楊 文 ,宋 丹 ,宋純東 ,郭 婷 ,段鳳陽(yáng) ,王寧麗 ,張 博,楊 濛

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)兒科醫(yī)學(xué)院,鄭州 450046;2.河南中醫(yī)藥大學(xué),鄭州 450046;3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科,鄭州 450003)

IgA 腎病(IgA nephropathy,IgAN)是我國(guó)最為常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球疾病,以免疫球蛋白 A(immunoglobulin A,IgA)或IgA 免疫復(fù)合物(immune complex,IC)沉積于腎小球系膜區(qū)為特征[1]。臨床主要表現(xiàn)為血尿,部分患者可出現(xiàn)蛋白尿[2]。全球IgAN 約占原發(fā)性腎小球疾病的52.66%[3],約30%～40%的IgAN 患者最終會(huì)進(jìn)展為終末期腎病[4]。其發(fā)病機(jī)制迄今尚不完全明確,亦無(wú)特效治療方案。由于倫理所限,學(xué)者們多通過(guò)建立IgAN動(dòng)物模型不斷探索此病。動(dòng)物模型是研究疾病的重要載體,理想的動(dòng)物模型是研究疾病發(fā)病機(jī)制或藥物療效的前提。IgAN 動(dòng)物模型主要包括4 種,即免疫誘導(dǎo)型、自發(fā)病變型、繼發(fā)病變型、糖基化缺陷型。其中免疫誘導(dǎo)型動(dòng)物模型根據(jù)誘導(dǎo)劑種類不同可分為異種蛋白誘導(dǎo)、病原微生物誘導(dǎo)、免疫復(fù)合物誘導(dǎo)3 種類型,異種蛋白誘導(dǎo)法所建立的IgAN動(dòng)物模型由于模型病理改變與人類相似、經(jīng)濟(jì)成本低而被國(guó)內(nèi)學(xué)者廣泛采用。然而,醫(yī)學(xué)界關(guān)于此法建立IgAN 動(dòng)物模型的用藥劑量及給藥時(shí)間的意見(jiàn)尚不統(tǒng)一[5]。目前,國(guó)外學(xué)者多采用自發(fā)病變型IgAN 動(dòng)物模型,造模成本較高?；诖?本文對(duì)異種蛋白誘導(dǎo)法構(gòu)建IgAN 動(dòng)物模型展開(kāi)綜述,以期為研究者建立IgAN 動(dòng)物模型提供參考。

目前國(guó)內(nèi)多采用異種蛋白誘導(dǎo)法構(gòu)建IgAN 動(dòng)物模型[6],即口服牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的IgA 分子,沉積于腎小球系膜區(qū)誘發(fā)IgAN[7]。IgAN 動(dòng)物模型成功建立主要表現(xiàn)為血尿、腎功能下降等,光鏡下顯示系膜細(xì)胞增生、系膜基質(zhì)增多,免疫熒光檢測(cè)可見(jiàn)腎小球系膜區(qū)IgA 大量沉積。該模型可用于研究IgAN 的發(fā)病機(jī)制、治療方案等。

1 溯源及改良過(guò)程

1.1 溯源

IgAN 動(dòng)物模型由Rifai 等[8]最早建立,國(guó)內(nèi)IgAN 動(dòng)物模型的建立,最早可追溯至1988 年王麗等[9]使用BSA 口服,建立以輕度系膜增生為特征的腎病模型,造模后小鼠腎出現(xiàn)IgA 熒光強(qiáng)度增強(qiáng),電鏡下電子致密物沉積,系膜基質(zhì)增生,為該模型的建立奠定了基礎(chǔ)。

1.2 異種蛋白誘導(dǎo)建立IgAN 動(dòng)物模型改良過(guò)程

1996 年,劉震等[10]通過(guò)對(duì)比4 種不同造模方法,提出采用口服BSA+尾靜脈注射SEB+皮下注射弗氏佐劑,所建立的大鼠增殖性腎小球腎炎模型病變最典型。該研究通過(guò)口服BSA 誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的IgA 分子,沉積于腎小球系膜區(qū)誘發(fā)IgAN,弗氏佐劑用于增強(qiáng)BSA 免疫原性,加速腎組織病理改變。該模型造模時(shí)間短,系膜增生明顯,亦因?qū)嶒?yàn)時(shí)間僅8 周可能影響結(jié)果的判定。

