田瑞杰，張勇，馮大鴻，王康麗，遲雷，沈祥坤，胡曉龍，何培新

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001;2.河南省食品工業(yè)科學(xué)研究所有限公司，河南 鄭州 450053

0 引言

濃香型白酒作為中國(guó)傳統(tǒng)蒸餾酒的典型代表，以其獨(dú)特的自然固態(tài)發(fā)酵工藝和典型的酒體風(fēng)味特征而享有盛名[1]。酒醅主要是指處于整個(gè)固態(tài)發(fā)酵過程中的多種物料混合物，是白酒釀造微生物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵的主要載體和白酒風(fēng)味物質(zhì)的直接來源。酒醅微生物(細(xì)菌、霉菌、酵母菌、產(chǎn)甲烷菌、乳酸菌等)主要來自酒曲、窖泥、操作工具、車間環(huán)境等[2-3]，它們?cè)诮殉貎?nèi)經(jīng)過一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)和能量代謝，形成多樣的風(fēng)味物質(zhì)(有機(jī)酸、醇類、酯類等)[3-4]。

近年來，基于DNA水平的免培養(yǎng)技術(shù)(DNA序列同源分析、PCR-DGGE(聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳)、克隆文庫、二代測(cè)序等)已廣泛應(yīng)用于白酒酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的解析[5-15]，濃香型白酒酒醅微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性特征逐漸清晰。例如，乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、片球菌屬、地芽孢桿菌屬等是酒醅中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬[5,11,13-14]，Kazachstania、Thermoascus、Issatchenkia等是酒醅中的優(yōu)勢(shì)真菌屬[8,12,15]。但上述基于DNA水平方法檢測(cè)到的微生物大部分處于死亡或休眠狀態(tài)，不能準(zhǔn)確反映濃香型白酒發(fā)酵過程中真正有貢獻(xiàn)的活性微生物[1,16-17]。與基于DNA水平的技術(shù)相比，基于RNA水平的宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)能深入了解差異表達(dá)基因(DEG)，準(zhǔn)確揭示目標(biāo)環(huán)境樣品中的活性微生物群落，以及與風(fēng)味物質(zhì)合成相關(guān)的功能微生物及其代謝途徑，目前已廣泛應(yīng)用于土壤、海洋、湖泊等生態(tài)環(huán)境[18]及豆醬、奶酪、泡菜、白酒等發(fā)酵食品的微生物研究中[19]。例如，Z.W.Song等[7]利用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，酵母菌(釀酒酵母屬、畢赤酵母屬、裂殖酵母屬和接合酵母屬)和乳酸菌(乳桿菌屬)中的丙酮酸代謝活動(dòng)在醬香型白酒風(fēng)味成分的產(chǎn)生中分為兩個(gè)階段：第一階段為乙醇合成，裂殖酵母屬是核心功能微生物；第二階段為乳酸和乙酸合成，乳桿菌屬是核心功能微生物。因此，采用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究濃香型白酒酒醅中的活性微生物群落結(jié)構(gòu)、代謝反應(yīng)和功能特征，有助于進(jìn)一步揭示其固態(tài)發(fā)酵機(jī)制和風(fēng)味物質(zhì)合成途徑的重要環(huán)節(jié)。

窖池中不同層次酒醅的物料配比、與黃水和窖泥的接觸程度及發(fā)酵后期理化性質(zhì)的變化均會(huì)造成酒醅微生物群落的空間異質(zhì)性[5,20-21]。例如，胡曉龍等[5]采用16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)對(duì)發(fā)酵過程中不同空間位置的濃香型白酒酒醅細(xì)菌群落進(jìn)行解析后發(fā)現(xiàn)，具有相同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的窖池中層，酒醅細(xì)菌群落的多樣性高于上層和下層。呂輝等[22]研究發(fā)現(xiàn)，不同空間位置的酒醅微生物生長(zhǎng)情況不一樣，具體表現(xiàn)為上層酒醅細(xì)菌數(shù)量最多，下層酒醅酵母菌數(shù)量最多。而不同層次酒醅微生物群落的結(jié)構(gòu)差異會(huì)導(dǎo)致不同層次酒醅的風(fēng)味代謝物產(chǎn)生差異[23]。此外，25 d左右是白酒發(fā)酵過程中的重要時(shí)間節(jié)點(diǎn)，此時(shí)主發(fā)酵期結(jié)束，進(jìn)入酯化階段，部分酒精在酯化反應(yīng)中合成生香物質(zhì)，使產(chǎn)酒下降、生香增多[24-25]。目前，對(duì)該發(fā)酵節(jié)點(diǎn)濃香型白酒酒醅中的活性微生物群落的結(jié)構(gòu)、差異表達(dá)基因、代謝功能的空間異質(zhì)性研究未見報(bào)道。

