李在建+易維學(xué)+操繼躍

摘要：測定了糞腸球菌（Enterococcus Faecalis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）對致病性大腸桿菌O54、霍亂沙門氏菌A72及正常菌嗜酸乳酸桿菌CICC6075生長的影響。結(jié)果表明，糞腸球菌和枯草芽孢桿菌均可較好的抑制大腸桿菌和沙門氏菌的生長；糞腸球菌對嗜酸乳酸桿菌起到較好的促生長作用；枯草芽孢桿菌與嗜酸乳酸桿菌混合培養(yǎng)的前35 h，對嗜酸乳酸桿菌有一定的抑制作用，但35 h以后則對其有較好的促生長作用。

關(guān)鍵詞：糞腸球菌；枯草芽孢桿菌；混合培養(yǎng)；體外評價

中圖分類號：S816.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）23-6200-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.050

Abstract：The effect of E. faecalis， B. subtilis on the growth of Escherichia coli O54（E. coli）， Salmonella choleraesuis A72 （S. choleraesuis） and normal bacterial Lactobacillus acidophilus were studied in this research. The results showed that the growth of E. Coli and S. choleraesuis could be well inhibited by E. faecalis and B. subtilis. E. faecalis could promote the growth of L. acidophilus. However， L. acidophilus could be inhibited by B. subtilis in the pre-35h of mixed culture， and then， they could be promoted growth well.

Key words：E. faecalis； B. subtilis； mixed culture； vitro evaluation

益生菌制劑又名促生素，活菌制劑，益生素。益生素由美國學(xué)者Parker于1974首次提出，是與抗生素相對應(yīng)的新概念，用來表示給動物飼用的微生態(tài)制劑，它可以直接飼喂動物并通過調(diào)節(jié)動物腸道微生態(tài)平衡達(dá)到預(yù)防和治療疾病，促進(jìn)動物生長以及提高飼料報酬的活性微生物，從而調(diào)整體內(nèi)微生態(tài)平衡[1，2]，有的益生菌制劑還含益生菌在生長過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[3]。某些益生菌不但可以提高飼料轉(zhuǎn)化率和畜禽的生產(chǎn)性能，而且對改善動物健康狀況，降低畜禽產(chǎn)品中膽固醇的含量有著很好的作用。此外，微生態(tài)制劑可顯著減少畜牧生產(chǎn)過程中對環(huán)境造成的污染[4]。

乳酸菌和芽孢桿菌能產(chǎn)生多種細(xì)菌素，其中大部分能夠抑制或殺滅革蘭氏陽性菌，另外的極少數(shù)則對革蘭氏陰性菌和真菌有較好抑制或殺死作用。因此，當(dāng)治療革蘭氏陰性菌導(dǎo)致的疾病時，篩選能夠抑制革蘭氏陰性細(xì)菌的益生菌具有非常重要的應(yīng)用價值。本試驗通過益生菌和致病菌及有益菌的聯(lián)合培養(yǎng)，建立細(xì)菌聯(lián)合培養(yǎng)時的生長曲線，探討糞腸球菌和枯草芽孢桿菌對致病性細(xì)菌大腸桿菌O54、霍亂沙門氏菌A72以及腸道正常菌嗜酸乳酸桿菌CICC6075生長繁殖的影響，在體外確證這兩種菌在臨床應(yīng)用上的價值。

1 材料與方法

1.1 試劑、藥品

胰蛋白胨和酵母提取物為英國OXOID公司產(chǎn)品；TSA和M-H肉湯為英國BD公司產(chǎn)品；葡萄糖購自廣東光華化學(xué)廠有限公司（批號：20070528）；氯化鈉（分析純，批號：F20070726），二甲亞砜（分析純，批號：T20080229），均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；SS瓊脂培養(yǎng)基（批號：20090317-01），伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）培養(yǎng)基（批號：20090203-02），均由杭州微生物試劑有限公司提供；乳桿菌選擇性培養(yǎng)基（LBS，批號：090504），由上海盛思生化科技有限公司提供。

1.2 試驗菌株

枯草芽孢桿菌與糞腸球菌，由滄州興業(yè)生物技術(shù)有限公司提供；大腸桿菌O54，霍亂沙門氏菌A72由武漢工業(yè)學(xué)院飼料科學(xué)系提供；嗜酸乳酸桿菌CICC6075，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC29213由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室提供。

