張 怡,張彐寧,張紫微,周曉紅,高維娟

(河北中醫(yī)學院 河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點實驗室,石家莊 050091)

腦卒中(stroke)是一種由腦血管破裂或腦供血中斷引起的腦損傷,是全球第二位、我國首位致死原因[1]。其中導致腦供血中斷的缺血性腦卒中是主要的卒中類型,約占所有腦卒中的85%[2]。目前,再灌注是恢復腦缺血血液供應和保護大腦免受缺血損傷的最佳方法。但大量研究顯示,有時再灌注會對腦組織造成嚴重的繼發(fā)性損傷,即腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷[3]。細胞自噬(autophagy)是一種重要的生物學機制,可通過促進非功能蛋白和某些細胞器的更新來維持細胞穩(wěn)態(tài)[4]。細胞焦亡(pyroptosis)是一類程序性、溶解性細胞死亡方式,其激活涉及多個細胞因子和多條信號通路,其中經典焦亡途徑依賴于Caspase-1 激活后誘導的炎癥反應,以細胞腫脹、破裂,胞膜破壞并釋放促炎細胞因子為特征[5]。研究表明,細胞自噬和細胞焦亡均是腦I/R 損傷的重要機制[6-7]。雷帕霉素(rapamycin,RAPA)為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制劑,可通過抑制mTORC1 誘導自噬的發(fā)生,多應用于心腦血管疾病的治療[8]。我們前期研究證實,雷帕霉素可通過激活細胞自噬有效緩解腦I/R 損傷后細胞凋亡從而發(fā)揮神經保護作用。近幾年研究發(fā)現(xiàn),細胞自噬和細胞焦亡間同樣存在復雜串話,但自噬激活劑——雷帕霉素對腦I/R 損傷后細胞焦亡的影響鮮有報道。因此,本研究采用小鼠海馬神經元細胞系HT22 細胞進行缺氧缺糖/復氧復糖(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)處理,制備腦I/R 損傷體外模型,探討雷帕霉素對OGD/R損傷后細胞焦亡的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞

小鼠海馬神經元細胞系HT22 細胞(河北醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院許順江教授惠贈)。

1.2 主要試劑與儀器

雷帕霉素(rapamycin,RAPA),購于美國Sigma公司;DMEM 高糖、無糖培養(yǎng)基為美國Gibco 公司產品;胎牛血清購買于浙江天杭生物科技股份有限公司;NLRP3 單克隆抗體(ab270449)、IL-18 單克隆抗體(ab207323)均購買于Abcam 公司;IL-1β 多克隆抗 體(A11369) 由 Abclonal 公司提供;Cleaved Caspase-1 多克隆抗體(AF4005)購自Affinity 公司;CCK-8 試劑盒來自北京莊盟國際生物基因科技有限公司;LDH 試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

細胞培養(yǎng)箱、多功能微孔板讀數(shù)儀(Thermo);倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(Leica);電泳儀(Bio-Rad);雙色紅外激光成像系統(tǒng)(Licor)。

1.3 實驗方法

1.3.1 HT22 細胞培養(yǎng)

將HT22 細胞接種于含4 mL 完全培養(yǎng)基 (10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液+89% DMEM 高糖培養(yǎng)基)的細胞培養(yǎng)瓶中、置于37%、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.3.2 HT22 細胞缺氧缺糖/復氧復糖模型的建立

棄去完全培養(yǎng)基,采用無菌PBS 沖洗2 次后,更換為DMEM 無糖培養(yǎng)基并置于無氧環(huán)境(94% N2+5% CO2+1% O2的37℃三氣培養(yǎng)箱)中培養(yǎng)6 h,氧糖剝奪結束后,加入完全培養(yǎng)基并放回37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h[9]。雷帕霉素組于氧糖剝奪結束后給予含雷帕霉素(終濃度為250 nmol/L)的完全培養(yǎng)基,溶劑對照組給予含等體積的DMSO 的完全培養(yǎng)基。

1.3.3 CCK-8 法檢測細胞活性

將HT22 細胞接種于96 孔板中,不同實驗組均設置6 組重復,每孔加入10 μL CCK-8 溶液,反應45 min,測定OD450nm值(A)。按照(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%公式計算各組細胞活性。

1.3.4 LDH 活性檢測

參照LDH 試劑盒說明書,收集細胞上清液與LDH 試劑進行混勻,反應5 min 后于450 nm 處測定上清液中LDH 值(A)。采用1% Tritonx-100 對細胞進行破膜,將細胞破膜液與LDH 試劑進行反應,450 nm 處測定細胞破膜液LDH 值(B)。LDH 漏出率(%)=A/(A+B)×100%。

