pH 7.5，轉速140 r/min。共培養(yǎng)發(fā)酵液盆栽防病效果顯著優(yōu)于單培養(yǎng)，防治效果達到74.72%。該體系發(fā)酵后能夠明顯提升兩株生防菌抑制煙草疫霉的活性，并對煙草黑脛病具有顯著防病效果，為后續(xù)多菌株共發(fā)酵生防菌劑的開發(fā)提供基礎。

關鍵詞：棘孢木霉;枯草芽孢桿菌;煙草疫霉;共培養(yǎng);發(fā)酵條件

Abstract： In order to reduce the disadvantages of chemical control of Phytophthora nicotianae and improve the effect of biocontrol agents， Trichoderma asperellum HG1 with obvious anti-Phytophthora nicotianae activity was obtained by the agarose diffusion method and the a co-culture system of Trichoderma asperellum HG1 and Bacillus subtilis Tpb55 was constructed to evaluate the inhibition effect of interspecific interaction against Phytophthora nicotianae by the mycelial growth rate method. The composition of medium media and fermentation conditions were optimized by single factor experiment. The control effects of co-culture and single-culture fermentation liquors of Trichoderma asperellum HG1 and Bacillus subtilis Tpb55 on tobacco black shank were compared by pot experiments. The suitable co-culture system was determined as follows： the inoculation ratio of HG1 （106 CFU/mL） and Tpb55 （106 CFU/mL） was 10：1. Sequential inoculation was adopted as HG1 was inoculated first， and Tpb55 was inoculated after 24 h. The fermentation broth composition and culture conditions of the co-culture system were optimized by single factor method， guiding by the inhibition rate of Phytophthora nicotianae. The optimum medium composition was determined as follows： xylose 10 g/L， peptone and yeast powder （the mass ratio was 2：1） 5 g/L; The optimal fermentation conditions were as follows： temperature 25 ℃， initial pH 7.5， rotating speed 140 r/min. The disease control effect of co-culture fermentation liquors in pot experiments was 74.72%， which was significantly better than that of single-culture. The system could significantly improve the inhibition activity of the two biocontrol strains against Phytophthora nicotianae， and the fermentation liquors of the system had significant disease control effect on tobacco black shank， which provides a basis for the development of subsequent multi strain co-culture biocontrol agents.

Keywords： Trichoderma asperellum; Bacillus subtilis; Phytophthora nicotianae; co-culture; fermentation conditions

煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）是一種危害嚴重的病原卵菌，其引起的煙草黑脛病每年對各地煙葉生產(chǎn)造成極大損失[1-3]。目前仍以化學防治為主，存在農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、病菌抗藥性等問題[4-6]。生物防治因其成本低、環(huán)境友好、無藥物殘留等優(yōu)點成為植物土傳病害防治領域的研究熱點[7-8]。目前已有較多關于木霉、芽孢桿菌等生防菌株對煙草黑脛病防治效果的報道。

李小杰等[9]篩選出3株木霉菌對煙草疫霉具有較強抑制作用，且對煙草黑脛病均具有較好室內防效，其中近漸綠木霉（Trichoderma paraviridescens）XYLS-5對煙草黑脛病防效達80%以上。宋玉娟等[10]研究表明棘孢木霉T-6在溫室盆栽條件下對煙草黑脛病和根黑腐病的防治效果分別達到74.45%和75.14%，具有良好應用潛力。LIN等[11]發(fā)現(xiàn)內生淀粉樣芽孢桿菌BA01可以顯著降低馬鈴薯赤霉病的發(fā)生率。何明川等[12]在美洲大蠊腸道中分離得到一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）MC4-2菌株，室內盆栽試驗結果表明其對煙草黑脛病防效達到63.86%。陸新莉等[13]從健康煙草根際土壤中分離出5株對黑脛病菌具有較強拮抗作用的根際細菌，而田間防效中對黑脛病防效最好的菌株YWGJ07初步鑒定為芽孢桿菌屬。

然而，單一菌株存在定殖不穩(wěn)定等問題，而混合菌株的共同培養(yǎng)可以提高抑制病原體的活性，并擴大環(huán)境適應性[14-16]。利用多種微生物防治植物病害是提高生物防治效果的有效方法。叢韞喆[17]發(fā)現(xiàn)擬康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）與黑根霉（Rhizopus nigricans）混合發(fā)酵液的施用可以在土壤中建立新的微生物生態(tài)平衡，改善土壤的理化生性狀，對病害防治效果明顯。李兆防[18]發(fā)現(xiàn)球毛殼（Chaetomium globosum）ND35、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）T88和深綠木霉（T. atroviride）T95兩兩混合菌株對立枯病和根腐病的防治效果都高于單一拮抗菌。

