鄭威+張再起+廖黎娟+劉金龍+戴光忠+楊軍

摘要：從煙草廢棄物中分離出一株能大量生產有機硒的微生物菌株。采用細菌分離篩選方法選育出單菌種，用無機硒配制發(fā)酵液，進行有機硒轉化效果試驗。用光學顯微鏡觀察菌種形態(tài)特征，根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行一系列生理化學反應觀察其生理生化特征。應用基因測序技術，確定物種歸屬。結果表明，該菌為芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）種的新菌株。該菌可將700 mg/L亞硒酸鈉全部轉化為水溶性有機硒，用于水稻根外噴施，水稻對該發(fā)酵液發(fā)酵生產的有機硒利用率最高達64.12%，稻米中總硒含量最高達0.432 mg/kg，有機硒占總硒的比例最高達84.9%。

關鍵詞：富有機硒菌；菌種鑒定；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）

中圖分類號：Q939.99 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6389-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.018

硒是人體必需的微量元素之一，必須通過飲食獲取，硒廣泛分布于機體的各組織器官、體液中，在腎中濃度最高。硒在人體內總量為14～20 mg，具有抗氧化作用（抗輻射、抗炎、抗衰老）、提高免疫功能（抗病毒）、抗癌、維持甲狀腺正常功能、促進生殖作用、拮抗重金屬、抗糖尿病、抗高血壓、保護肝臟、參與蛋白質和酶及輔酶的合成等功效，可預防克山病、大骨節(jié)病、心血管病、癌癥、糖尿病等40多種疾病[1-5]，與人體健康息息相關，。

由于硒不能在人體長期儲存，面對人體內硒的不斷流失和攝入不足，機體必須不斷從飲食中獲得足量的硒，才能維持硒在身體內的平衡。硒濃度的平衡對許多器官、組織的生理功能有著重要的保護和促進作用。目前許多對疾病的化學干預試驗已證明硒蛋白在一些重大疾病防治中具有重要作用[6]。

全世界有40多個國家和地區(qū)屬于缺硒地區(qū)。中國存在一條從東北三省斜穿至云貴高原的低硒帶，導致占國土面積72%的地區(qū)屬低硒地區(qū)，其中缺硒區(qū)占43%，嚴重缺硒地區(qū)占29%，糧食等天然食物硒含量較低，通過使用這些食物不能滿足人體對硒的需求[7]。中國近2/3的人缺硒或處于缺硒邊緣[8]。中國營養(yǎng)學會推薦硒的日攝入量不能低于60 μg，正常成人日攝入硒的安全和合適范圍為60～250 μg，且膳食硒日最高安全攝入量為400 μg[9-11]。

自然界中存在的硒元素分為無機硒和有機硒兩種。無機硒一般指亞硒酸鈉和硒酸鈉等；有機硒是通過生物轉化使硒與生物體內有機物質結合而成，一般以硒蛋白、硒氨基酸、硒多糖、硒核酸[12-14]等形式存在。二者都可以被動物吸收利用，但與無機硒相比，有機硒具有使用較安全、吸收利用率高、營養(yǎng)價值高等優(yōu)點。微生物富硒發(fā)酵是利用生物資源對硒開發(fā)的一項重要課題，具有廣闊的前景。硒多糖、硒蛋白、硒核酸都是易于被動植物吸收的優(yōu)良補硒劑，具有良好的藥理及保健作用。

目前有機硒的獲得包括微生物轉化法、植物轉化法和動物轉化法等[15]，微生物轉化法中較多的是利用酵母[16]和乳酸菌[17]。在富硒區(qū)，僅僅依靠土壤中的硒很難使農產品的硒含量達到標準，必須依靠外源補硒，即通過生物轉化來獲得有機硒含量較高的農產品，但目前生產上多用亞硒酸鈉根外噴施來獲得富硒農產品，硒的利用率不高，且轉化為有機硒的效率不高，使富硒農產品中有機硒的含量很低。因此，本研究致力于通過微生物提高有機硒轉化率，進而為提高農產品中有機硒含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設備 智能發(fā)酵罐（鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術公司）、超凈工作臺（蘇州隆意達凈化科技有限公司）、恒溫搖床（武漢科學儀器廠）、試管、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、酒精燈、250和500 mL三角瓶、光學顯微鏡。

