馬科，蔣登科，龔霜，王東飛，高占甫，瞿方，楊雪鵬，歐明毅

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，貴州 貴陽 550000；3.貴州黃果樹金葉科技有限公司 技術(shù)中心，貴州 安順 561000

0 引言

煙草薄片是以卷煙生產(chǎn)中廢棄的煙末、碎煙片、煙梗等為主要原料，經(jīng)過浸提、濃縮、分離、打漿、磨漿、抄造、烘干、加香等工藝過程制成的一種性能優(yōu)良的均質(zhì)化煙葉，又稱再造煙葉[1-2]。煙草薄片密度低，焦油釋放量低，能夠提高卷煙的燃燒性和填充能力，并且可以在一定程度上按照人們的意愿或要求來調(diào)整卷煙的物理性能和化學(xué)成分，在卷煙生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用[3-4]。

煙草薄片產(chǎn)品在直接抽吸時(shí)存在香氣平淡、木質(zhì)雜氣重、熱辣感強(qiáng)等吸味缺陷[5]，因此需要對(duì)其進(jìn)行改善。已有研究表明，煙草薄片經(jīng)過適當(dāng)酶處理后，可以降解其中的大分子物質(zhì)，促進(jìn)美拉德反應(yīng)中還原糖、氨基酸等小分子物質(zhì)的生成，從而增加煙草薄片中致香物質(zhì)的含量。如云南瑞升煙草技術(shù)(集團(tuán))有限公司[6]將酸性蛋白酶、復(fù)合果膠酶、復(fù)合中性纖維素酶和中性脂肪酶配制成改性添加劑，對(duì)煙梗提取液進(jìn)行處理發(fā)現(xiàn)，提取液中果膠、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)發(fā)生降解、轉(zhuǎn)化，致香成分的含量明顯提高。游霞等[7]利用復(fù)合酶制劑對(duì)煙草廢棄物進(jìn)行處理，通過GC-MS檢測出與煙草香味有關(guān)的化合物57種，這些物質(zhì)具有沁鼻的烘烤味和甜香，能改善煙草吸食品質(zhì)，對(duì)卷煙風(fēng)味起到了較好的修飾作用。戴麗君等[8]將淀粉酶、果膠酶和木聚糖酶配制成復(fù)合酶液進(jìn)行洗梗實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)煙梗、梗膏和煙草薄片中水溶性糖含量均有較大變化，可明顯提高煙草薄片的內(nèi)在品質(zhì)。因此，為提高煙草薄片產(chǎn)品品質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行酶處理可以達(dá)到增加致香物質(zhì)成分含量、降低刺激性和改善余味等目的[9-10]。

賈偉萍等[11]對(duì)10種不同地區(qū)來源煙草薄片樣品的化學(xué)組分進(jìn)行研究，結(jié)果表明，各煙草薄片樣品中總糖、還原糖、總植物堿、總氮等化學(xué)組分含量差異較大；陳祖剛等[12]對(duì)國內(nèi)和國外來源的造紙法煙草薄片進(jìn)行了詳細(xì)比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，國產(chǎn)造紙法煙草薄片在吸味和主要香味成分含量上較國外同類產(chǎn)品有一定差距；蔡冰等[13]對(duì)比分析進(jìn)口和國產(chǎn)來源烤煙型造紙法煙草薄片的主要致香成分，結(jié)果表明，進(jìn)口再造煙葉中主要致香成分含量高于國產(chǎn)再造煙葉。不同地區(qū)來源原料制成的煙草薄片致香成分差異明顯，其主要原因是不同來源原料間化學(xué)組分差異較大。研究不同酶制劑對(duì)特定原料來源煙草薄片的化學(xué)成分影響差異，可挖掘用于提升煙草薄片品質(zhì)的酶制劑，對(duì)煙草薄片的生產(chǎn)具有重要應(yīng)用價(jià)值。

