張維彩，鄭美玲，董賢子，劉 潔，金 峰

1中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所仿生智能界面科學(xué)中心有機(jī)納米光子學(xué)實(shí)驗室，北京 100190；

2 中國科學(xué)院大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院，北京 101407

1 引言

組織工程旨在進(jìn)行組織和器官的損傷修復(fù)和重新構(gòu)建，需要成熟的細(xì)胞學(xué)理論和良好的生物材料的支撐。細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行規(guī)則有序地排列，呈現(xiàn)特殊的形貌并產(chǎn)生特定功能，是各種生物化學(xué)信號、環(huán)境的地形特征和力學(xué)性能等共同作用的結(jié)果[1]。因此，通過功能化生物材料在體外創(chuàng)造一個仿生細(xì)胞微環(huán)境，對研究細(xì)胞與環(huán)境、細(xì)胞與細(xì)胞的交互作用以及誘導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞粘附、增殖、遷移和分化等生物行為具有重要意義[2-3]。研究表明，圖案化表面對細(xì)胞具有接觸誘導(dǎo)效應(yīng)[4]，微米結(jié)構(gòu)可有效調(diào)控細(xì)胞的黏附形態(tài)與排列。2021 年，Agnes Szabo 等利用SU-8 圖案化基底培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)微溝槽陣列能夠引導(dǎo)細(xì)胞核生長的方向，與微柱陣列相比，細(xì)胞核表現(xiàn)出更明顯的拉伸長度[5]。而納米結(jié)構(gòu)則從分子水平影響細(xì)胞的行為和功能[6-9]。2012 年，Robinson 等利用垂直納米線電極陣列作為神經(jīng)回路的細(xì)胞內(nèi)接口的可擴(kuò)展平臺，刺激并記錄了大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的分離培養(yǎng)物中的神經(jīng)元活動，并證明該平臺可用于繪制多個單獨(dú)的突觸連接[10]。2021 年，Cheng 等制備了納米孔和納米棒，發(fā)現(xiàn)這些納米形貌可以促進(jìn)絲狀體的產(chǎn)生和長突起的延伸，隨著孔深和柱高的增加，細(xì)胞遷移速度和遷移方向產(chǎn)生相反的效果，這可被用于細(xì)胞分揀和篩選[11]。因此，利用生物友好性材料創(chuàng)建具有不同尺度、不同拓?fù)涞匦蔚捏w外細(xì)胞培養(yǎng)平臺，考察細(xì)胞-材料，細(xì)胞-環(huán)境相互作用機(jī)制，對組織工程領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義。

水凝膠材料由于成分類似于細(xì)胞外基質(zhì)，具有良好的生物相容性、無毒性和可降解性等優(yōu)點(diǎn)，是組織工程、醫(yī)用傷口敷料、藥物輸送等領(lǐng)域常用的生物功能材料[12-15]。利用水凝膠材料制備不同尺寸和拓?fù)湫蚊驳奈⒓{米結(jié)構(gòu)，可以更好地模擬和維持細(xì)胞在體內(nèi)的生長環(huán)境，是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[16-18]。近年來，隨著微納加工技術(shù)的發(fā)展，研究人員利用3D 打印[19-20]、軟印刷[21-22]、自組裝、紫外光刻[23-24]、激光光刻以及多種技術(shù)結(jié)合制備了各種圖案化表面如溝槽-脊[25-27]，微納米點(diǎn)、棒、坑[28-29]，網(wǎng)格[30-31]以及其它形貌的微島[32]，并證明了溝槽結(jié)構(gòu)可以使細(xì)胞沿著溝槽取向和排列，促進(jìn)血管生成和創(chuàng)口愈合[33]。點(diǎn)、棒、坑可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架上長突起的產(chǎn)生和延伸，改變細(xì)胞遷移速度[34]。這些微結(jié)構(gòu)對細(xì)胞增殖、遷移和分化等行為表現(xiàn)出誘導(dǎo)和調(diào)控作用，對了解生物體的內(nèi)在運(yùn)行規(guī)律和生命的本質(zhì)有著重要意義。然而，體內(nèi)細(xì)胞生活在具有復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞外基質(zhì)中，上述技術(shù)加工的微結(jié)構(gòu)由于水凝膠性質(zhì)和制造方法本身的限制，一般都尺寸較大，結(jié)構(gòu)精細(xì)度相對較低；同時，又存在圖案過于簡單、加工不靈活等缺點(diǎn)。因此，復(fù)雜程度更高、面積更大、具有任意拓?fù)湫蚊驳乃z微結(jié)構(gòu)的制備是一大難點(diǎn)。