基于此，本研究擬采用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，以主發(fā)酵期結(jié)束后的第25 d作為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，選取濃香型白酒生產(chǎn)窖池的上、中、下層不同空間位置的酒醅作為研究對(duì)象，深入揭示酒醅中具有生理活性的細(xì)菌和真菌群落在窖池不同空間位置的組成及差異表達(dá)基因，以期為進(jìn)一步了解濃香型白酒整個(gè)發(fā)酵過程中的酒醅活性微生物群落的演替規(guī)律、代謝功能、發(fā)酵機(jī)理等提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品：酒醅樣品，取自河南省某濃香型白酒企業(yè)生產(chǎn)車間。

實(shí)驗(yàn)試劑：十二烷基硫酸鈉(SDS)，上海百賽生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)；β-巰基乙醇、異戊醇、聚乙二醇(PEG)、焦碳酸二乙酯(DEPC)，上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)；水飽和酚(pH值為4.5)，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)；無水乙醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、RNase-Free Water、2×Taq Master Mix、2000 Marker、6×loading buffer，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)；MgCl2、NaCl、CaCl2、草酸鈉、NaH2PO3、Na2HPO3、乙二胺四乙酸二鈉，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司產(chǎn)。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

MP200A型精密電子天平，上海良豐儀器儀表有限公司產(chǎn)；TGL-20M型高速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)；Mixer4K微型渦旋混合儀，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)；85-2型恒溫磁力攪拌器，江蘇金壇市中大儀器廠產(chǎn)；IMS-40型全自動(dòng)雪花制冰機(jī)，常熟市雪科電器有限公產(chǎn)；LDZX-50KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海中安醫(yī)療器械廠產(chǎn)；SW-CJ-1型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)；DYY-8C型電泳儀、WD-9403C型紫外儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)；NanoDrop2000型微量分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)；移液槍，上海大龍公司產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酒醅樣品采集以發(fā)酵時(shí)間為25 d的濃香型白酒酒醅為研究對(duì)象，分別在3個(gè)不同窖池的上、中、下層位置各取樣50 g，將3個(gè)窖池的同一層酒醅樣品混合后得到該層的代表樣品，將其放入無菌袋并置于盛有干冰的泡沫箱中，立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行總RNA提取。上、中、下層的代表樣品分別編號(hào)為T25、M25、B25。

1.3.2 宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序首先，按照文獻(xiàn)[26]中的SDS-苯酚法對(duì)酒醅進(jìn)行總RNA提?。蝗缓?，采用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(jì)評(píng)估總RNA的質(zhì)量濃度、純度和完整性；最后，選擇高質(zhì)量的RNA樣本構(gòu)建Illumina測(cè)序文庫。宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在北京奧維森科技有限公司的 Illumina Hiseq 2500平臺(tái)上完成。

1.3.3 宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析過濾測(cè)序獲得的原始序列，剔除帶有測(cè)序接頭、未知堿基含量大于1%和低質(zhì)量堿基(Q≤20)含量大于50%的序列得到質(zhì)控后序列，利用Diamond軟件將其與NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，并利用Megan軟件進(jìn)行微生物分類學(xué)解析。在物種分類結(jié)果中，挑選屬于細(xì)菌界和真菌界的微生物，并對(duì)其門、綱、屬水平上微生物的豐度進(jìn)行換算后，以屬水平數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，按照公式①計(jì)算所有酒醅樣品中細(xì)菌界和真菌界的活性微生物群落的多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))。柱狀圖和熱圖分別采用Origin和Heml軟件進(jìn)行繪制。