1.1.2 菌種 分離得到具有高無機硒轉化為有機硒能力的Ⅲ號菌種。

1.1.3 培養(yǎng)基 葡萄糖牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、瓊脂15～20 g、NaCl 5 g、去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4；明膠培養(yǎng)基：NaCl 5 g、蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、明膠120 g，加去離子水至1 000 mL，調節(jié)pH 7.2～7.4；糖代謝檢測培養(yǎng)基：（NH4）2HPO4 1.0 g、KCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、酵母膏0.2 g、瓊脂15 g、溴甲酚紫0.008 g、葡萄糖5 g（可用核糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇代替），加去離子水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離篩選 采樣與樣品處理：采集湖北恩施市白楊坪的富硒煙草廢棄物，稱取1 g樣品置于盛有99 mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩。

分離：采用梯度稀釋分離法稀釋10-2～10-8倍，從10-6～10-8稀釋液中各取0.1 mL均勻涂抹于葡萄糖牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，每個濃度設3個重復，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后進行觀察，挑取不同形態(tài)的單一菌落，轉接至葡萄糖牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，挑取分離到的菌落形態(tài)不同的5個菌株，并編號為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，進一步純化。

篩選：將進一步純化得到的5個菌株進行耐硒性檢測，在葡萄糖牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入Na2SeO3（以Se計，下同）300～700 mg/L進行培養(yǎng)，其中Ⅲ號菌株長勢良好。

純化：將Ⅲ號菌株采用平板劃線法分離純化，涂葡萄糖牛肉膏蛋白胨平板檢驗直至不出現(xiàn)雜菌為止。

1.2.2 菌種的擴大培養(yǎng) 在無菌環(huán)境中，挑取兩環(huán)Ⅲ號菌株的純化菌種于葡萄糖牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，30 ℃ 150 r/min培養(yǎng)6～9 h。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 于10 L不銹鋼自控發(fā)酵罐中進行，葡萄糖牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基裝料體積為發(fā)酵罐容積的70%，0.12 MPa滅菌25 min，待培養(yǎng)基溫度下降至35 ℃，接入10% Ⅲ號菌株擴大培養(yǎng)的種子液中，并加入Na2SeO3 300～700 mg/L。

培養(yǎng)條件：設定罐壓0.04～0.05 MPa，罐溫（30±5） ℃，pH 6.0，溶氧60%～100%，攪拌速度190 r/min，發(fā)酵18～24 min得發(fā)酵培養(yǎng)液6.5 L。

1.2.4 無機硒轉化為有機硒效果研究 將發(fā)酵液樣品送至湖北航天化學技術研究所分析檢測中心依據GB/T 5009.93-2003、GB/T 5009.11-2003進行硒、總砷和無機砷的測定，依據GB/T23942-2009化學試劑 電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法通則，采用等離子體原子發(fā)射光譜儀檢測分析發(fā)酵液有機硒含量，參照杭州市農業(yè)標準規(guī)范DB3301消解無機硒的方法處理樣品，測定無機硒?？偽蜔o機硒的差值為有機硒含量，若未檢出無機硒，則總硒即為有機硒。

1.2.5 Ⅲ號菌株的初步鑒定 以《伯杰氏細菌鑒定手冊》為指導，參考《一般細菌常用鑒定方法》、《中華人民共和國藥典》2015版四部9204微生物鑒定指導原則，對微生物的生理生化性質進行分析，判定出該微生物的種屬關系。

1）細胞形態(tài)學觀察：取純化的試管斜面，用10 mL無菌水沖洗斜面，獲得菌種懸液。吸取稀釋后的菌液，進行革蘭氏染色、鏡檢，觀察細胞形態(tài)。

2）菌落觀察：取純化的試管斜面，用10 mL無菌水沖洗斜面，獲得菌種懸液。用濃度梯度稀釋法，將菌懸液稀釋后涂布到平板培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h形成單菌落，對菌落進行觀察。

