王 鑫，趙海濤，萬玉美，孫桂清，崔兆進，吳 彥，陳秀玲

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066000；2.河北省海洋與水產(chǎn)科學(xué)研究院，河北 秦皇島 066000；3.秦皇島北戴河新區(qū)海洋和漁業(yè)局，河北 秦皇島 066000)

隨著海水集約化養(yǎng)殖的飛速發(fā)展，工廠化全封閉循環(huán)水養(yǎng)殖過程中的鉻等重金屬污染問題開始引起關(guān)注。鉻的主要存在形式為Cr(Ⅵ)，其毒性是Cr(Ⅲ)毒性的100倍。工廠化養(yǎng)殖中，Cr(Ⅵ)的主要來源為排放的工業(yè)廢水、空氣沉降以及集約化養(yǎng)殖設(shè)備和飼料中的Cr(Ⅵ)污染，其可通過皮膚、消化道、呼吸道進入養(yǎng)殖動物體內(nèi)，引起機體中毒。近年來，有很多關(guān)于Cr(Ⅵ)脅迫對水生生物影響的研究。雷忻等的研究表明，金魚在Cr(Ⅵ)脅迫下的LC大于草魚、鯽和泥鰍；梁峰等的研究表明，在鉻中毒后黃顙魚仔魚和稚魚的活動能力變?nèi)?，游動變慢，反?yīng)變遲鈍，后相繼出現(xiàn)死亡情況；考慶君等、楊燕等的研究表明，鉻毒性作用的器官主要是肝腺和腎腺；張彩明等的研究表明，重金屬誘導(dǎo)機體產(chǎn)生活性氧，進而導(dǎo)致機體組織抗氧化酶活性發(fā)生改變。

大菱鲆()是我國主要海水經(jīng)濟養(yǎng)殖品種之一，因其肉質(zhì)鮮美，受到人們喜愛，2020年其產(chǎn)量達110 984 t。工廠化集約化養(yǎng)殖是大菱鲆主要養(yǎng)殖模式，Cr(Ⅵ)污染對大菱鲆養(yǎng)殖的危害不容忽視。但到目前為止還沒有Cr(Ⅵ)對大菱鲆幼魚急性毒性的研究。為此，本實驗以大菱鲆幼魚為實驗對象，采用靜水實驗法進行Cr(Ⅵ)脅迫下的急性毒性實驗，研究在其脅迫下大菱鲆幼魚肝胰腺內(nèi)過氧化氫酶(CAT)活性的變化；觀察大菱鲆幼魚在Cr(Ⅵ)脅迫下的行為，通過急性毒性實驗得出半致死濃度和安全濃度，以期為大菱鲆養(yǎng)殖中的水質(zhì)評價提供參考依據(jù)，為其他重金屬離子和Cr(Ⅵ)的復(fù)合污染物的毒性研究提供借鑒，并為制定海洋漁業(yè)和水質(zhì)標(biāo)準提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 實驗所用大菱鲆幼魚均采自河北省秦皇島市昌黎縣半滑舌鰨良種場，外形完好、無疾病，平均體長為(6.00±0.40)cm，平均體質(zhì)量為(8.19±1.47)g。實驗前將大菱鲆幼魚置室內(nèi)養(yǎng)殖池暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)期間保持24 h充氧，日換水一次，換水量為50%，及時清理池底糞便及殘餌。早8:30和下午5:30準時少量喂食高能顆粒飼料兩次，暫養(yǎng)期間死亡率小于2%，實驗前一天停止投喂。

1.1.2 實驗條件 本實驗采取靜水實驗法，實驗期間不投飼不換水。實驗容器為聚乙烯桶，實驗期間水溫恒定，持續(xù)充氧。實驗用水為深井鹵水和淡水混合配制而成，然后經(jīng)砂濾池過濾，水溫為(15.0±2.0)℃。符合《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準》(GB 11607-1989)。

1.2 實驗方法

1.2.1 預(yù)實驗 預(yù)實驗嚴格按照《海洋監(jiān)測規(guī)范 第7部分 近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測》(GB 17378.7-2007)進行，成體每克魚體質(zhì)量1 L用水量。預(yù)實驗采取靜水實驗法，實驗期間不投飼不換水，及時撈出死亡個體并記錄。死亡標(biāo)準為用玻璃棒觸碰魚的尾部，多次刺激，魚沒有反應(yīng)則判定為死亡。預(yù)實驗Cr(Ⅵ)濃度梯度設(shè)置為20、40、80、160、320 mg/L，每組設(shè)置3組平行。每個實驗桶暫養(yǎng)10條大菱鲆幼魚，持續(xù)充氧。通過預(yù)實驗找出大菱鲆幼魚在不同濃度Cr(Ⅵ)脅迫下的最大全存活濃度和最小全致死濃度。