①

式中，H為Shannon指數(shù)，s為微生物屬總數(shù)，Pi為第i個(gè)屬的數(shù)量占總數(shù)的比例。

采用 Trinity(v0.27)軟件對(duì)質(zhì)控后序列進(jìn)行拼接，以拼接后得到的轉(zhuǎn)錄組作為參考序列(ref)，采用RSEM軟件[26]將每個(gè)樣品的質(zhì)控后序列對(duì)ref做映射，得到每個(gè)樣品比對(duì)每個(gè)基因的序列數(shù)目，并對(duì)其進(jìn)行FPKM(每百萬片段中來自某一基因每千堿基長(zhǎng)度的片段數(shù)目)轉(zhuǎn)換，進(jìn)而分析基因的表達(dá)水平。使用統(tǒng)計(jì)軟件R中的edgeR包和DESeq2包，分析不同樣品間表達(dá)有差異的基因，并使用火山圖對(duì)其分布情況進(jìn)行分析，閾值設(shè)定為:|log2(fold change)|>1且q<0.05。使用KOBAS(2.0)軟件，設(shè)置參數(shù)--fdr為BH(即使用BH校正)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行 KEGG 代謝通路富集分析，結(jié)果以散點(diǎn)圖形式展現(xiàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

經(jīng)宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及質(zhì)量控制后，3個(gè)樣品共獲得33.1 G的堿基，各個(gè)樣品雙端測(cè)序后的序列獲得率均在99%以上，平均測(cè)序錯(cuò)誤率≤0.03%，且Phred質(zhì)量值分別大于20和30的堿基數(shù)占總堿基數(shù)的比例(Q20、Q30)均大于93.59%(見表1)，表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，可用于下一步分析。此外，由于普通的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫中Read1和Read2 會(huì)以相等的概率取自基因的正反鏈，所以Read1和Read2上的鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)分布傾向于等比例。在本研究測(cè)序數(shù)據(jù)中，同一樣品雙端測(cè)序所得的Read1和Read2數(shù)據(jù)中G與C的數(shù)量和占總堿基數(shù)的比例相差較小，即測(cè)序數(shù)據(jù)沒有出現(xiàn)明顯的G和C分離，表明測(cè)序質(zhì)量較好，有利于下一步的數(shù)據(jù)分析。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Sequencing data statistics

2.2 各層酒醅中的活性微生物群落的組成分析

將質(zhì)控后序列與NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析后，各層酒醅樣品中具有轉(zhuǎn)錄活性的細(xì)菌和真菌群落在不同分類水平上的微生物數(shù)目及物種多樣性結(jié)果如表2和表3所示。由表2和表3可知，所有酒醅樣品中，細(xì)菌群落共檢測(cè)到87個(gè)門、78個(gè)綱、165個(gè)目、396個(gè)科、1612個(gè)屬和7234個(gè)種，真菌群落共檢測(cè)到8個(gè)門、26個(gè)綱、58個(gè)目、127個(gè)科、223個(gè)屬和394個(gè)種，真菌數(shù)量明顯低于細(xì)菌數(shù)量。本研究是從RNA水平揭示濃香型白酒酒醅中的活性微生物群落的分類情況，因此細(xì)菌屬(1612個(gè))和真菌屬(223個(gè))的數(shù)量遠(yuǎn)高于已報(bào)道酒醅中細(xì)菌屬(496個(gè))和真菌屬(155個(gè))的數(shù)量[12-13]。此外，不同層酒醅之間的活性微生物數(shù)目差異較小，下層酒醅的細(xì)菌數(shù)目在屬和種兩個(gè)水平上高于上層和中層，在其他水平上低于其余兩層;真菌數(shù)目則是下層略高于其余兩層。在微生物多樣性方面，上層酒醅的細(xì)菌物種多樣性最高，中層的最低；真菌物種多樣性則是中層最高，上層最低，且真菌群落的物種多樣性明顯高于細(xì)菌群落。胡曉龍等[5]通過16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)(DNA水平)對(duì)濃香型白酒酒醅細(xì)菌群落進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵25 d時(shí)，微生物Shannon指數(shù)表現(xiàn)為中層最高，上層最低，與本研究結(jié)果正好相反，這可能是由于各研究所使用的測(cè)序技術(shù)不同，方法的局限性和測(cè)序的步驟也不同，給研究結(jié)果帶來了不同的影響[17]。