3）硝酸鹽還原性檢測：將分離純化的Ⅲ號菌株接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)1～4 d。將甲（氨基苯磺酸0.8 g，5 mol/L醋酸100 mL）、乙（α-萘胺0.5 g，5 mol/L醋酸100 mL）等量混合液（用時混合）0.1 mL加于試管內，以一支未接種細菌的培養(yǎng)基作為對照。出現(xiàn)紅色反應則為陽性，否則為陰性；若對照管為陰性，試驗管為陽性，則檢測結果陽性；若對照管和試驗管均為陽性，則檢測結果假陽性。

4）運動性檢查：用解剖針穿刺接種分離純化得到的微生物于葡萄糖牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基內。30 ℃，恒溫培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)后的培養(yǎng)皿對透射光目測。微生物只生長在穿刺線上，邊緣十分清晰，則表示該菌種無運動性；若生長物不僅生長在穿刺線上且向四周呈云霧狀擴散，或穿刺線上生長物很少，從穿刺線表面向下滲入有生長物，則表示該菌種有運動性。

5）接觸酶檢測：用解剖針挑取培養(yǎng)好的單菌落，涂抹于滴有一滴3%過氧化氫的載玻片上，如果氣泡產生則為陽性，若沒有氣泡產生則為陰性。

6）明膠液化檢測：挑取生長良好、大小適中的菌落針刺接種于明膠培養(yǎng)基，另取兩支空白培養(yǎng)基試管斜面，用無菌解剖針穿刺。22 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d觀察試管斜面菌落生長狀況和明膠液化程度。若有明顯菌落生長且培養(yǎng)基無明顯凹陷或液化，則為陰性；若無菌落生長，明膠凝塊部分或全部變?yōu)榭闪鲃拥囊后w，則為假陽性；若有菌落生長，且明膠有明顯液化或凹陷，則為陽性。

7）糖代謝檢測和產酸檢測：將分離純化的試管菌種分別接種到加有不同糖類的糖代謝培養(yǎng)基中，觀察微生物生長狀況和指示劑顏色反應。若微生物正常生長且指示劑變色，則可以判定該微生物顆粒利用此種糖類，且該微生物產酸。

8）Ⅲ號菌種的16S rRNA序列同源性及系統(tǒng)進化樹分析：將Ⅲ號純化試管菌種送往中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）測序，并將核酸序列檢測結果通過NCBI進行BLAST-nucleotide分析，并進行16S rRNA序列同源性比對，選取與其同源性較高的基因序列，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其種屬關系。

1.2.6 水稻中有機硒含量的測定 將富硒發(fā)酵液梯度稀釋后對水稻根外噴施，對水稻植株及大米中硒含量進行檢測，分析水稻植株對硒的利用率及大米中的有機硒含量。

2 結果與分析

2.1 菌株SE201412形態(tài)學特征

通過觀察，革蘭氏染色為紫色，即陽性菌，菌株形態(tài)特征為桿狀，芽孢直徑小于1 μm，且菌體不膨大，鞭毛側生，符合芽孢桿菌形態(tài)特征（圖1）。通過菌株平板菌落形態(tài)觀察，該菌落表面粗糙不透明，污白色（圖2）。

2.2 生理生化特征

Ⅲ號菌生理生化特征的檢測項目及結果如表1所示，具體分析如下。

2.2.1 硝酸鹽還原性檢測 在試驗管中加入混合液3 min后顏色開始變化，8 min后紅色變化明顯為陽性，對照管顏色始終無變化，為陰性，故檢測結果為陽性。即該菌種可以將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。表明該微生物具有硝酸鹽代謝途徑，符合枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）生化特點。

2.2.2 運動性檢查 培養(yǎng)48 h后對培養(yǎng)皿進行透射光目測。發(fā)現(xiàn)微生物不僅生長在穿刺線上，穿刺線邊緣不清晰，穿刺線四周也有明顯菌落生長。部分穿刺線周圍出現(xiàn)霧狀菌落，有沿著穿刺線表面向下生長的狀況。表明該菌種有運動性，符合枯草芽孢桿菌特性。