1.2.2 正實驗 根據(jù)預(yù)實驗得出的結(jié)果，在最大全存活濃度和最小全致死濃度之間選取7個等對數(shù)比濃度組作為正實驗的濃度組，濃度分別為22.91、30.20、40.00、52.48、69.18、91.20、120.22 mg/L，同時設(shè)置一個空白對照組。實驗組和對照組每組設(shè)置3組平行，每個處理組12條大菱鲆幼魚，水體積100 L，持續(xù)充氧。實驗期間每6 h觀察一次，觀察大菱鲆幼魚的行為表現(xiàn)及體表變化，實驗過程中及時撈出死亡個體并記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理

急性毒性所有數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS軟件進行整理，運用概率單位法制作散點圖，畫出趨勢線。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cr(Ⅵ)脅迫下的大菱鲆幼魚的中毒癥狀和行為變化

Cr(Ⅵ)脅迫下的大菱鲆幼魚的中毒癥狀和行為變化見表1。在急性毒性實驗過程中，空白組及平行組大菱鲆幼魚均未出現(xiàn)死亡情況，幼魚表現(xiàn)平靜，多數(shù)時間伏于水底。低濃度組(22.91、30.20、40.00、52.48 mg/L濃度組)大菱鲆幼魚較為安靜，大部分幼魚伏于水底，個別會游到水面上沿桶壁正常游動，未見明顯異常狀況。隨著實驗的進行，幼魚的鰓、口及體表有少量的Cr(Ⅵ)與體液的橙黃色復(fù)合物附著。在高濃度組(69.18、91.20、120.22 mg/L濃度組)，剛放入高濃度Cr(Ⅵ)母液時，大菱鲆幼魚顯得焦躁不安，在桶內(nèi)游動迅速，翻滾打轉(zhuǎn)，擺尾迅速，呼吸加快，出現(xiàn)浮頭現(xiàn)象；再過一段時間后，幼魚變得安靜下來，伏于水底不動，在受到外界刺激后，反應(yīng)變得遲鈍，明顯看到幼魚的鰓、口及體表有較多的Cr(Ⅵ)與體液的橙黃色復(fù)合物附著；到后期大菱鲆幼魚有的鰓和口充分張開，有的鰓沒有明顯變化但是處于翻背狀態(tài)，用玻璃棒多次觸碰這些魚的尾部，魚無反應(yīng)，判定為死亡。

表1 不同濃度Cr(Ⅵ)暴露下的大菱鲆幼魚的中毒表現(xiàn)及行為

2.2 Cr(Ⅵ)對大菱鲆幼魚的急性毒性

不同濃度Cr(Ⅵ)脅迫下大菱鲆幼魚的死亡情況見表2。研究表明，到48 h時，22.91、30.20、40.00、52.48 mg/L等低濃度組均未出現(xiàn)死亡情況；69.18 mg/L濃度組出現(xiàn)較少的死亡情況，死亡率8.33%；69.18 mg/L到120.22 mg/L濃度組死亡數(shù)量迅速增多，死亡率由8.33%增長到95.8%。到72 h時，2個低濃度組(22.91 mg/L和30.20 mg/L)仍未出現(xiàn)死亡情況；40.00 mg/L到69.18 mg/L濃度組死亡數(shù)量逐漸增加，死亡率由37.5%逐步增長到87.5%；2個高濃度組(91.20 mg/L和120.22 mg/L)死亡率達到100%。到96 h時，各濃度組均出現(xiàn)死亡情況，22.91 mg/L到40.00 mg/L濃度組死亡率由29.2%增長到83.3%；52.48 mg/L及以上濃度組死亡率均達到100%?？瞻讓φ战M在96 h內(nèi)未出現(xiàn)死亡情況，故排除水質(zhì)等外界因素對死亡情況的影響。

表2 不同濃度Cr(Ⅵ)脅迫下大菱鲆幼魚的死亡率 %

不同濃度Cr(Ⅵ)脅迫下，大菱鲆幼魚48、72、96 h 的死亡趨勢見圖1，由圖1可知，大菱鲆幼魚死亡率的概率單位與Cr(Ⅵ)的濃度對數(shù)的48 h、72 h和96 h回歸方程分別為=13.167-20.76，=6.208 3-5.278 3，=6.25-4.006 7；相關(guān)系數(shù)分別為0.982、0.993 4、0.990 1，均大于0.98，表現(xiàn)為很好的正相關(guān)性。