表2 各層酒醅樣品中細(xì)菌群落在不同分類水平上的微生物數(shù)目及物種多樣性結(jié)果Table 2 The number of microorganisms and species diversity of the bacterial communities in each layer of fermented grains samples at different taxonomic levels

表3 各層酒醅樣品中真菌群落在不同分類水平上的微生物數(shù)目及物種多樣性結(jié)果Table 3 The number of microorganisms and species diversity of the fungal communities in each layer of fermented grains samples at different taxonomic levels

分別對(duì)各層酒醅樣品中的細(xì)菌群落和真菌群落在門水平和綱水平上的組成進(jìn)行進(jìn)一步解析，結(jié)果如圖1和圖2所示。由圖1可以看出，各層酒醅均以厚壁菌門(Firmicutes，95.52%)為主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(圖1a))，以芽孢桿菌綱(Bacilli，94.64%)為主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱(圖1b))，另外，平均相對(duì)豐度>1.00%的其他優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門和綱分別只有變形菌門(Proteobacteria)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)。本文基于RNA水平的研究結(jié)果與之前基于DNA水平解析得到的酒醅優(yōu)勢(shì)菌門相比，具有一定的相似性，例如，厚壁菌門和變形菌門在不同地區(qū)濃香型白酒酒醅中均被鑒定為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門[3,5,11]，表明酒醅的共性特征(如高醇、高酸)可能是富集上述菌門的主要因素[5]。不同層次酒醅之間相比，厚壁菌門和芽孢桿菌綱含量在中層酒醅中較高，變形菌門和γ-變形菌綱含量在上層酒醅中較高，但整體來看，各層酒醅的細(xì)菌群落的組成基本一致，無顯著差異。在真菌群落中也是如此，各層酒醅中的優(yōu)勢(shì)微生物基本一致，如：上、中、下層酒醅均以子囊菌門(Ascomycota，65.48%)為主要優(yōu)勢(shì)真菌門，其他平均相對(duì)豐度>1.00%的優(yōu)勢(shì)真菌門有擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和毛霉菌門(Mucoromycota)(圖2a))，另外，上、中、下層酒醅均以酵母綱(Saccharomycetes，40.27%)為主要優(yōu)勢(shì)真菌綱，其他平均相對(duì)豐度>1.00%的優(yōu)勢(shì)真菌綱有傘菌綱(Agaricomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、壺菌綱(Chytridiomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)和毛霉菌綱(Mucoromycetes，除下層外)(圖2b))。胡曉龍等[5]研究發(fā)現(xiàn)，相同發(fā)酵時(shí)間節(jié)點(diǎn)下，各層酒醅中的原核微生物群落的結(jié)構(gòu)不存在顯著差異，這與本研究結(jié)果具有一定的相似性。雖然本研究選取的酒醅在窖池不同層次的物料(大曲、原料、糟醅、輔料等)配比不同，但各層次酒醅的活性微生物群落的組成基本一致，表明物料配比可能不是影響活性微生物菌群在窖池不同空間位置生長(zhǎng)和分布的主要因素。

圖1 各層酒醅樣品中細(xì)菌群落在門水平和綱水平上的組成Fig.1 The composition of bacterial communities in each layer of fermented grains samples at phylum level and class level

圖2 各層酒醅樣品中真菌群落在門水平和綱水平上的組成Fig.2 The composition of fungal communities in each layer of fermented grains samples at phylum level and class level