聶莉芳等[11]認(rèn)為,在口服BSA 誘導(dǎo)胃腸粘膜免疫的基礎(chǔ)上加以靜脈注射BSA 誘導(dǎo)的IgAN 模型更符合人類特征,進(jìn)一步改進(jìn)了IgAN 造模方法。具體方法:于第1～6 周按200 mg/kg 隔日口服BSA(以0.1%鹽酸酸化水稀釋),于第6 周開(kāi)始隔日1 次按20 mg/kg 尾靜脈注射BSA,連續(xù)注射3 次,以后仍隔日口服200 mg/kg BSA 到第12 周末。該方法采用口服加尾靜脈注射BSA,目的在于增強(qiáng)胃腸粘膜免疫反應(yīng)。該造模方法易于操作,在12 周末模型出現(xiàn)蛋白尿,病理切片可觀察到系膜細(xì)胞增生,系膜基質(zhì)增多,系膜區(qū)有IgA、免疫球蛋白G(immunoglobu-lin G,IgG)、補(bǔ)體C3沉積,但數(shù)量有限。此模型通過(guò)反復(fù)給模型鼠灌服0.1%的稀鹽酸酸化水,破壞具有堿性環(huán)境的腸道粘膜,進(jìn)而促進(jìn)免疫球蛋白IgA 抗體的產(chǎn)生,形成大量免疫復(fù)合物(immune complex,IC)。此后,宋純東等[12]、趙刃等[13]皆參考此法成功復(fù)制IgAN 動(dòng)物模型。然而,此模型所引起的血尿與IgAN血尿的發(fā)生機(jī)制有所差別。

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院彭偉等[14]通過(guò)對(duì)比兩種不同的造模方法,A 組口服BSA+靜脈注射SEB+注射弗氏佐劑,B 組口服BSA+靜脈注射SEB+注射弗氏佐劑+皮下注射CCl4,發(fā)現(xiàn)B 組大鼠系膜增生較A 組明顯,IgA 分子沉積強(qiáng)度更高。該研究將口服BSA 劑量增加至400 mg/kg,SEB 劑量減少至0.3 mg/kg,增強(qiáng)了免疫原性,降低了毒性,將CCl4由腹腔注射改為皮下注射且劑量減半,減輕了其肝損傷,兩組對(duì)比證明了B 組血尿、蛋白尿出現(xiàn)更早,模型組腎病理改變更為顯著。但由于BSA 劑量仍較低且SEB 毒性較大,該方法所建立的IgAN 動(dòng)物模型仍不理想。

考慮到SEB 毒性較大,湯穎等[15]進(jìn)一步改進(jìn)IgAN 動(dòng)物模型,聯(lián)合應(yīng)用 BSA+脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)+CCl4造模。造模方法:BSA(400 mg/kg,連續(xù)6 周隔天灌胃)+LPS(分別于第6、8 周尾靜脈注射LPS 0.05 mg)+CCl4(下注射CCl40.1 mL+蓖麻油0.5 mL,每周1 次,持續(xù)9 周)。該法以LPS 代替SEB,BSA 劑量較前增加一倍,CCl4給藥方法改為皮下注射且減少劑量至誘導(dǎo)肝硬化劑量的1/3。該模型動(dòng)物成模率高,可重復(fù)性強(qiáng),目前國(guó)內(nèi)研究者復(fù)制IgAN 動(dòng)物模型多沿用此法。然而,該模型在造模時(shí)長(zhǎng)、藥物劑量上仍存在爭(zhēng)議。

陸慧瑜等[16]對(duì)湯穎等[15]的造模方法進(jìn)一步改進(jìn),具體方案為:持續(xù)8 周隔日灌胃BSA 400 mg/kg,每周一次皮下注射蓖麻油0.3 mL+CCl40.1 mL 持續(xù)9 周,于第6 周尾靜脈注射LPS 0.05 mg。該方案將隔日灌服BSA 的時(shí)間由6 周改為8 周,以增強(qiáng)動(dòng)物免疫原性,尾靜脈注射LPS 由2 次改為1 次以減輕LPS累計(jì)毒性對(duì)模型的損傷,加速模型大鼠腎病變的同時(shí)降低死亡率,9 周后成功建立IgAN 動(dòng)物模型。

為精準(zhǔn)把握造模劑量與時(shí)長(zhǎng),有學(xué)者提出BSA+LPS+CCl4分劑量、時(shí)間造模法[17],即將BSA分為高劑量組(600 mg/kg) 和低劑量組(400 mg/kg)隔日灌胃,并在第8 周和12 周觀察病理變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),造模8 周后,大鼠腎病理出現(xiàn)系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)輕度增生,12 周末更為顯著并伴輕度腎間質(zhì)纖維化,低劑量組病變較輕,12 周末可見(jiàn)免疫熒光,高劑量組熒光表達(dá)強(qiáng)于低劑量組。BSA+LPS+CCl4造模法,可在12 周建立病理表現(xiàn)及生化指標(biāo)趨近人類IgAN 的動(dòng)物模型,且高劑量BSA(600 mg/kg)模型更為典型。