基于數(shù)字微鏡器件(digital micromirror device，DMD)的無掩模光刻技術(shù)作為傳統(tǒng)光刻技術(shù)衍生出的一種技術(shù)，以可單獨(dú)尋址的微反射鏡組成的陣列器件與對應(yīng)存儲元件集成的芯片作為數(shù)字掩模，曝光投影過程同傳統(tǒng)光刻相似[35]，但制備的結(jié)構(gòu)精度不高。本研究團(tuán)隊在前期所發(fā)展的飛秒激光無掩模投影光刻技術(shù)中取得了重要突破，該技術(shù)以飛秒激光作為光源，利用大數(shù)值孔徑物鏡聚焦，通過多子場拼接可以實(shí)現(xiàn)大面積微結(jié)構(gòu)的制備，兼顧了加工效率和結(jié)構(gòu)精度[36-37]。

在這項工作中，我們利用自主搭建的DMD 無掩模投影光刻系統(tǒng)，以400 nm 飛秒激光作為面投影曝光光源，結(jié)合多子場拼接，制備了大面積、不同尺寸的空心水凝膠多邊形和多角星微結(jié)構(gòu)，用以研究復(fù)雜地形特征對細(xì)胞生長的影響規(guī)律。實(shí)驗中，本實(shí)驗室自主配制的生物相容性水凝膠前驅(qū)體可以直接利用該技術(shù)進(jìn)行圖案化曝光。曝光圖形由計算機(jī)控制，預(yù)先設(shè)計好尺寸和形貌，制造過程簡單、快速。帶有微結(jié)構(gòu)的基底與成纖維細(xì)胞L929 共培養(yǎng)實(shí)驗證明，空腔尺寸大的微結(jié)構(gòu)由于細(xì)胞活動空間大，細(xì)胞行為基本同二維平面上一致，僅靠近微結(jié)構(gòu)邊緣的細(xì)胞的骨架會產(chǎn)生形變和交互。而空腔尺寸小的微結(jié)構(gòu)則對細(xì)胞具有明顯的限位作用，細(xì)胞兩端拉長度明顯降低，同時方度增加。特別的是，我們觀察到小尺寸三角形和三角星微結(jié)構(gòu)上的細(xì)胞骨架表現(xiàn)出適應(yīng)基底圖案的分布，細(xì)胞核落入中心凹陷里，細(xì)胞形貌最終鋪滿整個微結(jié)構(gòu)表面，形貌保持同微結(jié)構(gòu)一致。該研究為制備水凝膠基底拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)研究細(xì)胞行為提供了新思路，在組織工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 理論推導(dǎo)

2.1 實(shí)驗試劑及儀器

本實(shí)驗中所用的試劑包括：聚合單體PEGDA(Mn=700)、光敏引發(fā)劑2-芐基-2-二甲基氨基-1-(4-嗎啉苯基)丁酮和苯偶酰(Sigma Aldrich Reagent Company，美國)；交聯(lián)劑PE-3A(LOT.No.0072994，KYOEISHA，日本)；DMEM 培養(yǎng)基(GE Healthcare Life Sciences，美國)；青霉素-鏈霉素和DAPI 探針(北京陽光生物科技有限公司生產(chǎn))；胎牛血清(TransGen Biotech，澳大利亞) ；肌動蛋白探針ActinRed 555(ThermoFisher，美國)；NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4(Amresco 公司，美國)；無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；超純水來自Millipore Milli-Q 超純水機(jī)(MQ 水電阻率＞18 MΩ·cm，法國)。實(shí)驗中所有試劑均未經(jīng)純化直接使用。

本實(shí)驗中所用儀器：飛秒激光器(Spectra-Physics，MAI TAIHPINSPIRE AUTO 100)；DMD 芯片(0.7’’XGA 型，德州儀器公司，美國)；無掩模光刻系統(tǒng)(本課題組自主搭建)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(MCO175，SANYO，日本)；離子濺射儀(株式會社日立制作所，日本)；掃描電子顯微鏡(SEM，HITACHI S-4800，株式會社日立制作所，日本)；激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM，Nikon，A1R MP，日本)。

