朱孝霖，徐珂盼，羅雯，王怡，趙希岳，蔡志強*

常州大學(xué)藥學(xué)院（常州 213164）

果膠是一種天然復(fù)雜的糖類聚合物，在化學(xué)中，果膠被定義為是由α-1, 4共價鍵連接半乳糖醛酸單元組成的一種陰離子多糖。植物組織中的果膠常與纖維素或半纖維素等其他成分共價結(jié)合組成植物細(xì)胞壁，在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[1]。果膠常被用于酸奶制品、面包餡料，作為膠凝劑用于果醬、果凍。果膠按形態(tài)可劃分為3種，即果膠、原果膠和果膠酸[2]。

果膠酶屬于水解酶的一種，用于分解果膠物質(zhì)，廣泛存在于高等植物和微生物中。在紡織、造紙、醫(yī)藥工業(yè)、廢水處理、動物飼料生產(chǎn)及原生質(zhì)體融合等諸多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[3]，特別地在果酒釀造中具有提高出汁率、加速澄清等重要作用，由于果膠酶進口較多，不僅增加生產(chǎn)成本，也使我國果酒生產(chǎn)技術(shù)受到制約，因此，自主研發(fā)出具有知識產(chǎn)權(quán)的果膠酶是目前各個行業(yè)中亟待解決的問題[4]。果膠酶分類方法較多，一般可以分為原果膠酶、果膠酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶[5]。Amin等[6]預(yù)計到2021年，果膠酶市場規(guī)?？蛇_(dá)3 550萬美元，而現(xiàn)有研究大多以微生物為主，也正是由于微生物生長條件簡單，生產(chǎn)酶周期短，而且具有產(chǎn)量高、效率高、酶活好等優(yōu)點，因此也是工業(yè)產(chǎn)酶的首選。

隨著生物技術(shù)的進步，果膠酶的研究在工藝優(yōu)化、分離純化、酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和分子生物學(xué)等方面取得突破性進展[6]，也在盡可能滿足我們對果膠酶日益增長的需求量，因此，著重對產(chǎn)果膠酶菌株篩選、誘變、生物合成、固定化果膠酶內(nèi)容進行綜述，對果膠酶廣闊前景進行展望，為商業(yè)規(guī)模化應(yīng)用、拓展全新應(yīng)用領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 微生物果膠酶的研究

1.1 產(chǎn)果膠酶菌株的篩選

微生物是產(chǎn)果膠酶的重要來源，是否有高的果膠酶活，菌株的品質(zhì)好壞是直接原因，因此近年來研究者在生產(chǎn)果膠酶的菌種選育方面也花費大量精力，其中從大自然篩選優(yōu)質(zhì)的野生菌株便是最常規(guī)的方法[7]。

Anju等[8]首次報道索諾芽孢桿菌生產(chǎn)果膠酶，從腐爛的水果和蔬菜中用碘液顯色方法從果膠瓊脂平板篩選出的7株果膠酶產(chǎn)生菌中，進一步確定索諾芽孢桿菌為最高效的菌株MPTD1，經(jīng)液體深層發(fā)酵優(yōu)化后最大酶活為2.43 U/mL。Akinyemi等[9]從尼日利亞拉各斯瀉湖中的腐爛木屑中分離出巨大芽孢桿菌、巴達(dá)維亞芽孢桿菌和擬芽孢桿菌，經(jīng)深層發(fā)酵以果膠為底物，進行產(chǎn)果膠酶能力篩選，研究表明與其他2株篩選菌相比，擬芽孢桿菌產(chǎn)果膠酶活力最高。Saifur等[10]從韓國發(fā)酵食品泡菜中分離出產(chǎn)強堿的堿性果膠酶PNs31的枯草芽孢桿菌CBS31，使用碘-碘化鉀溶液染色、NaCl脫色方法進行篩選。羅群等[11]使用剛果紅染色、NaCl溶液脫色方法，篩選出透明圈/菌落直徑比值較大的高產(chǎn)果膠酶的黑曲霉。姜立春等[12]從腐爛水果中分離到1株產(chǎn)果膠酶的黃曲霉，使用果膠作為唯一碳源，結(jié)合盧戈氏碘液染色、生理鹽水脫色方法進行篩選。有研究通過溴酚藍(lán)法根據(jù)透明圈大小判定果膠酶活的大小，進而篩選出高產(chǎn)果膠酶的菌株；通過添加一定量CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），依據(jù)水解圈的大小來篩選高產(chǎn)果膠酶的菌株[5,11]。

1.2 產(chǎn)果膠酶菌株的常規(guī)育種

除了從大自然中篩選野生菌株生產(chǎn)果膠酶，將原始菌株經(jīng)紫外誘變、化學(xué)誘變、脈沖等多種單一或者復(fù)合方法進行改變，獲得正向突變菌株，也是提高果膠酶酶活最常見的策略[12-13]。