為解決在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)、口服不同劑量BSA、BSA 溶劑不同以及在不同節(jié)點(diǎn)注射免疫佐劑對(duì)建立IgAN 大鼠模型影響有差異這些問(wèn)題上存在的爭(zhēng)議,馬思佳等[18]將酸化水作為BSA 溶劑,將BSA 分400 mg/kg 和600 mg/kg 兩種劑量對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃,分多個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)尾靜脈注射LPS。該研究通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn),純化水與酸化水相比作為溶劑效果更加突出,隔日灌服以純化水溶解的高劑量BSA(600 mg/kg),每周1 次皮下注射CCl4,連續(xù)12 周,聯(lián)合第8、10 周每周1 次尾靜脈注射LPS 所建立的IgAN 大鼠模型更接近人類病理。該實(shí)驗(yàn)造模成功率高于90%,在操作過(guò)程中無(wú)大鼠死亡,所提出的造模方法是有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

諸多臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明,腸粘膜免疫系統(tǒng)的激活是IgAN 的重要發(fā)病機(jī)制,腸-腎軸也參與IgAN的發(fā)病[19-22],故有學(xué)者提出將異種蛋白加入到飲用水中喂養(yǎng)動(dòng)物以激活免疫反應(yīng)[23]。Zou 等[24]將牛丙種球蛋白(bovine gamma globulin,BGG)加入飲用水中喂養(yǎng)動(dòng)物9 周,12 周后模型出現(xiàn)明顯的蛋白尿,腎病理見(jiàn)系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)彌漫性增殖,免疫熒光顯示大量IgA 沉積,提示造模成功。通過(guò)自由飲水建立動(dòng)物模型,動(dòng)物存活率高,實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性強(qiáng),但無(wú)法控制飲水量可能會(huì)對(duì)模型造成影響,且模型未出現(xiàn)明顯血尿。

近年來(lái),隨著胸腺肽被廣泛應(yīng)用于各種疾病的輔助治療中,有學(xué)者嘗試將胸腺肽應(yīng)用于建立IgAN動(dòng)物模型。胸腺作為人體重要的免疫器官,其中存在大量免疫細(xì)胞,可分泌抗體。胸腺肽可促進(jìn)胸腺發(fā)育,增強(qiáng)機(jī)體免疫,使免疫細(xì)胞產(chǎn)生的抗體增多?；诖?高明等[25]對(duì)IgAN 動(dòng)物模型進(jìn)行改進(jìn),造模方法為:持續(xù)12 周隔天灌胃BSA 600 mg/kg,每周皮下注射CCl40.1 mL、蓖麻油0.3 mL 及胸腺肽3 mg,分別于第6、8、10 周尾靜脈注射LPS 0.05 mg。觀察12 周后大鼠均出現(xiàn)蛋白尿,并可見(jiàn)典型病理改變,驗(yàn)證了造模成功。與其他模型相比,該研究首次將胸腺肽用于建模,增強(qiáng)了模型的免疫反應(yīng)。該模型免疫熒光強(qiáng)度較強(qiáng),且病理與人IgAN 相似,操作簡(jiǎn)單,造模成功率高,但大部分模型病理僅呈輕至中度病變,未能出現(xiàn)重度系膜增生、新月體形成等病變,仍需進(jìn)一步探索。

以上是目前常見(jiàn)的學(xué)者們運(yùn)用異種蛋白誘導(dǎo)法建立IgAN 動(dòng)物模型的方法,通過(guò)異種蛋白誘導(dǎo)造模機(jī)制復(fù)雜,造模能否成功易受多種因素影響,如動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、研究員專業(yè)素養(yǎng)、動(dòng)物自身耐受性、藥物等。此外,導(dǎo)致異種蛋白誘導(dǎo)法造模失敗還有一個(gè)重要原因在于動(dòng)物本身存在一定的自愈能力。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,若已造模成功的動(dòng)物長(zhǎng)時(shí)間未再次給予外源性抗原,體內(nèi)的免疫細(xì)胞可能會(huì)將原有IC 清除,從而導(dǎo)致造模失敗。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異性也可能導(dǎo)致模型病變程度不一,病理結(jié)果有輕有重,不易控制。模型總結(jié)見(jiàn)表1。