本研究篩選了一株具有顯著抗煙草疫霉活性的木霉，與本課題組前期篩選出的一株抗煙草疫霉的枯草芽孢桿菌Tpb55進行共培養(yǎng)，以對煙草疫霉的抑制率為標準，建立合適的培養(yǎng)體系后進行單因素優(yōu)化試驗，并利用發(fā)酵液進行煙草黑脛病盆栽試驗，以驗證其防病效果。

1 ?材料與方法

1.1 ?供試材料

1.1.1 ?供試菌株 ?木霉分離自海南紅樹林樣品，共23株，通過分子生物學及形態(tài)學方法進行鑒定;枯草芽孢桿菌Tpb55分離自煙草葉面生境[19]。病原菌為煙草疫霉JM01菌株，分離自煙草黑脛病株[20]。以上菌株均采用甘油保存法（50%甘油∶馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基=1∶1）保存于中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所海洋農(nóng)業(yè)研究中心。

1.1.2 ?活化培養(yǎng)基 ?馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基[21]、營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基[22]、營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基[22]、燕麥（OA）培養(yǎng)基[23]、LA培養(yǎng)基[23]，均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 ?優(yōu)化培養(yǎng)基 ?GPYE（改良葡萄糖蛋白胨酵母粉培養(yǎng)基）[24]：葡萄糖10 g/L，蛋白胨2 g/L，酵母粉1 g/L，其余為蒸餾水，調節(jié)pH=7。Czapek-Dox（察氏培養(yǎng)基）[25]、PDW（馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基）[23]、LB肉湯[23]，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 ?菌株種子液制備

1.2.1 ?木霉孢子懸浮液制備 ?木霉在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5 d，以無菌水沖洗孢子，血球計數(shù)板測定孢子懸浮液濃度，并用無菌水將濃度調整至106 CFU/mL備用。

1.2.2 ?枯草芽孢桿菌Tpb55種子液制備 ?枯草芽孢桿菌Tpb55菌液在LA培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜即得到Tpb55菌液。紫外分光光度計測定OD值，調整濃度為106 CFU/mL備用。

1.3 ?具有抗煙草疫霉活性的木霉菌株篩選

將23株木霉孢子懸浮液各取5 mL分別接種于NB培養(yǎng)基（250 mL/500 mL）中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)。紗布分離第15天時的發(fā)酵液和菌體。發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取后旋蒸濃縮至干。菌體用甲醇和二氯甲烷1∶1混合液100 mL浸泡3 d后過濾，濾液濃縮后，水相采用1.5倍體積的乙酸乙酯萃取后旋蒸濃縮至干。將得到的23種發(fā)酵液和23種發(fā)酵菌體提取物分別用二甲亞砜（DMSO）溶解，配制成10.0 mg/mL溶液。采用瓊脂糖擴散法測其對煙草疫霉的活性。

瓊脂糖擴散法：以P. nicotianae為靶標，燕麥（OA）培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)4 d后，用無菌打孔器取直徑為5 mm的菌餅，倒置于新的OA平板中央。在離培養(yǎng)基邊緣3 cm處打取4個直徑為5 mm的孔，4個小孔呈十字排列。在其中3個孔中加入30 μL發(fā)酵液和發(fā)酵菌體提取物，另一孔中加入DMSO作對照，28 ℃培養(yǎng)72 h，觀察抑菌圈大小。

1.4 ?共培養(yǎng)體系的構建

本研究采用液體培養(yǎng)基對1.3中篩選出的活性木霉與枯草芽孢桿菌進行共培養(yǎng)和單培養(yǎng)。共培養(yǎng)模式為聯(lián)合共培養(yǎng)和序列共培養(yǎng)[26]。聯(lián)合共培養(yǎng)：5 mL木霉孢子懸浮液和500 μL枯草芽孢桿菌Tpb55種子液同時接種于NB培養(yǎng)基（250 mL/500 mL瓶）中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)。序列共培養(yǎng)：先分別接種木霉孢子懸浮液或枯草芽孢桿菌種子液，24 h后接種另一菌株，其余條件與聯(lián)合共培養(yǎng)一致。通過評價兩種生防菌株的生長情況，確定培養(yǎng)方式為先接種木霉，再接種芽孢桿菌。