2.2.3 接觸酶檢測 用解剖針挑取培養(yǎng)24 h的單菌落，涂抹于滴有一滴3%過氧化氫的載玻片上，有少許氣泡產生，接觸酶檢測呈陽性。

2.2.4 明膠液化檢測 該菌株在22 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天開始出現(xiàn)明顯菌落。第三天菌落處出現(xiàn)培養(yǎng)基凹陷。培養(yǎng)觀察7 d后，培養(yǎng)基液化達到1 cm，明膠液化呈陽性。表明該微生物具有蛋白酶活性，具有枯草芽孢桿菌明膠液化代謝特點。

2.2.5 糖代謝檢測和產酸檢測 將分離純化的試管菌種分別涂抹于阿拉伯糖、核糖、果糖、木糖、甘露醇等糖、醇代謝培養(yǎng)基中，該菌生長狀況良好，培養(yǎng)3 d后出現(xiàn)明顯菌落，培養(yǎng)基變黃色。故可以判定該微生物可以利用多種糖、醇且該微生物發(fā)酵產酸。說明該菌具有阿拉伯糖、核糖、果糖、木糖、甘露醇等糖、醇代謝途徑，符合枯草芽孢桿菌的糖代謝和產酸的特點。

2.3 SE201412菌株16S rRNA同源性分析

對菌株SE201412進行16S rRNA基因序列分析（圖3）。16S rRNA基因序列長度為1 383 bp。

將SE21412菌株16S rRNA基因序列通過NCBI進行Blast比對，在GenBank中，38個與SE21412菌株同源性較高的菌株比對結果見表2。

利用NCBI在線工具，構建菌株Se201412系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。菌株SE201412所在最大分支中所包含的全部菌株均為芽孢桿菌屬，初步鑒定SE201412屬于芽孢桿菌屬。且該菌株與Genbank中的登記序列Bacillus subtilis DSM10（AJ276351）的枯草芽孢桿菌同屬于一個最小次級分支。并與枯草芽孢桿菌庫16S rRNA有99%同源性，因此，鑒定該菌屬于枯草芽孢桿菌屬，是枯草芽孢桿菌屬中枯草芽孢桿菌種的一個新菌株，命名為Bacillus subtilis SE201412。

2.4 加入SE201412菌發(fā)酵后無機硒轉化為有機硒的效果

SE201412菌通過發(fā)酵可將一定比例的亞硒酸鈉轉化為有機硒，其中，一部分的有機硒溶于發(fā)酵液中，一部分被菌合成自身的營養(yǎng)物質。如表3所示，在SE201412菌發(fā)酵液中加入亞硒酸鈉300～700 mg/L，可以100%轉化為有機硒。表明SE201412是嗜硒菌，在高硒濃度下生長良好，有較高的應用價值。

2.5 SE201412發(fā)酵富有機硒菌液在水稻生產中的應用

用Na2SeO3根外噴施作物，其利用率不超過20%，80%的硒被浪費，且稻米中有機硒含量不高。SE201412發(fā)酵富硒菌液根外噴施水稻植株，水稻植株對硒的利用率為51.26%～64.12%，大米有機硒占總硒比例為83.4%～84.9%（表4）。表明SE201412發(fā)酵富硒菌液可以提高亞硒酸鈉的利用率，尤其是可生產出達到DBS42/002-2014標準的富有機硒農產品。

3 小結與討論

本研究通過對從恩施市白楊鄉(xiāng)煙草廢棄物提取煙堿前處理物中分離得到的一種枯草芽孢桿菌SE201412進行形態(tài)、生理生化特征[18，19]、基因序列分析[20]，表明其是一株新的枯草芽孢桿菌菌株，命名為Bacillus subtilis SE201412。該菌株有較強的將無機硒轉化為有機硒的能力，利用該菌株生產的富有機硒菌劑可以生產出達標的富有機硒農產品。應用Bacillus subtilis SE201412對亞硒酸鈉進行發(fā)酵轉化，得到的發(fā)酵液以不同硒濃度（以Se計）用于水稻根外噴施生產富有機硒水稻，可使水稻有機硒含量最高達0.365 mg/kg，硒的利用率最高達到64.12%，稻米中總硒含量最高達0.432 mg/kg，有機硒占總硒的比例最高達84.9%，具有較高的學術和應用價值。

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