對(duì)所有酒醅樣品中平均相對(duì)豐度排序前20名的活性細(xì)菌屬(94.59%～95.27%)和真菌屬(90.59%～93.22%)分別進(jìn)行熱圖分析(圖3)，通過樣品聚類，兩者均呈現(xiàn)下層與中層酒醅更為相似的特征。在細(xì)菌屬中(圖3a))，3層酒醅均以乳桿菌屬(Lactobacillus，83.34%)為主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，其他平均相對(duì)豐度>1.00%的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為片球菌屬(Pediococcus)和酒球菌屬(Oenococcus)，兩者的平均相對(duì)豐度在不同層次酒醅中的差別均很小，如片球菌屬的平均相對(duì)豐度在上層為3.13%，在中層為3.24%，在下層為3.02%。與胡曉龍等[5]研究結(jié)果相比，濃香型白酒酒醅發(fā)酵后期，以乳桿菌屬為主的乳酸菌不僅在DNA水平上是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，在RNA水平上也處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。乳酸菌的主要產(chǎn)物乳酸，能增加白酒的厚重感，降低其刺激感，對(duì)白酒風(fēng)味的形成具有重要影響[14]。另外，第一次在濃香型白酒酒醅中發(fā)現(xiàn)酒球菌屬也為優(yōu)勢(shì)菌屬，而針對(duì)該菌作用的研究在葡萄酒領(lǐng)域較多，其中的一類菌種(Oenococcusoeni)可觸發(fā)葡萄酒中蘋果酸-乳酸的發(fā)酵，該發(fā)酵過程可降低葡萄酒自身的酸度，提高葡萄酒的品質(zhì)和穩(wěn)定性[27]。酒球菌屬在濃香型白酒發(fā)酵過程中可能也起到了一定作用，具體影響有待進(jìn)一步研究。

在真菌屬中，各層酒醅中的優(yōu)勢(shì)微生物組成也基本一致，但平均相對(duì)豐度略有差異(圖3b))。酵母菌屬(Saccharomyces)在上層(18.87%)和下層(17.92%)酒醅中均為主要優(yōu)勢(shì)真菌屬，中層酒醅中則以Scheffersomyces(17.99%)為主要優(yōu)勢(shì)真菌屬，而Scheffersomyces在上層(18.86%)和下層(17.45%)酒醅中的平均相對(duì)豐度只略低于酵母菌屬。在3層酒醅中共檢測(cè)到11個(gè)平均相對(duì)豐度>1.00%的其他優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，包括鵝膏菌屬(Amanita)、籃狀菌屬(Talaromyces)、盤二孢屬(Marssonina)、畢赤酵母屬(Pichia)、滑銹傘屬(Hebeloma)、曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、Gelatoporia、Batrachochytrium、Baudoinia和Phlebiopsis，而在下層和中層酒醅中各細(xì)菌屬的平均相對(duì)豐度更為接近。之前的報(bào)道[12-13,15]顯示，發(fā)酵25 d左右時(shí)，酒醅中的優(yōu)勢(shì)真菌屬在DNA水平上主要為Kazachstania和Thermoascus，而本研究酒醅中的優(yōu)勢(shì)真菌屬在RNA水平上主要為酵母菌屬或Scheffersomyces，且Thermoascus的平均相對(duì)豐度很低(<0.50%)，Kazachstania未檢測(cè)到。造成此差異的原因可能包括以下三方面：1)在DNA水平上，某些含量較高的酒醅微生物可能處于死亡或休眠狀態(tài)，其轉(zhuǎn)錄活性沒有或較低，而一些含量較低的酒醅微生物則可能具有較高的轉(zhuǎn)錄活性[1,17]；2)兩種水平上，方法的局限性和測(cè)序的步驟不同，可能會(huì)給結(jié)果帶來偏差[17,28]；3)白酒釀造地區(qū)和釀造工藝存在差異。

圖3 酒醅樣品中平均相對(duì)豐度前20名的活性細(xì)菌屬和真菌屬的熱圖Fig.3 Heat map of the top 20 active bacterial genera and fungal genera in the average relative abundance of fermented grains samples