在培養(yǎng)3、5、7 d時分別取5 mL發(fā)酵液過濾除菌后，用菌絲生長速率法測其對煙草疫霉的活性，以確定最適發(fā)酵時間。

菌絲生長速率法：取5 mL過膜除菌后的發(fā)酵液加入20 mL燕麥培養(yǎng)基中混合均勻，制作平板培養(yǎng)基。從活化后的黑脛病菌落邊緣，取直徑為5 mm的菌餅，倒置于平板中央。28 ℃恒溫培養(yǎng)96 h，采用十字交叉法記錄菌餅生長直徑，計算抑制率。每個處理重復3次。

抑制率（%）=（對照組病原生長直徑?處理組病原直徑）/對照組病原直徑×100.

5 mL木霉孢子懸浮液接種到NB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24、36和48 h后接種500 μL枯草芽孢桿菌Tpb55種子液，連續(xù)培養(yǎng)7 d[27]。以發(fā)酵液的抗煙草疫霉效果評價合適接種時間。

1.5 ?單因素優(yōu)化

按照1.4構建的共培養(yǎng)體系，對培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件進行下列單因素試驗，用生長速率法測定1 mg/mL發(fā)酵液提取物對煙草疫霉的抑制活性，以選出最優(yōu)單因素。每組處理設3次重復。

1.5.1 ?基礎培養(yǎng)基的選擇 ?選擇GPYE、察氏培養(yǎng)基、PDW、NB、LB共5種培養(yǎng)基作為木霉與枯草芽孢桿菌Tpb55共培養(yǎng)的培養(yǎng)基，進行篩選。

1.5.2 ?碳源種類及濃度 ?以木糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖以及淀粉替換基礎培養(yǎng)基中的碳源，每種碳源的濃度均為10 g/L。篩選出的最佳碳源濃度設置為0、5、10、20、30 g/L，篩選最優(yōu)濃度。

1.5.3 ?氮源種類及濃度 ?以花生餅粉、胰蛋白胨、玉米粉和味精替換基礎培養(yǎng)基中的氮源，每種氮源的濃度均為3 g/L，進行篩選。篩選出的最佳氮源的濃度設置為1、3、5、7、9 g/L，篩選最優(yōu)濃度。

1.5.4 ?初始pH ?使用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調節(jié)培養(yǎng)基的初始pH為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，進行篩選。

1.5.5 ?發(fā)酵溫度 ?采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和初始pH，設定溫度為23、25、28、30 ℃，進行篩選。

1.5.6 ?搖床轉速 ?采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基、初始pH和溫度，設置搖床轉速為120、140、160、180 r/min，進行篩選。

1.6 ?盆栽防病試驗

煙草疫霉菌谷制備方法：用蒸餾水熬煮谷子約30 min，至2/3谷子開花后取出用紗布過濾水分，置于錐形瓶中高壓滅菌（115 ℃、30 min）。將煙草疫霉接種于燕麥培養(yǎng)基（OA）上活化4 d后，用打孔器取疫霉菌餅。每瓶滅菌谷子培養(yǎng)基中放置3～5個菌餅，25 ℃下培養(yǎng)14 d，即為煙草疫霉菌谷。

將土壤與疫霉菌谷混勻（每公斤土壤加入4 g菌谷）作為病土，供試土壤為煙草所即墨基地滅菌基質土。選取長勢一致的煙苗移栽到病土中，并立即施加生防菌株發(fā)酵菌液10倍稀釋液。盆栽試驗共設5個處理：CK（清水處理）;枯草芽孢桿菌Tpb55菌液;棘孢木霉HG1菌液;Tpb55+HG1復配菌液（各自發(fā)酵，共同施用）;Tpb55+HG1共培養(yǎng)菌液（共同發(fā)酵）。

每個花盆1株煙，每個處理15株，重復3次。移栽后第21天以株為單位對各處理煙草黑脛病發(fā)病情況進行調查，統(tǒng)計病情指數(shù)和防病效果。

1.7 ?數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Office Excel 2019和SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用Adobe Photoshop 2020作圖。