雖然酶制劑在煙草薄片中的應(yīng)用研究已有文獻(xiàn)報(bào)道，然而這些文獻(xiàn)均未探討不同酶制劑對(duì)特定來源原料制成的煙草薄片的作用差異。鑒于此，本文擬用不同類型酶對(duì)貴州地區(qū)來源原料的煙草薄片濃縮液進(jìn)行催化轉(zhuǎn)化處理，考查濃縮液中常規(guī)化學(xué)成分和香味成分變化，并將酶處理后的濃縮液涂布于煙草薄片片基以評(píng)價(jià)其感官品質(zhì)的變化，以期增加煙草薄片濃縮液香味成分的含量和種類，改善其木質(zhì)氣重、香氣質(zhì)不足等問題，為利用酶制劑改善煙草薄片品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

濃縮液和煙草薄片片基均由貴州中煙責(zé)任有限公司提供；中性蛋白酶(100 U/mg)、果膠酶(500 U/mg)、淀粉酶(50 U/mg)，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)；乙醇、考馬斯亮藍(lán)G-250、咔唑、碘、碘化鉀、茚三酮、葡萄糖，均為分析純，上海阿拉丁試劑有限公司產(chǎn)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

EL204型電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司產(chǎn)；Agilent 7890-5975氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀，美國Agilent公司產(chǎn)；YM50-Z紫外-可見分光光計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)；同時(shí)蒸餾萃取管，鄭州輕工業(yè)大學(xué)自制；HWS-12電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

pH值、溫度和酶反應(yīng)時(shí)間是影響酶活力的重要因素之一，但受設(shè)備限制，往往很難在工廠中調(diào)整生產(chǎn)溫度和pH值。因此本文也直接將酶制劑添加到濃縮液中，在常溫和不改變濃縮液pH值的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.1 濃縮液酶處理實(shí)驗(yàn)組：分別用1 g/L的蛋白酶、0.5 g/L的果膠酶、1 g/L的淀粉酶處理濃縮液作為實(shí)驗(yàn)組，以濃縮液原液為空白組，樣品反應(yīng)均在室溫下進(jìn)行，加轉(zhuǎn)子攪拌處理2 h。

1.3.2 常規(guī)化學(xué)成分的測定酶處理反應(yīng)結(jié)束后立即測量各常規(guī)化學(xué)成分含量，以空白組為基準(zhǔn)計(jì)算蛋白質(zhì)、果膠、淀粉、氨基酸、還原糖、總糖含量的變化率。濃縮液中蛋白質(zhì)含量測定參考考馬斯亮藍(lán)法[14]，果膠含量測定參考咔唑比色法[15]，淀粉含量測定參考碘顯色法[16]，氨基酸含量測定參考茚三酮顯色法[17]，還原糖和總糖含量測定參考3,5-二硝基水楊酸比色法[18]。

1.3.3 香味成分的測定濃縮液經(jīng)酶處理后,還原糖、氨基酸等物質(zhì)含量會(huì)發(fā)生不同程度的改變，這可能會(huì)促進(jìn)濃縮液中美拉德反應(yīng)的發(fā)生，從而形成一些香味成分。因此為進(jìn)一步考查不同酶處理對(duì)濃縮液中香味成分含量的影響，將采用同時(shí)蒸餾萃取法對(duì)濃縮液中的香氣成分進(jìn)行提取。具體做法為：分別量取50 mL濃縮液、1 mL內(nèi)標(biāo)溶液(質(zhì)量濃度為1.032 mg/mL的乙酸苯乙酯)和300 mL蒸餾水加入1000 mL燒瓶中，混勻；加入126 g氯化鈉和適量沸石，連接到同時(shí)蒸餾萃取裝置的一端，另一端連接盛有50 mL二氯甲烷的燒瓶，60 ℃水浴加熱，同時(shí)蒸餾萃取2 h；將燒瓶取下，加入適量無水硫酸鈉，置于冰箱中干燥過夜；將萃取液過濾后在46 ℃水浴中濃縮至1.0 mL；經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，使用GC-MS聯(lián)用儀分析其揮發(fā)、半揮發(fā)香味成分。