1.3 細(xì)菌的計數(shù)方法

本試驗采用較為常用的平板活菌計數(shù)法，其原理是將待測菌液經(jīng)適當(dāng)稀釋，涂布在相應(yīng)的無菌瓊脂平板上，置于適宜的條件下培養(yǎng)一定時間，經(jīng)過培養(yǎng)后在平板上形成肉眼可見的菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)和取樣量計算出原始菌液濃度[5]。

1.4 糞腸球菌和枯草芽孢桿菌繁殖速率的測定方法

首先將復(fù)活的菌液1 mL接種到9 mL的滅菌TSB培養(yǎng)基中，混勻后立即開始活菌計數(shù)，所測得的菌液濃度為X1，剩余的9 mL菌液置于37 ℃，180 r/min條件下水浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)，計時為T1，培養(yǎng)至?xí)r間T2后取出1 mL立即開始活菌計數(shù)，所測得的菌液濃度為X2。由于細(xì)菌是以二等分分裂法繁殖的，因此細(xì)菌的濃度滿足關(guān)系式：X2=2nX1，則n=3.31（lgX2-lgX1），世代時間G=（T2-T1）×60/[3.31（lgX2-lgX1）]。（G表示世代周期，n表示細(xì)菌繁殖的次數(shù)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 糞腸球菌與枯草芽孢桿菌的世代時間測定結(jié)果

接種糞腸球菌時所測得菌懸液濃度X1為3.8×104，培養(yǎng)時間約為5 h，此時測得的菌懸液濃度X2為2.3×108。由公式G=（T2-T1）×60/[3.31（lgX2-lgX1）]算得糞腸球菌的世代時間G=23.9 min。

接種枯草芽孢桿菌時所測得菌懸液濃度X1為7.2×104，培養(yǎng)時間約為6 h，此時測得的菌懸液濃度X2為3.5×108。由公式G=（T2-T1）×60/[3.31（lgX2-lgX1）]算得枯草芽孢桿菌的世代時間G=29.4 min。

2.2 飼用益生菌對致病菌和腸道正常菌生長繁殖的影響

2.2.1 糞腸球菌對大腸桿菌O54、霍亂沙門氏菌A72及嗜酸乳酸桿菌CICC6075生長繁殖的影響 由圖1可知，從第6 h開始，混合培養(yǎng)體系里的大腸桿菌O54濃度要顯著低于其單獨培養(yǎng)時的濃度，糞腸球菌對大腸桿菌O54的拮抗作用在12～48 h達(dá)到頂峰，后面各時間點測得的菌懸液濃度也存在較大差異，據(jù)統(tǒng)計學(xué)檢驗，差異極顯著（P<0.01）。由此可以推斷出，當(dāng)大腸桿菌O54和枯草芽孢桿菌在一個混合體系中共同存在時，枯草芽孢桿菌對大腸桿菌O54的生長繁殖具有較好的抑制作用，該株枯草芽孢桿菌具有較好的益生作用。

2.2.2 糞腸球菌對霍亂沙門氏菌A72生長繁殖的影響 由圖2可知，從第6 h開始，混合培養(yǎng)體系里霍亂沙門氏菌A72的菌懸液濃度要顯著低于其單獨培養(yǎng)時的濃度，60 h后其濃度呈急劇下降的趨勢，6到60 h的階段各時間點測得的數(shù)目也呈顯著差異。各個時間點的菌懸液濃度經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，差異極顯著（P<0.01）。由此可以推斷出，當(dāng)霍亂沙門氏菌A72和糞腸球菌在一個混合培養(yǎng)體系中，在適宜條件下共同培養(yǎng)時，糞腸球菌對霍亂沙門氏菌A72的生長具有較好的抑制作用，該株糞腸球菌具有很好的益生作用。

2.2.3 糞腸球菌對嗜酸乳酸桿菌CICC6075生長的影響 由圖3可知，除了第30 h，其他混和培養(yǎng)組的嗜酸乳酸桿菌CICC6075數(shù)目就顯著比單獨培養(yǎng)組的乳酸桿菌數(shù)目多，統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明，各時間點的細(xì)菌濃度差異極顯著（P<0.01），這表明，糞腸球菌對嗜酸乳酸桿菌CICC6075具有較好的促生長作用。