2 ?結 ?果

2.1 ?棘孢木霉HG1與枯草芽孢桿菌Tpb55共培養(yǎng)體系的構建

在本研究中，篩選到3株對煙草疫霉具有明顯抑制活性的木霉，分別為里氏木霉HT6和HT7，以及棘孢木霉HG1。聯(lián)合共培養(yǎng)以及序列共培養(yǎng)1（先加入枯草芽孢桿菌，后加入木霉）均表現(xiàn)為枯草芽孢桿菌Tpb55生長迅速，木霉未見生長。而序列共

培養(yǎng)2（先木霉，后Tpb55）中，3株木霉和枯草芽孢桿菌Tpb55共培養(yǎng)后均能較好生長。在此發(fā)酵條件下，分別在發(fā)酵3、5、7 d取發(fā)酵液進行抗菌活性測定，發(fā)現(xiàn)第7天時的發(fā)酵液具有抗疫霉活性。故采用序列共培養(yǎng)，先加入木霉，培養(yǎng)24 h再加入枯草芽孢桿菌Tpb55，發(fā)酵時間為7 d。3株木霉與枯草芽孢桿菌Tpb55共培養(yǎng)后，均能提高抗煙草疫霉活性。與單培養(yǎng)及其他共培養(yǎng)處理相比，棘孢木霉HG1與Tbp55共培養(yǎng)后，發(fā)酵液活性最高，菌絲抑制率達到40.65%（表1）。

通過將棘孢木霉HG1培養(yǎng)24、36以及48 h后加入枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)，觀察兩株菌單培養(yǎng)及共培養(yǎng)時的菌絲生長狀態(tài)及其發(fā)酵液的抑菌活性。單獨培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌Tpb55呈乳黃色，棘孢木霉HG1呈淡黃色，菌絲呈絮狀。在HG1培養(yǎng)24 h后接種Tpb55，Tpb55和HG1能在共培養(yǎng)體系中生長，共培養(yǎng)7 d后的發(fā)酵液呈現(xiàn)暗黃至棕紅色，而在36 和48 h后接種，棘孢木霉HG1占主要地位，枯草芽孢桿菌Tpb55不能正常大量生長?？咕钚詼y試結果表明（圖1和表2），HG1培養(yǎng)24 h后接種Tpb55的發(fā)酵濾液抗疫霉活性（42.34%）顯著高于其他處理。

2.2 ?共培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基成分的單因素篩選

2.2.1 ?初始培養(yǎng)基的選擇 ?初始培養(yǎng)基的篩選結果如表3所示。棘孢木霉HG1單培養(yǎng)處理中，GPYE和Czapek-Dox培養(yǎng)基的抑菌率沒有顯著差異，但顯著高于其他3個培養(yǎng)基處理?？莶菅挎邨U菌Tpb55單培養(yǎng)處理中，GPYE的抑菌率最高，為44.20%±0.82%，顯著高于其他處理。同時，共培養(yǎng)處理中，GPYE的抑菌率（69.09%）依舊顯著高于其他4個處理。因此，選用GPYE培養(yǎng)基為初始培養(yǎng)基。

2.2.2 ?碳源優(yōu)化 ?圖2A表明，以木糖為碳源時的抑菌率為43.73%，顯著高于其他供試碳源。以木糖作為唯一碳源，篩選合適的碳源濃度，結果如圖2B所示，碳源濃度為10 g/L時，共培養(yǎng)發(fā)酵液提取物對煙草疫霉的抑制率最高，達到71.86%，顯著優(yōu)于其他濃度。因此，棘孢木霉HG1與枯草芽孢桿菌Tpb55共培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基成分中最佳碳源是木糖，最優(yōu)濃度為10 g/L。

2.2.3 ?氮源優(yōu)化 ?如圖3A所示，以蛋白胨+酵母粉

與胰蛋白胨作為氮源時，提取物對煙草疫霉的抑菌效果均顯著高于其他氮源，蛋白胨和酵母粉的效果（24.48%）稍好于胰蛋白胨（23.71%）。因此，選用蛋白胨和酵母粉作為最佳氮源。篩選最優(yōu)氮源濃度的結果如圖3B所示，當?shù)鞍纂撕徒湍阜蹪舛葹? g/L時，共培養(yǎng)發(fā)酵液提取物的抑煙草疫霉效果最好（79.75%）。因此，棘孢木霉HG1與枯草芽孢桿菌Tpb55共培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基成分中最佳氮源是蛋白胨和酵母粉（2∶1），最優(yōu)濃度為5 g/L。