GC分析條件：色譜柱安捷倫 HP-5(30 m×250 μm×0.25 μm)，載氣為高純氦氣；進(jìn)樣口溫度230 ℃；載氣流速1.0 mL/min。進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比5∶1，進(jìn)樣量1 μL。升溫程序?yàn)橹鯗?0 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至280 ℃，保持5 min，再以4 ℃/min 升至 300 ℃。

MS分析條件：電子轟擊源(EI)，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，質(zhì)譜掃描方式為全掃描，溶劑延遲8 min。

數(shù)據(jù)分析：香味成分通過NIST譜庫進(jìn)行定性分析。采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，并剔除檢測結(jié)果中匹配度低于75%的物質(zhì)。

1.3.4 感官品質(zhì)評(píng)價(jià)方法實(shí)驗(yàn)組煙支樣品制備：取適量酶處理后的濃縮液按照39%的涂布率均勻涂抹在煙草薄片片基上，經(jīng)90 ℃烘箱干燥后得到成品煙草薄片；煙草薄片切絲后放入溫度(22±1)℃和相對(duì)濕度(60±2)%的恒溫恒濕箱內(nèi)平衡48 h；用手工卷煙機(jī)將煙絲卷制成煙支，每個(gè)煙支煙絲質(zhì)量為0.7 g。

空白組煙支樣品制備：取空白組濃縮液按一定回涂比均勻涂抹在煙草薄片片基上，經(jīng)干燥后得到成品煙草薄片。其余步驟同實(shí)驗(yàn)組。

將卷好的煙支放入溫度(22±1)℃和相對(duì)濕度(60±2)% 的恒溫恒濕箱內(nèi)平衡48 h后進(jìn)行感官評(píng)吸。共選取7位評(píng)吸人員，評(píng)吸項(xiàng)目參照成品煙評(píng)吸標(biāo)準(zhǔn)，即《卷煙 第4部分：感官技術(shù)要求》(GB 5606.4—2005 )[19]。由于煙支全部由煙草薄片制作，因此對(duì)煙支光澤這一指標(biāo)不作評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶處理后濃縮液中常規(guī)化學(xué)成分變化分析

酶處理后濃縮液中常規(guī)化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果如表1所示。由表1可知，經(jīng)中性蛋白酶處理后,濃縮液中蛋白質(zhì)降解率較高，降幅達(dá)17.09%；經(jīng)果膠酶和淀粉酶處理后，果膠和淀粉的降解率較低，降幅分別為8.68%和8.95%。經(jīng)中性蛋白酶處理后，濃縮液中還原糖、總糖和氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有較大程度減少，降幅分別為27.30%、16.18%和14.53%，這可能是由于濃縮液經(jīng)中性蛋白酶處理后產(chǎn)生的氨基酸與濃縮液中原有的糖類物質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)消耗了一定的底物。而濃縮液在經(jīng)果膠酶和淀粉酶處理后，還原糖和氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所減少，但降幅都不是很大，這可能是酶制劑作用效果不顯著所導(dǎo)致；總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所增加，可能是自身水解所導(dǎo)致。

表1 酶處理后濃縮液中常規(guī)化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 The content of conventional chemical components in the concentrate after enzyme treatment %

2.2 酶處理后濃縮液中主要香味成分變化分析

酶處理后濃縮液中主要香味成分及其質(zhì)量濃度結(jié)果如表2所示。由表2可知，濃縮液經(jīng)中性蛋白酶處理后，香味成分種類和質(zhì)量濃度均有明顯程度提高。香味成分種類特別是美拉德反應(yīng)產(chǎn)物種類增加明顯，如5-甲基呋喃醛、4-環(huán)戊烯-1,3-二酮、糠醇、2-乙?；秽?-乙酰基吡咯等。對(duì)比空白組濃縮液，經(jīng)中性蛋白酶處理后，濃縮液香味成分總含量由0.907 mg/mL提升到2.844 mg/mL，增幅達(dá)213.56%。部分煙草特征致香成分質(zhì)量濃度顯著增加，如巨豆三烯酮、大馬士酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯，分別增加了31.21%、331.52%和110.00%。