2.2 無掩模投影光刻(DMD)制備大面積微圖案

在本研究中，所采用的DMD 面投影光刻系統(tǒng)以400 nm 的超快激光(MaiTai HP+Inspire AUTO100，Newport)作為光源，DMD 芯片可以根據(jù)設(shè)計的黑白圖形生成相應(yīng)的圖案化光場，白色部分反射激光，黑色部分激光無法反射。當(dāng)采用負(fù)性光刻膠曝光時，光刻膠在激光照射下發(fā)生聚合反應(yīng)，聚合部分形成微結(jié)構(gòu)；當(dāng)采用正性光刻膠時，正性光刻膠遇光分解，未分解部分形成微結(jié)構(gòu)。通過計算機(jī)可以根據(jù)需要調(diào)控DMD 生成的任意圖案化光場。此外，在DMD 投影光刻中，單次的曝光只能獲得一個子場面積的微結(jié)構(gòu)。通過三維位移臺(XMS160，GTS30V，NEWPORT)精確地控制樣品的移動，可以在下一個確定位置處簡單地重復(fù)上述投影光刻過程。這種拼接的加工方法，可以在保持精度、均勻性的同時實(shí)現(xiàn)多種圖案化微結(jié)構(gòu)的批量制備。圖1 是無掩模投影光刻制備大面積水凝膠微圖案的流程圖。

圖1 制備大面積水凝膠微圖案的流程圖Fig.1 Schematic diagram for the preparation process of large-area hydrogel micropatterns

2.3 水凝膠基光刻膠的配制及聚合流程

實(shí)驗中，聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)和交聯(lián)劑(PE-3A)重量比為2∶3，以確保結(jié)構(gòu)具有足夠的力學(xué)性能支撐細(xì)胞的生長。2-芐基-2-二甲基氨基-1-(4-嗎啉苯基)丁酮和苯偶酰按照1∶1 混合用作光引發(fā)劑。整個水凝膠前驅(qū)體中PEGDA、PE-3A 和兩種光引發(fā)劑重量比為39.2∶59.2∶0.8∶0.8 wt%。圖2 是光刻膠各組分化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖。投影曝光前，取兩滴水凝膠基光刻膠滴在玻璃片上，蓋上另一塊玻璃片，光刻膠受毛細(xì)作用鋪滿整個玻璃片間隙，間隙厚度最高可達(dá)幾十微米。曝光時，只有白色圖案部分反射激光，被激光照射過的區(qū)域水凝膠發(fā)生聚合，從而獲得設(shè)計的微結(jié)構(gòu)。曝光結(jié)束后，從一角開始慢慢揭開玻璃片，選用乙醇作顯影液，將玻璃片浸在乙醇溶液里5 min，未聚合的水凝膠基光刻膠溶解在乙醇中，聚合的部分則留在玻璃片上，得到所需微結(jié)構(gòu)圖案。

圖2 光刻膠各組分化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖。(a) 單體；(b) 交聯(lián)劑；(c) 兩種光敏引發(fā)劑Fig.2 Schematic diagram of the chemical structures of the component of photoresist.(a) Monomer;(b) Crosslinker;(c) Photoinitiators

2.4 細(xì)胞-微圖案共培養(yǎng)

培養(yǎng)前處理：帶微結(jié)構(gòu)蓋玻片裁切成合適大小，用70%的乙醇溶液沖洗3 次，PBS 緩沖液沖洗3 次，紫外線照射30 min。最后，再利用培養(yǎng)基清洗三次，干燥后放置在玻璃培養(yǎng)皿里。

細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)時，將成纖維細(xì)胞 L929 細(xì)胞(密度大約為 5 × 105細(xì)胞/cm2)接種在放有帶微圖案蓋玻片的培養(yǎng)皿(35 mm × 12 mm 型；NEST) 中，在 37 ℃、5% CO2氣氛的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

觀察前處理：去除培養(yǎng)基，PBS 緩沖液沖洗3 次，用4%的多聚甲醛覆蓋培養(yǎng)皿，固定15 min；0.1%的Triton X-100 通透5 min；ActinRed 555 室溫避光孵育30 min，進(jìn)行肌動蛋白染色；最后用DAPI 染細(xì)胞核10 min。

3 實(shí)驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

3.1 大面積結(jié)構(gòu)制備

3.1.1 大尺寸微結(jié)構(gòu)