2.3 ?共培養(yǎng)發(fā)酵條件的單因素篩選

通過單因素試驗篩選兩種菌株共培養(yǎng)的最適發(fā)酵條件（圖4）顯示，當初始pH為7.5時，發(fā)酵液提取物的抗疫霉效果最顯著，為47.11%（圖4A）。當溫度為25 ℃時，提取物的抑菌率為80.05%，顯著高于其他溫度處理（圖4B）。當轉速達到140 r/min時，共培養(yǎng)提取物的抑菌效果最好，達到56.88%（圖4C）。

綜上，棘孢木霉HG1與枯草芽孢桿菌Tpb55共培養(yǎng)體系單因素優(yōu)化試驗結果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源是10 g/L木糖，最適氮源是5 g/L的蛋白胨和酵母粉（其中蛋白胨∶酵母粉=2∶1）。培養(yǎng)基初始pH為7.5，接種棘孢木霉HG1和枯草芽孢桿菌Tpb55后以25 ℃、140 r/min條件下培養(yǎng)7 d后，共培養(yǎng)發(fā)酵液提取物對煙草疫霉的抑制率最高。

2.4 ?盆栽試驗效果

盆栽試驗證實了棘孢木霉HG1與枯草芽孢桿菌Tpb55共培養(yǎng)發(fā)酵液對煙草黑脛病有明顯的防治效果。如表4所示，處理后第21天，各處理與對照組相比發(fā)病程度均顯著降低。棘孢木霉HG1與枯草芽孢桿菌Tpb55共培養(yǎng)發(fā)酵液的防治效果顯著好于單獨發(fā)酵棘孢木霉HG1、枯草芽孢桿菌Tpb55以及兩種發(fā)酵液的復配施用，其病情指數(shù)為22.47，防治效果為74.72%。

3 ?討 ?論

將兩種或者兩種以上的生防菌株進行共培養(yǎng)，利用不同種群微生物的種間互作來刺激或者誘導活性代謝產(chǎn)物，進而防治植物病害或者促進其生長，已經(jīng)被認為是一種有效的手段[16，26]。本試驗通過改變兩株菌的先后接種順序及間隔接種時間，結果發(fā)現(xiàn)棘孢木霉HG1接種24 h后接種枯草芽孢桿菌Tpb55時兩株菌均能生長良好且抑菌效果最好，這可能是菌株互相作用造成了抗菌代謝產(chǎn)物類型和產(chǎn)量的不同。KARUPPIAH等[26]基于聯(lián)合共培養(yǎng)和序列共培養(yǎng)兩種接種方式評估了菌體生長情況，結果表明聯(lián)合共培養(yǎng)中解淀粉芽孢桿菌1841的快速生長導致棘孢木霉GDFS1009生長速率的下降，而先接種木霉后接種芽孢桿菌促進了兩種微生物的生長，這與本研究的結果一致。

與單培養(yǎng)相比，多菌株共培養(yǎng)可以刺激菌株分泌更多種類和更高產(chǎn)量的次生代謝物，而菌株代謝產(chǎn)物往往與其抗菌活性有關。周麗梅等[28]通過分析對比Brevibacillus laterosporus BL-21和Bacillus subtilis HNDF兩株菌共培養(yǎng)與單培養(yǎng)的抑菌效果和代謝產(chǎn)物差異，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)液較B. laterosporus BL-21和B. subtilis HNDF2單培養(yǎng)液的抑菌活性分別提高了18.75%和83.90%。KARUPPIAH等[26-27]通過代謝組分析發(fā)現(xiàn)，相比單培養(yǎng)，共培養(yǎng)促進了新物質的產(chǎn)生和代謝物產(chǎn)量的提高，并且可以刺激與產(chǎn)孢、次生代謝、拮抗和植物促生相關酶以及抗氧化劑相關基因的表達。本研究將篩選出的棘孢木霉HG1與枯草芽孢桿菌Tpb55共培養(yǎng)后，其發(fā)酵濾液抑菌率為40.65%，顯著優(yōu)于單培養(yǎng)，推測共培養(yǎng)發(fā)酵液中抑菌活性物質種類和產(chǎn)量發(fā)生較大變化。

