潘曉慧,張朋輝,江國(guó)健,李 娟,陳桂煌,姚欣伶,馮學(xué)軒

(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,廣州 528248)

小腸缺血再灌注損傷(intestinal ischemiareperfusion injury,IIRI)主要是指由于腸道疾病或腸道外科手術(shù)等原因引起腸道缺血,在恢復(fù)血流供應(yīng)時(shí),產(chǎn)生大量的氧自由基,由于組織細(xì)胞內(nèi)線粒體功能未恢復(fù),對(duì)氧自由基清除能力不足,引起氧化應(yīng)激壓力上升,導(dǎo)致細(xì)胞損傷,進(jìn)而加速細(xì)胞凋亡[1-3]在臨床上表現(xiàn)為腸道功能紊亂和結(jié)構(gòu)損傷、全身炎性反應(yīng)綜合征、多器官功能衰竭等,最終可導(dǎo)致死亡,腸黏膜損傷且伴有腸系膜缺血的患者死亡率可高達(dá)59%～93%[4-5],其死亡率之高及預(yù)后不良使得IIRI 成為了臨床上研究的熱點(diǎn)。如何成功建立與臨床癥狀相一致的IIRI 模型,將有助于推動(dòng)該類疾病的基礎(chǔ)研究,包括臨床癥狀研究及預(yù)后研究,也將有利于藥物干預(yù)研究。但目前針對(duì)IIRI 建模的研究較為薄弱,缺血時(shí)間對(duì)于IIRI 模型的成立起著至關(guān)重要的作用,缺血時(shí)間的長(zhǎng)短決定了機(jī)體內(nèi)自由基的多少及氧化應(yīng)激壓力的高低,缺血時(shí)間過(guò)短未必能造成損傷,缺血時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使組織直接在缺血期發(fā)生不可逆損傷甚至壞死,目前針對(duì)IIRI建模的研究較為薄弱,而缺血時(shí)間對(duì)于IRII 模型的成立起著至關(guān)重要的作用。因此,本實(shí)驗(yàn)主要研究關(guān)鍵因素——缺血時(shí)間,對(duì)IIRI 模型建立的影響,并從發(fā)病機(jī)制、氧化損傷層面及組織病理學(xué)方面評(píng)價(jià)模型的適用性,為用于缺血再灌注損傷防治藥物的研發(fā)提供相應(yīng)的模型工具及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24 只SPF 級(jí)SD 大鼠,雄性,體重221.2～230.6 g,購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2018-0002]。動(dòng)物飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房[SYXK(粵)2018-0002],飼養(yǎng)溫度與濕度:20℃～26℃,40%～70%,采用10 h:14 h 晝夜間斷照明。動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水,所有飼料和飲用水均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(B202005-6),并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉:批號(hào)P3761,德國(guó)默克生產(chǎn);烏來(lái)糖:批號(hào)20171219,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);氯化鈉注射液,批號(hào):201207136,安徽豐原藥業(yè)股份有限公司淮海藥廠生產(chǎn);SOD 試劑盒,批號(hào):20210604,南京建成生物工程研究所生產(chǎn);GSH-Px試劑盒,批號(hào):20210603,南京建成生物工程研究所生產(chǎn);MDA 試劑盒,批號(hào):20210605,南京建成生物工程研究所生產(chǎn);GSH 試劑盒,批號(hào):20210605,南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

BS-3000A 電子分析天平,感量:0.1 g,上海友聲衡器有限公司生產(chǎn);BSA224S 電子分析天平,感量:0.1 mg,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)科技有限公司生產(chǎn);KDC-2046 低速冷凍離心機(jī):科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司生產(chǎn);RM2135 輪轉(zhuǎn)切片機(jī):德國(guó)LEICA 公司生產(chǎn);ASP300S 生物組織全自動(dòng)脫水機(jī):德國(guó)LEICA 公司生產(chǎn);EG1150 生物組織包埋機(jī)及冷凍機(jī):德國(guó)LEICA 公司生產(chǎn);CS-VI 攤片烤片機(jī):湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司生產(chǎn);AutoStainer-XL 生物組織全自動(dòng)染色機(jī):德國(guó)LEICA 公司生產(chǎn);BX43 型生物顯微鏡:日本OLYMPUS 生產(chǎn);CellSens Standard 顯微圖像軟件:日本奧林巴斯公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將24 只SD 大鼠檢疫結(jié)束后,根據(jù)體重隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血30 min 組、缺血1 h 組、缺血2 h組,6 只/組。