DMD 芯片尺寸為1024 pixel×768 pixel，微圖案的設(shè)計尺寸與像素的關(guān)系根據(jù)公式：計算。其中：L表示設(shè)計尺寸，N是成像鏡頭的縮放倍數(shù)。圖3(a)～3(d)是單子場內(nèi)單圖形的大空心微結(jié)構(gòu)(相當(dāng)于2～3 倍成熟細(xì)胞尺寸)，主要包括三角形、四角星、五角星和六邊形，設(shè)計邊寬為7 μm～10 μm。本實(shí)驗中，采用的物鏡放大倍數(shù)為50 ×，數(shù)值孔徑為0.8，一個子場的實(shí)際尺寸為311.2 μm×233.4 μm。在圖形設(shè)計時，微圖案的設(shè)計尺寸不能大于一個子場的尺寸。投影光刻中，設(shè)置曝光功率為40 mW～50 mW(出光口)，曝光時間為700 ms。圖3(e)～3(h)是投影曝光得到的微圖案結(jié)構(gòu)的SEM 圖。從圖中可以看出，曝光得到的水凝膠微圖案具有良好的保真度，結(jié)構(gòu)表面平整光滑，邊緣清晰，圖3(i)～3(l) 是圖3(e)～3(h)的局部放大圖。

圖3 大尺寸微結(jié)構(gòu)SEM 圖像。(a)～(d) 大尺寸微結(jié)構(gòu)設(shè)計圖；(e)～(h) 拼接得到的大尺寸微結(jié)構(gòu)SEM 圖像；(i)～(l) 大尺寸微結(jié)構(gòu)的局部放大圖Fig.3 SEM images of large-size microstructures.(a)～(d) The designed pattern of large-size microstructures;(e)～(h) SEM images of large-size micropatterns;(i)～(l) Enlarged local details of large-size micropatterns

3.1.2 小尺寸微結(jié)構(gòu)

對于細(xì)胞來說，如果圖案化基本單元尺寸遠(yuǎn)大于細(xì)胞，圖案化基底對單個細(xì)胞的調(diào)控效應(yīng)不顯著?？紤]到這一現(xiàn)象，我們仿陷窩設(shè)計并制備了一系列小尺寸的多角形和多角星微圖案。每個子場內(nèi)包含3 ×3 個基本圖形單元，每個圖形單元尺寸接近成纖維細(xì)胞，其空心模擬陷窩設(shè)計。圖4 是在不同曝光參數(shù)下獲得的微圖案結(jié)構(gòu)的SEM 圖像。其中圖4(a)中微圖案的曝光功率為50 μW～60 μW(物鏡前)，單次曝光時間為700 ms，該條件下完成8 mm × 8 mm 面積的圖案化只需要40 min。微圖案具有完整的幾何形貌和清晰的邊緣，圖案尺寸同設(shè)計基本一致。

值得注意的是，由于圖形單元尺寸較小，DMD芯片上對應(yīng)的激光通道距離更近(單個子場內(nèi)反射激光的白色圖像部分更多，距離更近)，激光光束之間的相互作用會對圖案的成型產(chǎn)生影響。水凝膠基液態(tài)光刻膠，聚合前光刻膠體系是具有流動性的透明液體。圖形尺寸小時，距離較近的幾束激光輻照到光刻膠里面時，產(chǎn)生的自由基更多，由于光刻膠是液態(tài)，自由基更容易在內(nèi)部擴(kuò)散。不同微反射鏡芯片對應(yīng)的激光光束之間的相互作用會產(chǎn)生二次聚合，如圖4 所示，多角星的角形隨著角的數(shù)目增加而逐漸變圓，甚至在底部產(chǎn)生薄薄的黏連聚合。而在多邊形微圖案中，隨著邊數(shù)的增加，圖案形貌也趨近于圓形。同時，在四邊形和六邊形中，微圖案單元之間的黏連比較明顯。

當(dāng)增大曝光功率到120 μW～140 μW 時，延長曝光時間到1500 ms，獲得的微結(jié)構(gòu)的SEM 圖像如圖4(b)所示，只能觀察到微圖案大概的輪廓，空心部分邊緣不清晰，且聚合不均勻，微圖案分辨率和保真度都有所降低。進(jìn)一步證明了自由基擴(kuò)散和光在光刻膠中發(fā)生衍射是產(chǎn)生二次聚合的主要因素。以上研究結(jié)果表明，投影光刻的曝光劑量越大，二次聚合的影響也越大，就難以獲得符合預(yù)期分辨率的微圖案陣列，無法為細(xì)胞培養(yǎng)提供可控的地形線索，預(yù)示著在選擇液態(tài)光刻膠的最佳曝光條件時，應(yīng)該充分考慮圖案的尺寸和布局。