發(fā)酵過程中，生防菌株的生長狀態(tài)及活性物質的種類和產(chǎn)量常受到培養(yǎng)基營養(yǎng)成分以及發(fā)酵條件的影響[28-29]。適宜菌株生長的營養(yǎng)條件和發(fā)酵條件可以提高菌量，使得活性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和種類增加，從而提高其生防活性[30-31]。DUAN等[32]通過單因素試驗和響應面實驗優(yōu)化后得出，0.5%蛋白胨、2.4%蔗糖、發(fā)酵62 h的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液抑菌圈直徑相比基礎發(fā)酵液增加了12.65%。SORDE等[33]的研究表明優(yōu)化溫度、pH和轉速后的環(huán)狀芽孢桿菌產(chǎn)轉谷氨酰胺酶活性得到顯著性提升。本研究通過優(yōu)化碳源、氮源的種類和濃度以及發(fā)酵體系中的溫度、初始pH、轉速，使發(fā)酵液的抗煙草疫霉活性得到顯著提高，與前人結果基本一致。

4 ?結 ?論

本試驗將篩選出的棘孢木霉HG1與枯草芽孢桿菌Tpb55構建共培養(yǎng)體系，證明其初始共培養(yǎng)條件下發(fā)酵液濾液對煙草疫霉抑菌活性為40.65%，顯著優(yōu)于單培養(yǎng)。通過單因素優(yōu)化試驗，確定的最優(yōu)培養(yǎng)基成分為10 g/L木糖和5 g/L蛋白胨+酵母粉，最佳發(fā)酵條件溫度25 ℃，初始pH 7.5，轉速140 r/min。優(yōu)化后的共培養(yǎng)發(fā)酵液對煙草黑脛病的盆栽防治效果為74.72%，顯著高于其他處理。后續(xù)將進一步探索共培養(yǎng)發(fā)酵體系抑菌活性成分的分離提取及代謝通路差異等機制研究，為生防菌劑的產(chǎn)業(yè)化提供理論基礎。

參考文獻

[1]DAS A K， NERKAR S， GAWANDE N， et al. SCAR marker for Phytophthora nicotianae and a multiplex PCR assay for simultaneous detection of P. nicotianae and Candidatus Liberibacter asiaticus in citrus[J]. Journal of Applied Microbiology. 2019， 127（4）： 1172-1183.

[2]GUO D， YUAN C， LUO Y， et al. Biocontrol of tobacco black shank disease （Phytophthora nicotianae） by Bacillus velezensis Ba168[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2020， 165： 104523.

[3]GALLUP C A， MCCORKLE K L， IVORS K L， et al. Characterization of the black shank pathogen， Phytophthora nicotianae， across North Carolina tobacco production areas[J]. Plant Disease， 2018， 102（6）： 1108-1114.

[4]PANABIèRES F， ALI G S， ALLAGUI M B， et al. Phytophthora nicotianae diseases worldwide： new knowledge of a long-recognised pathogen[J]. Phytopathologia Mediterranea， 2016， 55（1）： 20-40.

[5]WANG Y， WEI K， HAN X， et al. The Antifungal Effect of Garlic Essential Oil on Phytophthora nicotianae and the Inhibitory Component Involved[J]. Biomolecules. 2019， 9（10）： 632.

[6]李苗苗，王曉強，王東坤，等. 生防菌復配對煙草黑脛病的防治效果研究[J]. 中國煙草科學，2020，41（2）：32-38.

LI M M， WANG X Q， WANG D K， et al. Effect of biocontrol agents mixture on control of tobacco black shank[J]. Chinese Tobacco Science， 2020， 41（2）： 32-38.

[7]LA SPADA F， STRACQUADANIO C， RIOLO M， et al. Trichoderma counteracts the challenge of Phytophthora nicotianae infections on tomato by modulating plant defense mechanisms and the expression of crinkler， necrosis-inducing Phytophthora protein 1， and cellulose-binding elicitor lectin pathogenic effectors[J]. Frontiers in Plant Science. 2020， 11： 583539.

[8]ZHANG C S， GAO J M， HAN T et al. Integrated control of tobacco black shank by combined use of riboflavin and Bacillus subtilis strain Tpb55[J]. BioControl， 2017， 62（6）： 835-845.