2.2.4 枯草芽孢桿菌對大腸桿菌O54生長繁殖影響的試驗結(jié)果 由圖4可知，從第6 h開始，混合培養(yǎng)體系里的大腸桿菌O54濃度要顯著低于其單獨培養(yǎng)時的濃度，后面各時間點測得的菌懸液濃度也有很大差別，據(jù)統(tǒng)計學(xué)檢驗，差異極顯著（P<0.01）。由此可以看出，當(dāng)大腸桿菌O54和枯草芽孢桿菌在一個混合體系中共同培養(yǎng)時，枯草芽孢桿菌對大腸桿菌O54具有較好的抑制作用，該株枯草芽孢桿菌具有優(yōu)良的益生作用。

2.4.5 枯草芽孢桿菌對霍亂沙門氏菌A72生長繁殖影響的試驗結(jié)果 由圖5可知，從第6 h開始，混合培養(yǎng)體系里的霍亂沙門氏菌A72的濃度要顯著低于霍亂沙門氏菌A72單獨培養(yǎng)時的濃度，60 h后霍亂沙門氏菌A72的濃度呈急劇下降的趨勢，6～60 h的階段各時間點測得的菌懸液濃度較對照組也明顯偏低。各個時間點的濃度經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，差異極顯著（P<0.01）。由此可以看出，當(dāng)霍亂沙門氏菌A72和枯草芽孢桿菌在一個混合體系中，在適宜條件下共同培養(yǎng)時，枯草芽孢桿菌對霍亂沙門氏菌A72的生長繁殖具有較好的抑制作用，證明該株枯草芽孢桿菌具有優(yōu)良的益生作用。

2.4.6 枯草芽孢桿菌對嗜酸乳酸桿菌CICC6075生長影響的試驗結(jié)果 由圖6可知，在0～5 h階段，嗜酸乳酸桿菌CICC6075單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)菌懸液濃度非常接近，5～35 h這段時間內(nèi)，嗜酸乳酸桿菌CICC6075混合培養(yǎng)時的菌懸液濃度較單獨培養(yǎng)時小，且差異極顯著（P<0.01），但35 h以后混合培養(yǎng)的乳酸桿菌開始迅速大量繁殖，數(shù)目迅速增多，到40 h左右菌懸液濃度已經(jīng)超過了單獨培養(yǎng)時的菌懸液濃度，由此可以推斷出在生長后期枯草芽孢桿菌對嗜酸乳酸桿菌CICC6075具有較強的促生長作用。

3 討論

試驗結(jié)果表明，糞腸球菌和枯草芽孢桿菌對致病性大腸桿菌O54和霍亂沙門氏菌A72有較強的拮抗作用，與對照組相比一般抑制率可達(dá)90%以上，對嗜酸乳酸桿菌CICC6075的生長可起到促進(jìn)作用。該結(jié)果在動物活體試驗上也得到了驗證，易中華[6]用枯草芽孢桿菌和寡聚糖配伍使用，結(jié)果表明，它們能顯著增加肉雞盲腸中乳酸桿菌的數(shù)量，減少致病性大腸桿菌的數(shù)量；閆風(fēng)蘭等[7]通過試驗發(fā)現(xiàn)兩種不同枯草芽孢桿菌均能增加肉雞腸道中乳酸桿菌的數(shù)量；張璐[8]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌可顯著降低14、21日齡肉雞盲腸中大腸桿菌的數(shù)量。薛勝平等[9]研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌對大腸桿菌、沙門氏菌的抑制作用分別達(dá)到5 000倍、8倍。而王鋰韞等[10]從酸馬奶酒中分離出來的糞腸球菌對大腸桿菌幾乎沒有抑制作用。這可能是由于菌株的來源不同導(dǎo)致細(xì)菌的特性有一定差別。