圖4 不同曝光條件下制備的小尺寸微結(jié)構(gòu)。(a) 激光功率50 μW～60 μW，曝光時間700 ms；(b) 激光功率120 μW～140 μW，曝光時間1500 msFig.4 Small-size microstructures prepared under different exposure conditions.(a) Laser power is 50 μW～60 μW,exposure time is 700 ms;(b) Laser power is 120 μW～140 μW,exposure time is 1500 ms

3.2 浸潤性能表征

由于基底表面微結(jié)構(gòu)帶來的地形變化對細(xì)胞的生長分布具有誘導(dǎo)作用，細(xì)胞的形貌變化與微結(jié)構(gòu)的幾何特征存在顯著的相關(guān)性。研究表明，基底的親疏水性對細(xì)胞在基底上的粘附、增殖、遷移也會產(chǎn)生影響[38]。因此，要了解圖案化表面對細(xì)胞行為的誘導(dǎo)機(jī)制，還需要考慮微結(jié)構(gòu)本身帶來的基底表面浸潤性的差異。我們分別制備了具有不同形貌的大尺寸和小尺寸空心微結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行了接觸角測試。每種微結(jié)構(gòu)面積為8 mm × 8 mm。測試時，2 μL 的水滴以0.5 μL/s 的速度滴下，每個樣品至少測五個點(diǎn)。接觸角測試結(jié)果如圖5 所示，圖5(a)～5(h) 是各基底接觸角測試的光學(xué)顯微圖像，圖5(i)是各基底接觸角的數(shù)值分析。從圖中可以看出，玻璃表面的接觸角平均值大約為72°(圖5(a))。大尺寸微結(jié)構(gòu)中四角星接觸角最小，大約61.12°，三角形基底的接觸角最大，為68.98°，均小于玻璃表面的接觸角。小尺寸多角微結(jié)構(gòu)中三角形和四角星接觸角分別為64.3°、65.12°，略小于玻璃表面，五角星最大，為71.38°。以上數(shù)據(jù)表明，這些微結(jié)構(gòu)對表面的浸潤性能會產(chǎn)生一定影響。

圖5 不同尺寸微結(jié)構(gòu)表面的(a)～(h) 接觸角顯微圖像及(i) 接觸角分析Fig.5 (a)～(h) The bright field images of contact angle and (i) contact angle analysis of microstructures with different sizes

3.3 微結(jié)構(gòu)與細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗

為了研究不同尺寸的微結(jié)構(gòu)對細(xì)胞行為的影響，將成纖維細(xì)胞L929 培養(yǎng)在上述大尺寸和部分小尺寸微圖案上48 h，觀察細(xì)胞在不同尺寸微結(jié)構(gòu)上的生長形貌和功能的變化。圖6(a)是大尺寸微結(jié)構(gòu)上L929細(xì)胞的共聚焦熒光顯微圖像，圖6(b)是對應(yīng) SEM 圖像，而圖6(c)是6(b)的局部(白框標(biāo)出)放大圖。三角形和六邊形空心面積大，對于單細(xì)胞而言，只能接觸到其中一個邊或者一個角，細(xì)胞這部分的鋪展和粘附會受到邊和角調(diào)控，但整體上還是同在平整的二維平面上生長類似。如六邊形中細(xì)胞的一端片狀粘附在邊上，部分細(xì)胞的骨架布滿整個邊(白框部分)，而在三角形中我們觀察到細(xì)胞正在翻越三角形的一邊，細(xì)胞膜被拉成薄薄的片狀，緊裹在邊上。四角星和五角星的空心面積相對較小，只允許少數(shù)幾個細(xì)胞粘附，細(xì)胞生長過程中由于空間受限，和在空間較大的多邊形內(nèi)的細(xì)胞有明顯的差異。如圖中所示五角星的空心部分有三個細(xì)胞，四角星空心部分只有一個細(xì)胞。這兩種微結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞與微結(jié)構(gòu)的邊、與其他細(xì)胞之間更容易產(chǎn)生交互作用。小空間帶來的限位效應(yīng)使得細(xì)胞的伸展度比在多邊形中小很多，進(jìn)而影響細(xì)胞行為和功能。此外，粘附在圖案外圍的細(xì)胞，則同二維平面上相差不大，這說明微圖案的尺寸在調(diào)控細(xì)胞生長中至關(guān)重要。