[9]李小杰，李成軍，姚晨虓，等. 拮抗煙草疫霉菌的木霉菌株篩選鑒定及防病促生作用研究[J]. 中國煙草科學，2020，41（3）：65-70.

LI X J， LI C J， YAO C X， et al. Screening， identification of antagonistic Trichoderma spp. against tobacco black shank and its growth promotion effect on tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2020， 41（3）： 65-70.

[10]宋玉娟，韓雪蓮，張安盛，等. 棘孢木霉T-6對煙草促生及對黑脛病和根黑腐病的抗病作用[J]. 中國煙草科學，2020，41（1）：50-55.

SONG Y J， HAN X L， ZHANG A S， et al. Effects of Trichoderma asperellum T-6 on growth promotion， control of black shank and black Root rot in tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2020， 41（1）： 50-55.

[11]LIN C， TSAI C H， CHEN P Y， et al. Biological control of potato common scab by Bacillus amyloliquefaciens Ba01[J]. PLoS One， 2018， 13（4）： e0196520.

[12]何明川，曾舒泉，王志江，等. 一株煙草疫霉拮抗菌MC4-2的鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化及防效測定[J]. 微生物學通報，2021，48（12）：4636-4648.

HE M C， ZENG S Q， WANG Z J， et al. Identification， fermentation condition optimization and control effect of an antagonistic strain MC4-2 against Phytophthora parasitica var. nicotianae[J]. Microbiology China， 2021， 48（12）： 4636-4648.

[13]陸新莉，雷庭，邱克剛，等. 煙草黑脛病拮抗菌的篩選、鑒定和防病潛力[J]. 生物學雜志，2019，36（5）：52-56.

LU X L， LEI T， QIU K G， er al. Screening，identification，biocontrol potential evaluation of strains against tobacco black shank[J]. Journal of Biology， 2019， 36（5）： 52-56.

[14]SARMA B K， YADAV S K， SINGH S， et al. Microbial consortium-mediated plant defense against phytopathogens： readdressing for enhancing efficacy[J]. Soil Biology and Biochemistry， 2015， 87： 25-33.

[15]MA Q， CONG Y， FENG L， et al. Effects of mixed culture fermentation of Bacillus amyloliquefaciens and Trichoderma longibrachiatum on its constituent strains and the biocontrol of tomato Fusarium wilt[J]. Journal of Applied Microbiology. 2021， 132（1）： 532-546.

[16]WU Q， NI M， DOU K， et al. Co-culture of Bacillus amyloliquefaciens ACCC11060 and Trichoderma asperellum GDFS1009 enhanced pathogen-inhibition and amino acid yield[J]. BioMed Central， 2018， 17（1）： 155.

[17]叢韞喆. 生防菌混合發(fā)酵液對植物土傳病害防治、土壤性質微生物區(qū)系和采后果實品質的影響[D]. 濟南：山東大學，2020.

CONG W J. Mixed culture fermentation of biocontrol microorganism on the control of plant soil-borne diseases， the effects of soil properties， microbial flora and postharvest fruits[D]. Jinan： Shandong University， 2020.

[18]李兆防. 拮抗毛殼和木霉混用防治土傳病害的初步研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2009.

LI Z F. Primary study on control efficacy of soil-borne plant diseases with mixtures of antagonistic Chaetomium and Trichoderma[D]. Tai’an： Shandong Agricultural University， 2009.

[19]張成省，孔凡玉，關小紅，等. 煙草葉圍細菌Tpb55菌株的鑒定及其抑菌活性[J]. 中國生物防治，2008（1）：63-68.

ZHANG C S， KONG F Y， GUAN X H， et al. Identification and Antagonistic Activity of Tobacco Phyllosphere Bacteria Strain Tpb55[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2008（1）： 63-68.

[20]ZHANG C S， GAO J M， HAN T， et al. Integrated control of tobacco black shank by combined use of riboflavin and Bacillus subtilis strain Tpb55[J]. BioControl， 2017， 62（6）： 835-845.

[21]黃瑞環(huán)，芶劍渝，韓小斌，等. 煙草主要病害拮抗菌的篩選鑒定及除草活性分析[J]. 煙草科技，2019，52（12）：17-22.

HUANG R H， GOU J Y， HAN X B， et al. Screening and identificationof antagonistic Trichoderma sp. herbicidal activity against main tobacco diseases[J]. Tobacco Science & Technology， 2019， 52（12）： 17-22.