表2 酶處理后濃縮液中主要香味成分及其質(zhì)量濃度Table 2 Main aroma components and mass concentration in concentrated solution after enzyme preparation mg/mL

濃縮液中香味成分質(zhì)量濃度的增加,可能是濃縮液中的蛋白質(zhì)在經(jīng)過酶處理后產(chǎn)生了大量的氨基酸進(jìn)而促進(jìn)美拉德反應(yīng)所致。一方面，部分芳香族氨基酸自身代謝生成苯甲醇、苯乙醇等香味成分；另一方面，部分游離氨基酸與濃縮液中的糖類物質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成了一些如5-甲基呋喃醛、4-環(huán)戊烯-1,3-二酮、糠醇等香味成分。同時(shí)，濃縮液中的蛋白質(zhì)在經(jīng)中性蛋白酶處理后，大分子蛋白被酶解成相對(duì)分子質(zhì)量大小不等的氨基酸和多肽鏈，降低了濃縮液的黏稠度，提高了氧氣在濃縮液中的溶解度；某些具有特殊結(jié)構(gòu)的多肽鏈可能增加類胡蘿卜素與氧氣的分子碰撞機(jī)率，從而促進(jìn)類胡蘿卜素的氧化降解，導(dǎo)致巨豆三烯酮、大馬士酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯等香味成分質(zhì)量濃度增加。

本文中性蛋白酶處理濃縮液后香味成分的種類和含量均有所增加的結(jié)果與楊宗燦等[20]采用生物酶處理煙草制品后的研究結(jié)果一致，也進(jìn)一步說明了不同酶處理濃縮液有利于促進(jìn)濃縮液中具有香氣特征的小分子化合物的生成，增加濃縮液中香味成分質(zhì)量濃度，進(jìn)而提高煙草薄片的整體質(zhì)量；但經(jīng)果膠酶和淀粉酶處理后，兩組濃縮液中香味成分的種類和質(zhì)量濃度改變并不顯著，這與許春平等[21]研究結(jié)果不一致，可能是原料中淀粉和果膠質(zhì)量濃度較少，酶制劑作用效果不明顯所致。

2.3 酶處理后卷煙樣品感官品質(zhì)評(píng)價(jià)結(jié)果分析

各處理組煙支樣品感官品質(zhì)評(píng)吸結(jié)果如表3所示。由表3可知，中性蛋白酶處理組煙支的香氣、諧調(diào)性、刺激性、余味明顯優(yōu)于其他組。感官品質(zhì)總體評(píng)價(jià)為：中性蛋白酶處理組>淀粉酶處理組>空白組>果膠酶處理組。因此，在濃縮液中添加中性蛋白酶后，煙支的整體抽吸品質(zhì)有較大提升。

表3 卷煙感官品質(zhì)評(píng)吸結(jié)果Table 3 Cigarette smoking sensory evaluation results 分

3 結(jié)論

本文對(duì)貴州地區(qū)來源原料制備的煙草薄片濃縮液進(jìn)行了生物酶處理，運(yùn)用GC-MS法等研究了酶處理濃縮液的常規(guī)化學(xué)成分和香味成分變化，發(fā)現(xiàn)煙草薄片濃縮液經(jīng)中性蛋白酶處理后，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度大幅降低，還原糖、總糖和氨基酸質(zhì)量濃度均有較大程度減少，香味成分種類增多、質(zhì)量濃度增加。將酶處理后的濃縮液涂布于煙草薄片片基上，并對(duì)其感官品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶處理濃縮液制得的煙支整體抽吸品質(zhì)明顯優(yōu)于淀粉酶組、果膠酶組和空白組。本文研究結(jié)果為中性蛋白酶在貴州原料來源煙草薄片生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支撐，但本文僅在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行了小范圍研究，后續(xù)將進(jìn)一步探究大批量煙草薄片濃縮液的酶處理方法，以期為其工業(yè)化應(yīng)用提供參考。