1.3.5 NLRP3 免疫熒光檢測

將固定好的細胞爬片采用1% Triton X-100 破膜;隨后加入BSA 并在室溫條件下孵育30 min;滴加配好的NLRP3 抗體(1:50),4℃避光孵育過夜;加入二抗反應完畢后,滴加DAPI 避光孵育;熒光顯微鏡拍照。

1.3.6 Western blot 檢測相關蛋白表達

收集細胞,低溫條件下對細胞進行裂解后12000 r/min,4℃離心取上清;蛋白樣品定量后進行SDS-PAGE 電泳,電轉至PVDF 膜上;5%脫脂奶室溫封閉2 h;分別加入NLRP3 抗體(1 ∶1000),Cleaved Caspase-1 抗體(1 ∶1000),IL-18 抗體(1 ∶1000)及IL-1β 抗體(1 ∶1000),4℃孵育過夜;加入二抗(1 ∶3000)室溫下孵育40 min;化學發(fā)光法對條帶進行顯影。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以平均數(shù)±標準差()表示,不同實驗組之間的比較用單因素方差分析,P<0.05 表示有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 雷帕霉素顯著改善缺氧缺糖/復氧復糖細胞損傷

正常組細胞貼壁生長,細胞形態(tài)飽滿、折光性強,胞體突觸較多且相互間連接成網狀;與正常組細胞比較,模型組及溶劑對照組細胞大量脫落,細胞密度顯著降低,細胞皺縮、變圓,突觸斷裂,胞體折光性下降;與模型組比較,雷帕霉素組細胞損傷顯著改善,見圖1。

圖1 光學顯微鏡下各組細胞形態(tài)學觀察Figure 1 Morphological observation under optical microscope in each group

2.2 雷帕霉素有效提高缺氧缺糖/復氧復糖細胞活性

與正常組比較,模型組細胞活性明顯下降(P<0.01);與模型組比較,雷帕霉素組細胞活性明顯升高(P<0.01),溶劑對照組細胞活性無差別(P>0.05),見圖2。

2.3 雷帕霉素有效降低缺氧缺糖/復氧復糖細胞LDH 漏出率

與正常組相比,模型組細胞LDH 大量漏出(P<0.01);與模型組比較,雷帕霉素組細胞LDH 漏出率明顯降低(P<0.01),溶劑對照組細胞LDH 漏出率與模型組比較無顯著差別(P>0.05),見圖3。

圖3 LDH 法檢測各組細胞LDH 漏出率(,n=6)Figure 3 LDH leakage in each group of cells was detected by LDH method

2.4 雷帕霉素有效降低缺氧缺糖/復氧復糖細胞內NLRP3 陽性表達

與正常組比較,模型組細胞中NLRP3 熒光強度顯著提高(P<0.01);與模型組比較,雷帕霉素組細胞NLRP3 熒光強度明顯降低(P<0.01),溶劑對照組細胞NLRP3 熒光強度與模型組無顯著差別(P>0.05),見圖4。

圖4 免疫熒光染色法觀察各組細胞NLRP3 陽性表達(,n=6)Figure 4 Expression of NLRP3 in each group of cells was detected by immunofluorescence staining

2.5 雷帕霉素有效降低缺氧缺糖/復氧復糖細胞內焦亡相關蛋白NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β 及IL-18 表達

與正常組比較,模型組細胞中NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β 及IL-18 蛋白表達顯著提高(P<0.01);與模型組比較,雷帕霉素組細胞中NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β 及IL-18 蛋白表達顯著降低(P<0.01),溶劑對照組與模型組比較無顯著差異(P>0.05),見圖5。

圖5 Western blot 法觀察各組細胞內NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β 及IL-18 蛋白表達(,n=6)Figure 5 Expression of NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β and IL-18 in each group of cells was detected by Western blot

3 討論

腦I/R 損傷是缺血性腦卒中的常見并發(fā)癥,是一種動態(tài)、復雜的病理生理過程[10]。其發(fā)生機制復雜,涉及氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡、細胞自噬及細胞焦亡等多個方面。大量研究發(fā)現(xiàn),腦I/R 損傷過程中,不同發(fā)病機制間彼此重疊、相互影響,在一定程度上增加了本病的治療難度,目前關于腦I/R 損傷的有效治療手段仍相對缺乏[11-12]。缺氧缺糖/復氧復糖(OGD/R)法是體外模擬腦I/R 損傷的常用方法,可有效模擬腦I/R 損傷的病理生理過程[13]。因此,本研究選用HT22 細胞為研究對象,通過OGD/R 法建立腦I/R 損傷體外模型。研究顯示,與正常組比較,模型組細胞大量脫落,細胞密度顯著降低,細胞皺縮、變圓,突觸斷裂,胞體折光性下降,細胞活性顯著降低,LDH 漏出率明顯增加、細胞膜損傷嚴重。大量研究表明,雷帕霉素具有較好的神經保護作用,可促進缺血性腦卒中后神經血管單位的修復,但其具體作用機制仍待進一步探究[14]。本研究發(fā)現(xiàn),雷帕霉素能夠有效提高OGD/R 細胞活性,降低LDH 漏出率,緩解OGD/R 造成的細胞損傷。