[22]趙鵬鵬，雷淑珍，徐曉光，等. 培養(yǎng)基組成對貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)抑真菌成分的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2020，46（5）：147-151.

ZHAO P P， LEI S Z， XU X G， et al. Effect of medium compositions on the production of antifungal components by Bacillus velezensis[J]. Food and Fermentation Industries， 2020， 46（5）： 147-151.

[23]周亞男，韓小斌，魏可可，等. 煙草根際可培養(yǎng)微生物多樣性及防病促生菌的篩選[J]. 微生物學通報，2021，48（12）：4649-4663.

ZHOU Y N， HAN X B， WEI K K， et al. The culturable microbial diversity in tobacco rhizosphere and their plant-growth promotion and biocontrol properties[J]. Microbiology China， 2021， 48（12）： 4649-4663.

[24]許凱霞. 一株六放珊湖來源真菌Cochliobolus hawaiiensis次級代謝產(chǎn)物及其生物活性研究[D]. 青島：中國海洋大學，2015.

XU K X. The secondary metabolites and their bioactivities of zoanthid Palythhoa haddoni-derived fungus Cochliobolus hawaiiensis[D]. Qingdao： Ocean University of China， 2015.

[25]吳娛，王開萍，唐正江，等. 米曲霉Aspergillus oryzae As-W.6對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的降解效果[J]. 食品科學，2016，37（17）：185-189.

WU Y， WANG K P， TANG Z J， et al. Degradation Efficiency of Deoxynivalenol by Aspergillus oryzae As-W.6[J]. Food Science， 2016， 37（17）： 185-189.

[26]KARUPPIAH V， VALLIKKANNU M， LI T， et al. Simultaneous and sequential based co-fermentations of Trichoderma asperellum GDFS1009 and Bacillus amyloliquefaciens 1841： a strategy to enhance the gene expression and metabolites to improve the bio-control and plant growth promoting activity[J]. Microbial Cell Factories， 2019， 18（1）： 185.

[27]KARUPPIAH V， SUN J， LI T， et al. Co-cultivation of Trichoderma asperellum GDFS1009 and Bacillus amyloliquefaciens 1841 causes differential gene expression and improvement in the wheat growth and biocontrol activity[J]. Frontiers in Microbiology， 2019， 10： 1068.

[28]周立梅，張淼，徐德陽，等. Brevibacillus laterosporus BL-21和Bacillus subtilis HNDF2共培養(yǎng)與純培養(yǎng)抗菌代謝產(chǎn)物的對比分析[J]. 中國農(nóng)學通報，2017，33（22）：118-125.

ZHOU L M， ZHANG M， XU D Y， et al. Comparative Analysis of Co-culture and Pure Culture of Antibacterial Metabolites of Brevibacillus laterosporus BL-21 and Bacillus subtilis HNDF2[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2017， 33（22）： 118-125

[29]LI T T， TANG J Q， KARUPPIAH V， et al. Co-culture of Trichoderma atroviride SG3403 and Bacillus subtilis 22 improves the production of antifungal secondary metabolites[J]. Biological Control， 2020， 140（C）： 104122-104122.

[30]KHAN R A A， NAJEEB S， MAO Z， et al. Bioactive Secondary Metabolites from Trichoderma spp. against Phytopathogenic Bacteria and Root-Knot Nematode[J]. Microorganisms， 2020， 8（3）： 401.

[31]李佳娣，趙勁捷，范海燕，等. 殺線蟲解淀粉芽胞桿菌Sneb709與費氏中華根瘤菌Sneb183共培養(yǎng)發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 中國生物防治學報，2021，37（4）：771-784.

LI J D， ZHAO J J， FAN H Y， et al. Optimization of fermentation conditions for Co-culture of nematicidal Bacillus amyloliquefaciens Sneb709 and Sinorhizobium fredii Sneb183[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2021， 37（4）： 771-784.

[32]DUAN Y， CHEN J， HE W， et al. Fermentation optimization and disease suppression ability of a Streptomyces ma. FS-4 from banana rhizosphere soil[J]. BMC Microbiology， 2020， 20（1）： 24.

[33]SORDE K L， ANANTHABARAYAN L. Isolation， screening， and optimization of bacterial strains for novel transglutaminase production[J]. Preparative Biochemistry and Biotechnology， 2019， 49（1）： 64-73.

1099501186360