2.3 各層酒醅的差異表達(dá)基因分析

2.3.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果分析圖4為不同層次酒醅之間表達(dá)豐度具有差異的基因(DEGs)火山圖，其中上調(diào)基因是指表達(dá)量上升的基因，下調(diào)基因則與之相反。由圖4可以看出，酒醅樣品B25與M25，B25與T25，M25與T25之間的差異表達(dá)基因數(shù)量分別為90個(gè)、23個(gè)、67個(gè)，表明中層酒醅分別與下層和上層酒醅之間的差異表達(dá)基因數(shù)量較多。B25與M25之間(圖4a))，以中層酒醅作為對(duì)照組，下調(diào)基因數(shù)量(49個(gè))略高于上調(diào)基因數(shù)量(41個(gè))，即下層酒醅的基因表達(dá)量較中層酒醅低。M25與T25之間(圖4c))，以上層酒醅作為對(duì)照組，下調(diào)基因數(shù)量(59個(gè))高于上調(diào)基因數(shù)量(8個(gè))，即中層酒醅的基因表達(dá)量較上層酒醅低。綜上可知，上層酒醅的基因表達(dá)量較中層和下層酒醅高。

圖4 不同層次酒醅之間表達(dá)豐度具有差異的基因(DEGs)火山圖Fig.4 Volcano map of genes with different expression abundances (DEGs)between different levels of fermented grain

2.3.2 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析對(duì)不同層次酒醅之間的差異上調(diào)基因和下調(diào)基因分別進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析，結(jié)果如圖5—7所示。其中，Rich factor指差異表達(dá)的基因中位于該代謝通路的基因數(shù)目與所有注釋基因中位于該代謝通路的基因總數(shù)的比值，q是經(jīng)多重假設(shè)檢驗(yàn)校正之后的p，其取值范圍為[0,1]，越接近0，表示富集越顯著；圖5挑選了富集最顯著的20條代謝通路進(jìn)行展示，不足20條的則全部展示。相較于中層酒醅樣品，下層酒醅樣品的上調(diào)基因富集到了25條代謝通路上(圖5a))。在一級(jí)代謝通路上，有22條通路屬于代謝(Metabolism)、2條通路屬于基因信息加工(Genetic information processing)、1條通路屬于環(huán)境信息加工(Environmental information processing)，其中富集最顯著的通路為RNA降解(RNA degradation)。RNA降解在一級(jí)代謝通路上屬于基因信息加工，下層酒醅中該通路的基因表達(dá)量較高，RNA降解現(xiàn)象較嚴(yán)重，這可能是因?yàn)橄聦泳契x窖池底部較近，能接觸到較多窖泥，且長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵后，底部的黃水水位會(huì)上升，而較多的水分和雜質(zhì)均會(huì)導(dǎo)致RNA降解。此外，下調(diào)基因富集到了16條代謝通路上(圖5b))，在一級(jí)代謝通路上，有15條通路屬于代謝、1條通路屬于細(xì)胞過程(Cellular processes)，其中富集最顯著的通路為群體效應(yīng)(Quorum sensing)。群體效應(yīng)是一種調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在一級(jí)代謝通路上屬于細(xì)胞過程，可使細(xì)菌共享有關(guān)細(xì)胞密度的信息并相應(yīng)地調(diào)節(jié)基因表達(dá)[29]。中層酒醅中該通路的基因表達(dá)量較高，表明中層酒醅中的活性微生物菌群中的基因表達(dá)調(diào)節(jié)能力強(qiáng)于下層酒醅。

圖5 酒醅樣品B25與M25之間差異上調(diào)基因和下調(diào)基因的KEGG代謝通路富集圖Fig.5 KEGG pathway enrichment of up-regulated and down-regulated genes between B25 and M25 in fermented grains samples

相較于上層酒醅樣品，下層酒醅樣品的下調(diào)基因未富集到任何代謝通路上，上調(diào)基因富集到了14條代謝通路上(圖6)。在一級(jí)代謝通路上，所有通路均屬于代謝，其中富集最顯著的通路為糖酵解/糖異生(Glycolysis/Gluconeogensis)。糖酵解是將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸并產(chǎn)生少量ATP(能量)和NADH(還原力)的過程，也是產(chǎn)生重要前體代謝產(chǎn)物(葡萄糖-6P、果糖-6P、乙酰-CoA等)的主要途徑[30]；糖異生是非碳水化合物前體合成葡萄糖的途徑，本質(zhì)上是糖酵解的逆轉(zhuǎn)[31]。兩者在代謝物質(zhì)生成方面均可發(fā)揮重要作用，在發(fā)酵25 d時(shí)，相較于上層酒醅，下層酒醅的活性微生物菌群在代謝活動(dòng)上貢獻(xiàn)更大。