1.3.2 模型制備

按2 mL/kg 體重的劑量腹腔注射3%的戊巴比妥鈉溶液將SD 大鼠麻醉,先腹部剃毛備皮,之后仰臥位固定,于腹部正中,腹白線處開(kāi)腹,分離腸系膜上動(dòng)脈,用4 號(hào)手術(shù)線活結(jié)結(jié)扎根部使缺血,直至見(jiàn)腸系膜血管顏色變淺,即為缺血成功。動(dòng)物按20 mL/kg 體重腹腔注射氯化鈉注射液進(jìn)行補(bǔ)液在缺血開(kāi)始及再灌注開(kāi)始時(shí),假手術(shù)組只分離腸系膜上動(dòng)脈,不進(jìn)行缺血再灌注。各實(shí)驗(yàn)組缺血對(duì)應(yīng)時(shí)間后,將活結(jié)解開(kāi),恢復(fù)供血4 h 后大鼠按60 mL/kg體重腹腔注射20%烏來(lái)糖溶液麻醉,腹主動(dòng)脈采血后處死,取小腸進(jìn)行氧化指標(biāo)及組織病理學(xué)檢測(cè)。

1.3.3 指標(biāo)檢測(cè)

(1)腸道組織大體剖檢觀察

大鼠大體剖檢肉眼觀察腸道變化。

(2)氧化指標(biāo)檢測(cè)

取10%腸組織勻漿,按各試劑盒說(shuō)明,測(cè)定SOD、GSH-Px 活性及MDA、GSH 含量。

(3)腸組織病理學(xué)觀察及腸組織損傷評(píng)分

動(dòng)物安樂(lè)死后取小腸固定于4%中性甲醛固定液,進(jìn)行常規(guī)石蠟切片,HE 染色觀察,并測(cè)量小腸絨毛高度及粘膜厚度,觀察炎癥細(xì)胞聚集情況并進(jìn)行炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況評(píng)分,見(jiàn)表1。參照Chiu’s 6 級(jí)評(píng)分法對(duì)小腸組織進(jìn)行半定量評(píng)分,見(jiàn)表2。

表1 炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Inflammatory cell infiltration scoring standard

表2 小腸組織損傷Chiu’s 評(píng)分量表Table 2 Intestinal tissue injury Chiu’s score

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物死亡情況

缺血2 h 組其中兩只大鼠缺血2 h 恢復(fù)供血后出現(xiàn)嚴(yán)重拉稀,并于缺血3 h 后死亡,剖檢發(fā)現(xiàn)小腸出血,瘀黑,死亡動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果未參與統(tǒng)計(jì)。

2.2 大體剖檢結(jié)果比較

假手術(shù)組小腸表面紅潤(rùn)有光澤,回腸至盲腸處內(nèi)容物成型;缺血30 min 組小腸輕微脹氣,內(nèi)容物偏軟;缺血1 h 組肛門處可見(jiàn)稀便,小腸腸壁變薄,小腸內(nèi)脹氣明顯,內(nèi)容物呈黃色啫喱狀,偶見(jiàn)出血點(diǎn);缺血2 h 組,拉稀嚴(yán)重,小腸內(nèi)可見(jiàn)明顯出血,小腸腸壁變薄且全部腸段脹氣明顯,內(nèi)容物呈紅色啫喱狀。

2.3 SOD、GSH-Px 活性及MDA、GSH 含量比較

與假手術(shù)組比較,缺血30 min 組和缺血1 h 組MDA 含量升高(P<0.05)(圖1A),缺血1 h 組SOD活性顯著升高(P<0.05)(圖1B),各缺血組GSH-Px活性升高(P<0.01)(圖1C),缺血30 min 組和缺血2 h 組GSH 含量降低(P<0.05)(圖1D)。

圖1 不同組別MDA、GSH 含量及SOD、GSH-Px 活性比較Figure 1 Comparison of MDA and GSH contents and SOD and GSH-Px activities in different groups

2.4 腸組織病理學(xué)結(jié)果比較

2.4.1 組織病變

假手術(shù)組小腸黏膜層、肌層完整,黏膜上皮細(xì)胞排列整齊、未見(jiàn)變性、壞死、炎癥,部分黏膜下層見(jiàn)淋巴小結(jié),血管未見(jiàn)擴(kuò)張、出血;缺血30 min 組小腸絨毛頂端上皮下間隙增寬、毛細(xì)血管淤血,黏膜層極少量炎細(xì)胞浸潤(rùn);缺血1 h 組小腸絨毛頂端上皮下間隙增寬或絨毛頂端部分破損、毛細(xì)血管淤血,個(gè)別樣本黏膜上皮細(xì)胞壞死、潰瘍、固有層破壞、固有層及黏膜下層血管淤血、出血,黏膜層極少量至輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn);缺血2 h 組小腸黏膜上皮細(xì)胞壞死、潰瘍、固有層破壞、固有層及黏膜下層血管淤血、出血,黏膜層輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn),見(jiàn)圖2。