圖6 大尺寸微結(jié)構(gòu)細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后的熒光及SEM 圖像。(a) 共聚焦熒光顯微圖像，藍(lán)色：DAPI 染色細(xì)胞核，激發(fā)波長405 nm，收集波段410 nm～460 nm，紅色：ActinRed 555染色肌動蛋白，激發(fā)波長561 nm，收集波段570 nm～620 nm；(b) SEM 圖及(c) 細(xì)節(jié)放大的SEM 圖Fig.6 Fluorescence and SEM images of cells cultured on large-size microstructures after 48 h.(a) Confocal fluorescence images,blue:nuclei stained by DAPI,excitation wavelength is 405 nm,collected wavelength range is 410 nm～460 nm,red:actin stained ActinRed 555,excitation wavelength is 561 nm,collected wavelength range is 570 nm～620 nm;(b) SEM images and (c) magnified SEM images of local details

小尺寸微圖案對細(xì)胞形貌的影響更明顯，圖7(a)、7(b)中單個細(xì)胞的肌動蛋白完全覆蓋整個三角形和三角星，且沿著三個角延伸出去，細(xì)胞形貌和微圖案一致。而細(xì)胞核則正好嵌在三角形和三角星的中心陷窩里，如圖7(e)和7(f)所示。三角形具有較大的中心凹陷區(qū)，因此成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核可以完整落入其中，而三角星的中心凹陷區(qū)則要小于細(xì)胞核。但在重力的影響下，最終細(xì)胞核會落入凹陷處并半嵌在其中。而在四角星上，也觀察到細(xì)胞正向凹陷處遷移，細(xì)胞前端的肌動蛋白鋪滿了四角星的一角，越過凹陷向?qū)茄由?圖7(c))，細(xì)胞的尾部還沒來得及攀到上表面，但已經(jīng)脫離了玻璃基底，并收起了絲狀偽足(圖7(g))。在五角星上，同樣也觀察到了細(xì)胞正在翻越微結(jié)構(gòu)的邊緣。細(xì)胞在小尺寸的多角微結(jié)構(gòu)上的這種形貌適應(yīng)性改變和分布，為調(diào)控細(xì)胞行為提供了科學(xué)依據(jù)。

圖7 小尺寸微結(jié)構(gòu)細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后的熒光及SEM 圖像。(a)～(d) 三維的共聚焦熒光顯微圖像，藍(lán)色：DAPI 染色細(xì)胞核，激發(fā)波長405 nm，收集波段410 nm～460 nm，紅色：ActinRed 555 染色肌動蛋白，激發(fā)波長561 nm，收集波段570 nm～620 nm；(e)～(h) SEM 圖Fig.7 Fluorescence and SEM images of cells cultured on small-size microstructures after 48 h.(a)～(d) 3D confocal fluorescence images,blue:nuclei stained by DAPI,excitation wavelength is 405 nm,collected wavelength range is 410 nm～460 nm,red:actin stained ActinRed 555,excitation wavelength is 561 nm,collected wavelength range is 570 nm～620 nm;(e)～(h) SEM images

4 結(jié)論

本研究中，我們利用飛秒激光無掩模投影曝光技術(shù)，結(jié)合液態(tài)生物相容性水凝膠材料，直接在液相環(huán)境中曝光，快速制備了不同尺寸和形貌的大面積空心微結(jié)構(gòu)。細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗證明，大尺寸三邊形和六邊形微結(jié)構(gòu)空腔較大，除了同微結(jié)構(gòu)的邊框部分有交互作用外，細(xì)胞的生長同在平面上基本相同。大尺寸四角星和五角星結(jié)構(gòu)空腔相對較小，只有兩三個細(xì)胞大小，細(xì)胞在空腔內(nèi)由于限位作用，形貌會受限，拉長度降低，方度增加，這說明通過控制微結(jié)構(gòu)尺寸大小能有效調(diào)控細(xì)胞形貌。同時，在小尺寸的微結(jié)構(gòu)上，我們觀察到細(xì)胞核會落入中心凹陷，細(xì)胞骨架形貌則和微結(jié)構(gòu)形貌保持一致，細(xì)胞在這種復(fù)雜微結(jié)構(gòu)上的形貌自適應(yīng)性改變和分布，為體外細(xì)胞接觸誘導(dǎo)研究提供了一種新思路。