圖1 不同濃度Cr(Ⅵ)脅迫下大菱鲆幼魚的死亡趨勢

Cr(Ⅵ)對大菱鲆幼魚的急性毒性實驗分析見表3。大菱鲆幼魚48、72、96 h的Cr(Ⅵ)半數(shù)致死濃度LC50分別為90.449、45.248、27.606 mg/L，其95%置信區(qū)間分別為78.632～104.016、24.110～84.918、19.643～38.797 mg/L。Cr(Ⅵ)對大菱鲆幼魚的安全質(zhì)量濃度為2.760 6 mg/L。48 h的95%置信區(qū)間范圍小于72 h的95%置信區(qū)間范圍，說明Cr(Ⅵ)在48 h到72 h之間致毒能力減弱。但72 h的95%置信區(qū)間范圍明顯大于96 h的95%置信區(qū)間范圍，說明Cr(Ⅵ)在72 h到96 h之間致毒能力明顯增強。

表3 Cr(Ⅵ)對大菱鲆幼魚急性毒性實驗分析

3 討論

在魚類急性毒性實驗中，依據(jù)國家標(biāo)準，重金屬離子的級別根據(jù)96 h LC可分為低毒、中毒、高毒和劇毒，范圍分別為>10、1～10、0.1～1、<0.1 mg/L。本實驗求得Cr(Ⅵ)對大菱鲆幼魚的96 h LC為27.606 mg/L，證明Cr(Ⅵ)對大菱鲆幼魚的毒性級別屬于低毒。安全質(zhì)量濃度(SC)為0.1倍96 h LC，即為2.760 6 mg/L，我國標(biāo)準漁業(yè)水質(zhì)規(guī)定：養(yǎng)殖水體鉻含量≤0.1 mg/L。實驗測得安全質(zhì)量濃度為標(biāo)準水質(zhì)的27.6倍，可見大菱鲆幼魚在Cr(Ⅵ)超標(biāo)的水中仍能存活，證明大菱鲆幼魚對Cr(Ⅵ)的耐受性較強。在大菱鲆養(yǎng)殖過程中應(yīng)該加強對水質(zhì)的控制，防止養(yǎng)殖水體Cr(Ⅵ)超標(biāo)，以避免對人類健康產(chǎn)生影響。

Cr(Ⅵ)易被吸收并具有強氧化性，花日茂的研究表明Cr(Ⅵ)能氧化生物大分子，與蛋白質(zhì)分子上的羥基結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子變性。研究表明，低濃度的Cr(Ⅵ)可導(dǎo)致機體的SOD、CAT的酶活性降低，但是對生物沒有明顯的毒性作用，并能促進生長。高濃度的Cr(Ⅵ)可導(dǎo)致機體細胞DNA鏈斷裂。Cr(Ⅵ)可通過魚體表、鰓進入魚體，從而在魚體內(nèi)殘留，刺激并腐蝕黏膜，導(dǎo)致組織損壞。在實驗過程中通過解剖高濃度Cr(Ⅵ)脅迫下的大菱鲆幼魚，發(fā)現(xiàn)其肝胰腺變黑，也印證了這一點。Cr(Ⅵ)還與黏液一起附著在魚的體表或者鰓上。研究表明，重金屬離子對水生生物體的作用機理大多是重金屬離子與黏液一起附著在鰓上，導(dǎo)致機體缺氧。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，隨著Cr(Ⅵ)濃度的增加，大菱鲆的死亡率也逐漸增加，兩者呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢。在同一時間段內(nèi)，大菱鲆幼魚死亡率隨Cr(Ⅵ)濃度的增加而增加，兩者也呈正相關(guān)趨勢。在高濃度的Cr(Ⅵ)脅迫下，明顯觀察到大菱鲆幼魚的體表有Cr(Ⅵ)與黏液的復(fù)合物附著在上面。大菱鲆幼魚在高濃度的Cr(Ⅵ)實驗桶中明顯呼吸速率加快，行動變得遲緩，逐漸喪失活動能力，最終死亡。

4 結(jié)論

實驗表明，大菱鲆幼魚隨著Cr(Ⅵ)濃度的增加，表現(xiàn)出呼吸加快，行動逐漸遲緩，體表充血等癥狀，最終死亡。大菱鲆幼魚的鰓和體表有Cr(Ⅵ)與黏液結(jié)合物附著，Cr(Ⅵ)進入大菱鲆體內(nèi)引起組織病變，導(dǎo)致肝胰腺變黑。Cr(Ⅵ)對大菱鲆幼魚的 96 h LC為27.606 mg/L，安全質(zhì)量濃度為2.760 6 mg/L。Cr(Ⅵ)對大菱鲆幼魚具有毒性作用，毒性級別為低毒，同時大菱鲆幼魚對Cr(Ⅵ)表現(xiàn)出較強的耐受性。