圖2 不同組別小腸組織病理學(xué)變化情況(HE 染色)Figure 2 Histopathological changes of intestine in different groups(HE staning)

2.4.2 絨毛高度

與假手術(shù)組比較,缺血1 h 組、缺血2 h 組小腸絨毛高度降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),見(jiàn)表3。

2.4.3 黏膜厚度

與假手術(shù)組比較,缺血1 h 組、缺血2 h 組小腸黏膜厚度減小,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)表3。

2.4.4 炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況評(píng)分

與假手術(shù)組比較,各缺血組小腸均有不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。

2.4.5 Chiu’s 評(píng)分

與假手術(shù)組比較,各缺血組小腸均有不同程度的病理學(xué)改變,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 腸組織病理學(xué)結(jié)果()Table 3 Intestinal histopathology results

表3 腸組織病理學(xué)結(jié)果()Table 3 Intestinal histopathology results

注:與假手術(shù)組相比,?P<0.05,??P<0.01。Note.Compared with the sham operation group,?P<0.05,??P<0.01.

3 討論

據(jù)報(bào)道,氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及繼發(fā)性細(xì)胞凋亡是小腸缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制[6-8]。小腸動(dòng)脈缺血情況下,氧供給下降,導(dǎo)致氧自由基大量產(chǎn)生并激活炎癥因子,引起炎細(xì)胞在病灶上聚集[9-11],因此,不同缺血時(shí)間下機(jī)體的氧化應(yīng)激水平以及小腸黏膜結(jié)構(gòu)的改變及炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度能很好反映IIRI 的情況。以此為切入點(diǎn),本研究從氧化水平和病理層面探討了IIRI 模型的建模條件。

在研究中發(fā)現(xiàn),短時(shí)間缺血情況下,氧自由基產(chǎn)物MDA 含量明顯升高,且升高幅度與缺血時(shí)間呈正相關(guān),證明機(jī)體內(nèi)已產(chǎn)生大量的自由基。MDA的急劇升高,正反饋調(diào)節(jié)抗氧化酶類SOD 和GSHPx 的產(chǎn)生,以抵抗體內(nèi)的氧化應(yīng)激壓力,使得SOD、GSH-Px 的產(chǎn)生呈現(xiàn)與MDA 相似的趨勢(shì),因此可見(jiàn)在缺血1 h 時(shí),模型動(dòng)物MDA 含量和SOD、GSH-Px活性均高于缺血30 min,且與正常動(dòng)物有顯著差異。另外,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)缺血2 h 時(shí),MDA 含量和SOD、GSH-Px 活性不升反降,結(jié)合病理結(jié)果和動(dòng)物臨床表現(xiàn),我們得知,在缺血2 h 時(shí),小腸病理?yè)p傷嚴(yán)重,上皮細(xì)胞壞死、潰瘍、固有層破壞,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,小腸絨毛高度及黏膜厚度顯著降低,且損傷程度較缺血1 h 時(shí)要嚴(yán)重,且動(dòng)物臨床狀態(tài)較差,個(gè)別動(dòng)物腸道肉眼可見(jiàn)出血,出現(xiàn)了動(dòng)物死亡的情況,正因此,機(jī)體對(duì)各項(xiàng)刺激的反應(yīng)性下降,導(dǎo)致MDA 含量和SOD、GSH-Px 活性不升反降的結(jié)果出現(xiàn)。病理結(jié)果同時(shí)顯示,缺血30 min 及1 h 均可見(jiàn)小腸組織的病理變化,且變化程度與缺血時(shí)間呈正相關(guān)性,缺血1 h 更可見(jiàn)小腸絨毛高度及黏膜厚度明顯下降,但病變程度均弱于缺血2 h 組。

綜上所述可知,缺血30 min,IIRI 模型癥狀較輕,小腸絨毛高度及黏膜厚度未見(jiàn)明顯變化;缺血2 h,動(dòng)物死亡率較高,且小腸病理?yè)p傷十分嚴(yán)重,不適用于IIRI 建模;缺血1 h,可見(jiàn)氧化指標(biāo)明顯變化,MDA 含量顯著升高,同時(shí)小腸病理變化明顯,小腸絨毛高度、黏膜厚度顯著降低,炎性細(xì)胞輕度浸潤(rùn),可見(jiàn)IIRI 模型程度適中,相對(duì)理想,因此在IIRI疾病研究時(shí),建議采用缺血1 h 再灌注4 h 的條件進(jìn)行造模。