表1 IgAN 常見(jiàn)動(dòng)物模型總結(jié)Table 1 Summary of common animal models of IgAN

續(xù)表1

2 模型間的異同點(diǎn)

總結(jié)上述動(dòng)物模型的異同點(diǎn),以供讀者參考,具體如下:(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要有大鼠、小鼠,其中SD雄性大鼠最為常用。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大致為6～8 周齡。(3)造模時(shí)長(zhǎng)不等,造模時(shí)長(zhǎng)最短為8 周,最長(zhǎng)造模時(shí)長(zhǎng)可達(dá)12 周。(4)造模方法上均采用異種蛋白誘導(dǎo)法造模,造模均通過(guò)口服聯(lián)合注射藥物誘發(fā)動(dòng)物機(jī)體免疫反應(yīng)增強(qiáng)、IC 沉積于腎小球系膜區(qū),具體藥物種類、劑量、給藥時(shí)間各有不同。(5)判斷造模成功的方法主要集中在以下方面:①一般情況:體重、毛發(fā)、精神、食欲、飲水量、尿量及氣味、糞便顏色等;②實(shí)驗(yàn)室指標(biāo):血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功能、腎功能、24 h 尿蛋白定量、炎癥因子、循環(huán)IC 等;③腎病理:光鏡、免疫熒光、電鏡。

3 IgAN 中醫(yī)研究模型改良思路

IgAN 是以系膜區(qū)大量沉積IgA 或IgAIC 為病理特征的原發(fā)性腎小球疾病,血尿?yàn)槠渲饕R床表現(xiàn),可兼有蛋白尿、高血壓等[26]。在中醫(yī)古籍中并未記載有IgAN 的病名,但根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸屬于“尿血”、“虛勞”、“腰痛”、“腎風(fēng)”等范疇[27]。其病因無(wú)外乎先天稟賦不足與外感病邪兩個(gè)方面,異種蛋白誘導(dǎo)法造模主要通過(guò)影響后天來(lái)制備模型。然而目前此法成模評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)多采用病理評(píng)價(jià)方法,即以病理作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn),對(duì)病證結(jié)合模型探索甚少。中醫(yī)強(qiáng)調(diào)辨證論治,同病異治和異病同治的實(shí)質(zhì)是通過(guò)逆轉(zhuǎn)證的變化來(lái)改變疾病發(fā)展趨勢(shì),辨證選方治療可顯著提高治療有效率,大幅度改善模型實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及病理結(jié)果[28]?，F(xiàn)有的免疫異種蛋白誘導(dǎo)法建立IgAN 動(dòng)物模型,模型穩(wěn)定性好,但證候可控性差,無(wú)法確保得到實(shí)驗(yàn)研究所對(duì)應(yīng)的證型,以此為基礎(chǔ)的中藥療效評(píng)價(jià)說(shuō)服力有限。

因此,將病因、癥狀、體征等中醫(yī)要素與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)之客觀指標(biāo)有機(jī)統(tǒng)一起來(lái)建立病證結(jié)合模型是進(jìn)一步改良IgAN 模型的必然要求。構(gòu)建病證結(jié)合模型要盡可能貼近臨床,將疾病造模因素與證候造模因素相結(jié)合,充分考慮到環(huán)境、體質(zhì)、飲食、情志等因素對(duì)機(jī)體的影響,提高造模成功率[29]。同時(shí),要不斷完善證候評(píng)價(jià)體系,探索建立模型動(dòng)物四診信息客觀化采集方法,以保證模型的穩(wěn)定性。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上,IgAN 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其動(dòng)物模型建立方法尚未完全統(tǒng)一,目前尚無(wú)與人類IgAN 臨床表現(xiàn)及病理特征完全一致的動(dòng)物模型。經(jīng)過(guò)學(xué)者們的不斷探索,提出了多種IgAN 模型的造模方法,方法各有千秋。雖然異種蛋白誘導(dǎo)法建立IgAN 動(dòng)物模型可操作性及重復(fù)性強(qiáng),但造模過(guò)程中易受多種因素影響,且因動(dòng)物本身有自愈能力而存在誘導(dǎo)失敗的可能。此外,現(xiàn)有造模方法評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)單一,尚無(wú)研究者提出病證結(jié)合模型。

IgAN 動(dòng)物模型是研究IgAN 發(fā)病機(jī)制、診斷、治療的前提,相信隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步和人們對(duì)IgAN病理機(jī)制的深入探究,IgAN 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型會(huì)不斷革新,愈加符合人類特征。