糞腸球菌被認(rèn)為是一種條件致病菌，在人的免疫力低下或有嚴(yán)重通常導(dǎo)致尿路感染、心內(nèi)膜炎、腹膜炎、傷口感染等疾病[11，12]，但在一般情況下對人體和動物是沒有危害的的，屬于人和動物體內(nèi)的常在菌?？莶菅挎邨U菌是一種較為安全的細(xì)菌，不會對人和動物造成危害。本試驗中，糞腸球菌和枯草芽孢桿菌對致病菌的抑制作用可能與它們強大的細(xì)菌素分泌功能有關(guān)，一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌E.faecalis RJ-Ⅱ、E.faecalis LMG可以產(chǎn)生如細(xì)菌素Enterocin RJ-Ⅱ和Enterolysin A之類的細(xì)菌素[13，14]，這些代謝性產(chǎn)物可能對致病性的大腸桿菌和沙門氏菌有較好的抑制生長作用。枯草芽孢桿菌通常被認(rèn)為是一種非致病菌，可以產(chǎn)生如肽類的抗生素枯草菌素和伊枯草菌素之類的細(xì)菌素[15]，這些物質(zhì)可能對大腸桿菌和沙門氏菌有較好的抑制作用。

通過試驗發(fā)現(xiàn)糞腸球菌和枯草芽孢桿菌對大腸桿菌O54、霍亂沙門氏菌A72生長的抑制作用主要表現(xiàn)在混合培養(yǎng)6 h以后的階段，這說明只有當(dāng)糞腸球菌和枯草芽孢桿菌達(dá)到較大的菌懸液濃度時且與大腸桿菌O54和霍亂沙門氏菌A72共存于同一培養(yǎng)體系時才具有較好的益生效果。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊承劍，黃興國.微生態(tài)制劑及其在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].飼料博覽，2006（2）：9-11.

[2] 孫建義.益生素研究的應(yīng)用進(jìn)展[J].生物工程進(jìn)展，1995，15（1）：28-31

[3] 周德慶，郭杰炎. 我國微生態(tài)制劑的現(xiàn)狀和發(fā)展設(shè)想[J].工業(yè)微生物，1999，29（3）：19-29.

[4] KIM S J，CHO S Y，KIM S H，et al.Effect of microencapsulation on viability and other characteristics in Lactobacillus acidophilus ATCC 43121，LWT-Food Science and Technology，2008， 41（3）：493-500.

[5] 沈 萍，陳向東.微生物學(xué)實驗[M].北京：高等教育出版社，2007.

[6] 易中華.水蘇糖對肉雞生長性能、腸道生理及免疫功能的影響[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[7] 閻風(fēng)蘭，盧 崢，朱玉琴.肉仔雞飼喂桔草芽孢桿菌的效果研究[J].動物營養(yǎng)學(xué)報，1996，8（4）.34-38.

[8] 張 璐.飼用芽孢桿菌產(chǎn)品益生特性的體外評價研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2008.

[9] 薛勝平，杜連祥，路福平.酪酸菌、腸膜芽抱桿菌、糞腸球菌三聯(lián)菌益生特性研究[A].2005年中國工業(yè)微生物學(xué)術(shù)研討會[C].天津：天津科技大學(xué)出版社，2005.

[10] 王鋰韞，賀銀鳳，李少英，等.酸馬奶酒中糞腸球菌抑菌特性的研究[J].食品科技.2006（12）：15-17.

[11] JETT B D，HUYCKE M M，GILMORE M S，Virulence of Enterococci[J].Clinical Microbiology Reviews，1994，7（4）：462-478.

[12] Franz C M A P，Holzapfel W H，Stiles M E.Enterococci at the crossroads of food safety[J].International Journal of Food Microbiology，1999，47（1-2）：1-24.

[13] NILSEN T，NES I F，HOLO H.Enterolysin A，a cell wall-degrading bacteriocin from Enterococcus faecalis LMG 2333. Applied and Environmental Microbiology[J].Microbiology，2003， 69（5）：2975-2984.

[14] YAMAMOTO Y，TOGAWA Y，SHIMOSAKA M，et al. Purification and characterization characterization of a novel bacteriocin produced by Enterococcus faecalis strain RJ-II[J].Applied and Environmental Microbiology，2003，69（10）：5546-5553.

[15] ALEXANDRA K，XIAO-HUA CHEN，ANKE H，et al. Structural and functional characterization of gene clusters directing nonribosomal synthesis of bioactive cyclic lipopeptides in bacillus amyloliquefaciens strain FZB42[J].Journal of Bacteriology，2004，186（4）：1084-1096.