圖6 酒醅樣品B25與T25之間差異上調(diào)基因的KEGG代謝通路富集圖Fig.6 KEGG pathway enrichment of the up-regulated genes between B25 and T25 in fermented grains samples

相較于上層酒醅樣品，中層酒醅樣品的上調(diào)基因富集到了3條代謝通路上(圖7a))。在一級(jí)代謝通路上，均屬于代謝，其中富集最顯著的通路為硒化合物代謝(Selenocompound metabolism)。此外，下調(diào)基因富集到了34條代謝通路上(圖7b))。在一級(jí)代謝通路上，有28條通路屬于代謝、3條通路屬于基因信息加工、2條通路屬于環(huán)境信息加工、1條通路屬于細(xì)胞過程，其中富集最顯著的通路為RNA降解，其次是糖酵解/糖異生。有研究表明[32]，許多微生物可以耐受高質(zhì)量濃度的SeO42-和SeO32-，有些微生物還可以將低價(jià)態(tài)的硒氧化為高價(jià)態(tài)，因此，微生物對(duì)硒進(jìn)行形態(tài)轉(zhuǎn)化是有效解決硒引起的環(huán)境和健康問題的手段之一。另外，微生物對(duì)硒的代謝主要包括硒的轉(zhuǎn)運(yùn)、還原、氧化、同化、甲基化等。相較于上層酒醅，中層酒醅中硒化合物的代謝水平較高，這可能是因?yàn)槠渲写嬖谝恍┛捎绊懳衔锎x的活性微生物，具體是哪些微生物尚有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。此外，上層酒醅中的RNA降解通路的基因表達(dá)較高，且活性微生物菌群在代謝活動(dòng)上的貢獻(xiàn)較大。

圖7 酒醅樣品M25與T25之間差異上調(diào)基因和下調(diào)基因的KEGG 代謝通路富集圖Fig.7 KEGG pathway enrichment of up-regulated and down-regulated genes between M25 and T25 in fermented grains samples

綜上所述，中層酒醅中的活性微生物菌群對(duì)RNA降解的影響最低，下層酒醅中的活性微生物菌群在代謝活動(dòng)上的貢獻(xiàn)最大。

3 結(jié)論

本研究基于宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析了位于窖池不同空間位置的濃香型白酒酒醅(主發(fā)酵期結(jié)束后的第25 d)活性微生物群落的組成及差異表達(dá)基因。不同酒醅層之間的活性微生物數(shù)目差異較小，上層酒醅的細(xì)菌物種多樣性最高，中層酒醅的真菌物種多樣性最高。各層酒醅中的細(xì)菌和真菌群落在門、綱和屬水平上的物種組成基本一致，均以厚壁菌門和子囊菌門為主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門和真菌門，以芽孢桿菌綱和酵母綱為主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱和真菌綱，以乳桿菌屬為主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，以酵母菌屬(上層和下層)或Scheffersomyces(中層)為主要優(yōu)勢(shì)真菌屬。在差異表達(dá)基因表達(dá)水平及功能方面，上層酒醅的基因表達(dá)水平較中層和下層酒醅更高，各層之間的差異表達(dá)基因功能大部分為代謝，且中層酒醅中的活性微生物菌群對(duì)RNA降解的影響最低，下層酒醅中的活性微生物菌群在代謝活動(dòng)上的貢獻(xiàn)最大。本研究可豐富人們對(duì)濃香型白酒酒醅菌群的認(rèn)識(shí)，為揭示微生物生態(tài)系統(tǒng)的特定貢獻(xiàn)、開發(fā)生物強(qiáng)化等技術(shù)以改善濃香型白酒的品質(zhì)提供參考。