細胞焦亡是腦I/R 損傷的機制之一。研究表明,Caspase-1 介導的經典焦亡途徑參與了腦I/R 后神經元損傷,采用藥物或基因手段阻斷Caspase-1 表達后腦組織損傷得到顯著緩解[15]。一系列能形成炎癥小體的模式識別受體會觸發(fā)Caspase-1 的激活,其中 Nod 樣受體蛋白 3 (nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)是中樞神經系統(tǒng)中最豐富的炎性小體,可被包括三磷酸腺苷、鉀外流、線粒體DNA 和活性氧等多種因素激活,是腦I/R 損傷的主要參與者之一[16-17]。NLRP3 可通過炎性小體銜接蛋白ASC 促進炎性小體的形成和Caspase-1 的活化。Caspase-1的激活可誘導細胞膜穿孔,促進細胞溶解壞死,引發(fā)早期炎癥反應;同時活化的Caspase-1 調節(jié)促炎因子白介素IL-1β 和IL-18 的釋放,導致細胞焦亡[18]。秦靈芝等[19]研究證實,氧糖剝奪后的神經元中NLRP3 表達升高,IL-1β 和IL-18 釋放增加,神經元大量焦亡。Hong 等[20]研究發(fā)現(xiàn),抑制經典焦亡途徑可有效緩解MCAO/R 大鼠腦組織損傷。本研究發(fā)現(xiàn),對HT22 細胞進行OGD/R 處理后,細胞內NLRP3 陽性表達增多,NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白表達明顯上調,說明Caspase-1介導的經典焦亡途徑參與了OGD/R 導致的細胞損傷。

腦I/R 損傷后,大量活性氧、自由基等所引起的氧化應激等因素,也會引發(fā)自噬的發(fā)生[21]。自噬在腦I/R 損傷不同時期可發(fā)揮不同作用。我團隊前期研究證實,細胞自噬在腦I/R 損傷24 h 明顯增強,進一步提高自噬水平可有效緩解腦組織及神經細胞損傷[22]。大量研究發(fā)現(xiàn),細胞自噬和細胞焦亡間存在密切聯(lián)系,兩者相互“串話”,在減輕腦I/R 損傷中發(fā)揮重要作用[23]。腦I/R 損傷后適度自噬,pro-IL-1β、pro-IL-18、ASC 和NLRP3 等NLRP3 炎性小體組件可被自噬雙層膜識別并吞噬,然后通過自噬溶酶體途徑將這些炎性小體組件降解,從而緩解細胞焦亡,減輕腦組織損傷[24]。雷帕霉素為mTOR通路抑制劑,可與mTOR 靶向結合,阻滯信號向下傳遞,從而對自噬起促進作用[25]。大量研究證實雷帕霉素能夠通過激活神經元自噬,緩解缺血帶來的腦損傷,起到對腦組織的保護作用。本研究發(fā)現(xiàn),雷帕霉素可有效提高OGD/R 細胞活性、減少細胞LDH 漏出率、抑制細胞內 NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β 和IL-18 等焦亡相關蛋白表達,緩解OGD/R 導致的細胞損傷。

綜上所述,雷帕霉素可能通過調控Caspase-1 介導的經典焦亡途徑緩解神經細胞焦亡,實現(xiàn)對腦組織的保護作用(圖6),為雷帕霉素對腦I/R 損傷的治療提供了實驗基礎。但細胞焦亡是受多信號通路及因子調控的復雜過程,除經典焦亡途徑外,雷帕霉素是否可通過其他焦亡途徑發(fā)揮抗腦I/R 損傷的作用,仍待深入探索。腦I/R 損傷機制復雜,雷帕霉素除我們前期研究已經證實的對腦I/R 損傷后細胞自噬和凋亡具有調控作用,以及本研究發(fā)現(xiàn)的對細胞焦亡具有抑制作用外,其他相關作用以及機制有待進一步探究。

圖6 雷帕霉素抗缺氧缺糖/復氧復糖損傷的作用機制Figure 6 Mechanisms of rapamycin against oxygen and glucose deprivation/reoxygenation injury