車鑫[14]以Aspergillus terreusgxy12-2為出發(fā)菌株，通過紫外誘變中的輻射將能量傳遞到生物體內(nèi)，使得生物體內(nèi)各種分子發(fā)生電離、激發(fā)產(chǎn)生大量化學(xué)性質(zhì)十分活躍的自由原子或自由基團，結(jié)合亞硝基胍誘變中烷化基團使DNA分子上的堿基及磷酸部分被烷化，導(dǎo)致DNA復(fù)制時堿基配對錯誤引起突變，從而篩選到A.terreusZH2-4和A.terreusZH2-11兩個正向突變菌株，與原始出發(fā)菌株相比，其誘變菌獲得的酸性果膠酶酶活分別提高到原來的1.45倍和1.02倍。張佰清等[15]通過脈沖方法誘變黑曲霉，獲取了高產(chǎn)果膠酶的正向突變菌株L9，與原始菌株相比，其果膠酶活力提高到182.22%±0.18%，可達(dá)192.67 U/mL。杜國軍等[16]也是采用復(fù)合誘變方法，即亞硝酸-紫外對黑曲霉HY-D3處理，獲得突變株HY-LL3，經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化，果膠酶酶活高達(dá)到3 124 U/g，與原始菌株相比，提高2.59倍。Rohena等[17]以黑曲霉YQ-13為出發(fā)菌株，結(jié)合紫外與氯化鋰復(fù)合誘變反復(fù)處理，使用碘液染色方法進行初篩，依據(jù)產(chǎn)酶能力進行復(fù)篩，最終獲得1株能夠穩(wěn)定遺傳的正向突變菌株，其果膠酶活力為67.6 U/mL，比出發(fā)菌株提高2.44倍，經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化，果膠酶活力提高至92.1 U/mL。何海燕等[18]利用微波照射方法處理棘孢曲霉D80菌株，獲得1株正突變菌株DW75，與出發(fā)菌株D80相比，酶活提高2.47倍。由此可見菌株的常規(guī)誘變育種是一種有效提高果膠酶活力的普遍手段。

1.3 產(chǎn)果膠酶菌株的基因工程

除了通過常規(guī)的誘變菌株獲取正突變菌株來提高果膠酶生產(chǎn)，國內(nèi)外研究學(xué)者還對果膠酶的分子生物學(xué)方面進行探究，從編碼果膠酶的基因入手，進行克隆、純化、高效表達(dá)等多種基因工程手段來進一步提高果膠酶酶活。

Rajulapati等[19]克隆耐熱梭狀芽孢桿菌來源的果膠甲酯酶基因至pET-28a，以大腸桿菌BL21為表達(dá)菌株，并添加異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，對其氨基酸序列進行分析，結(jié)果表明它與菊花歐文菌來源的果膠甲酯酶有38%同源性，而且重組Ct PME以可溶性蛋白形式表達(dá)，在SDS-PAGE凝膠上顯示1條分子量約35.2 kDa的單條帶，并結(jié)合最先進、最準(zhǔn)確的方法MALDI-TOF MS分析其分子量，結(jié)果與凝膠顯示一致。劉曉肖等[20]以全基因合成的類芽孢桿菌來源的堿性果膠裂解酶基因為模版，設(shè)計引物經(jīng)PCR擴增得到含預(yù)測的信號肽及不含預(yù)測信號肽的果膠酶基因，并在畢赤酵母GS115中分泌表達(dá)，自身預(yù)測信號肽PF的使用使得甲醇誘導(dǎo)144 h時酶活提高111.66%，又在PF信號肽基礎(chǔ)上對啟動子進行改造，使得酶活進一步提高51.47%，達(dá)到89.65 U/mL。Zhang等[21]克隆黑曲霉ZJ5果膠甲酯酶基因pME-zj5a，并成功在畢赤酵母中進行高效異源表達(dá)，且PMEZJ5A與CaCl2配合使用會提高菠蘿硬度。Zhong等[22]克隆篩選出的木質(zhì)擬桿菌果膠甲基酯酶基因，并在大腸桿菌中進行異源表達(dá)，且PxPME與CaCl2復(fù)合使用會將菠蘿塊的硬度提高114%。何玉蘭等[23]從黑曲霉來源的果膠裂解酶基因（pelA、pelB、pelC、pelD、pelF）中成功篩選并克隆出2個高表達(dá)基因pelA和pelD，及相應(yīng)黑曲霉轉(zhuǎn)化菌株SH2-PelA和SH2-PelD，并對轉(zhuǎn)化菌株進行發(fā)酵產(chǎn)酶工藝研究，結(jié)果表明在搖瓶發(fā)酵條件下最高酶活力分別為11 069.2和8 822.6 U/mL，在液體深層發(fā)酵條件下最高酶活力分別為65 148.8和35 670.0 U/mL，分別比搖瓶發(fā)酵酶活提高5.9倍和4.0倍，研究表明重組菌株的工業(yè)化大量生產(chǎn)酸性果膠裂解酶潛力。Sharma等[24]以農(nóng)業(yè)廢棄物為底物，獲得堿性木聚糖酶活力415.22±18.50 IU/mL，堿性果膠酶活力為109.10±8.80 IU/mL，這也是首次提出在短發(fā)酵周期下，優(yōu)化液體發(fā)酵條件，在接種物中利用木聚糖和果膠的粗提同時提高兩種堿性酶活性的方法。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究院首次報道從草酸青霉SX6中鑒定具有獨立催化結(jié)構(gòu)域，新的28家族雙功能果膠酶，具有果膠甲酯酶和多聚半乳糖醛酸酶活性，與大多數(shù)真菌果膠甲酯酶相比，S6A對70% DM柑橘果膠具有較高的比活力（271.1 U/mg）[25-27]。綜上所述，基因工程改造是提高微生物所產(chǎn)果膠酶活的有效方法。

2 果膠酶固定化研究

生物酶一般都具有高催化活性、強底物專一性和對環(huán)境無污染的優(yōu)點，如果果膠酶直接加入到工廠生產(chǎn)中，就很難再回收利用，所以在一定程度上提高生產(chǎn)成本。因此有研究通過探究固定化酶技術(shù)以提高回收利用率[28]。酶的固定化技術(shù)是通過物理或化學(xué)方法將游離酶和相應(yīng)載體結(jié)合，從而增強酶的穩(wěn)定性，加強保存運輸；同時又能將酶與底物分離，達(dá)到重復(fù)利用、降低成本的目的。常用的物理方法有吸附法、包埋法等；化學(xué)方法有共價鍵結(jié)合法、交聯(lián)法等。

Haneef等[29]為提高酶的催化性能，采用聚丙烯酰胺凝膠包埋的方法對果膠酶進行固定化，結(jié)果表明該方法不僅提高果膠酶的熱穩(wěn)定性，而且也提高果膠酶在各行各業(yè)中重復(fù)利用的可能性，即使經(jīng)過7次反應(yīng)，果膠酶仍保持50%以上的初始活力。Saifur等[10]為提高分離菌株所產(chǎn)果膠酶應(yīng)用的穩(wěn)定性，將果膠酶

PNs31固定在海藻酸鈣珠中，且研究結(jié)果表明固定化酶在第2輪和第3輪的重復(fù)使用試驗中分別保持約83%和65%的相對活性。趙巖等經(jīng)過掃描電鏡和紅外光譜驗證果膠裂解酶PpPel10a被成功固定化，研究采用殼聚糖-戊二醛交聯(lián)法對重組PpPel10a進行固定化，經(jīng)過優(yōu)化固定材料參數(shù)，確定殼聚糖濃度、戊二醛濃度及酶濃度分別為3%，4%和0.8 mg/g時，固定化酶的活性達(dá)到最高值，固定化率達(dá)87.3%，且結(jié)果表明固定化酶具有更寬的溫度和pH穩(wěn)定性范圍。Papadaki等[28]固定化果膠酶的制備是通過包埋交聯(lián)法并結(jié)合超聲波作用，其研究結(jié)果表明在超聲波條件下果膠酶活性提高92.28%。漆丹萍等[30]研究發(fā)現(xiàn)在HPD-750樹脂上固定果膠酶后，仍得到相較游離果膠酶更廣泛的pH適用范圍和更好的熱穩(wěn)定性，并且此固定化酶可以重復(fù)使用10次左右，提高酶的回收利用，降低生產(chǎn)成本。

3 結(jié)語與展望

生物類型催化劑是最綠色環(huán)保型的工業(yè)催化劑，而果膠酶因其良好性能而極具吸引力。自然界中的極端微生物因其廣泛的應(yīng)用類別而非常適合工業(yè)應(yīng)用，農(nóng)用工業(yè)副產(chǎn)品是一個好的底物選擇[30]，固態(tài)發(fā)酵等發(fā)酵過程也是最可靠的。隨著生物技術(shù)的不斷進步，結(jié)合果膠酶研究現(xiàn)狀，對生物合成果膠酶方面進行深入探究，這無疑對工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域來說是一個福音，因此仍需在以下幾點有所側(cè)重：

（1）如何通過有效的基因工程手段改造果膠酶的生產(chǎn)菌株。

（2）如何通過固定化技術(shù)高效結(jié)合果膠酶和載體，進而提高其回收利用率，并根據(jù)載體材料的不同，拓展果膠酶的全新應(yīng)用領(lǐng)域。

（3）改進發(fā)酵工藝，高效提升果膠酶酶活，降低生產(chǎn)成本。

因此，我們應(yīng)繼續(xù)深入研究果膠酶的一系列課題，為拓展其工業(yè)應(yīng)用價值奠定基礎(chǔ)。