于智軒 高映春

膿毒癥是機體對感染的反應(yīng)失控導(dǎo)致的危及生命健康的器官功能障礙，其病程發(fā)展迅速，具有較高的死亡率[1]。肺臟是膿毒癥發(fā)生發(fā)展時容易受累的器官，嚴重時可并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征。Ⅱ型肺泡上皮細胞具有分裂增殖能力，參與受損肺泡上皮的修復(fù)，維持其完整性[2]。Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷是膿毒癥肺損傷的細胞學(xué)基礎(chǔ)，有效降低或修復(fù)Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷是治療膿毒癥的關(guān)鍵。微小RNA(miRNA)是一類參與細胞凋亡和炎性反應(yīng)等生理或病理過程的小分子非編碼RNA，在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3,4]。研究顯示，miR-483-3p在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠和高糖誘導(dǎo)的心肌細胞中表達上調(diào)，過表達miR-483-3p通過轉(zhuǎn)錄抑制胰島素生長因子1加劇心肌細胞凋亡[5]。StarBase生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，磷酸酪氨酸銜接蛋白1(APPL1)可能是miR-483-3p的靶基因。APPL1是與脂聯(lián)素受體直接結(jié)合的銜接蛋白，參與細胞增殖、介導(dǎo)胰島素信號傳遞、胞內(nèi)運輸?shù)壬磉^程。研究顯示，過表達APPL1可降低脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的心肌細胞氧化損傷和凋亡，減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細胞損傷[6]。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，可誘導(dǎo)肺泡細胞損傷。因此，本研究觀察miR-483-3p對Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的影響及其能否通過調(diào)控APPL1影響Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷，以期為膿毒癥急性肺損傷的靶向分子治療提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞，北京派瑞金生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)，美國Hycolne公司；DMEM培養(yǎng)基、LipofectamineTM 2000試劑盒、AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)和雙熒光素酶活性檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；LPS，美國Sigma公司；Trizol試劑，美國Invitrogen公司；miR-483-3p抑制劑(anti-miR-483-3p)、抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)、miR-483-3p 模擬物(mimcs)、模擬對照序列(miR-NC)、APPL1過表達載體(pcDNA-APPL1)、空載體(pcDNA)、APPL1小干擾RNA(si-APPL1)、亂序無意義陰性序列(si-NC)和PCR引物，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，日本TaKaRa公司；丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，南京建成生物工程研究所；APPL1抗體，美國Cell signaling Technology公司；B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bax)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體，美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:復(fù)蘇小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的細胞，以1×105個/孔接種于6孔板中，采用LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染anti-miR-483-3p、anti-miR-NC、miR-483-3p mimcs、miR-NC、pcDNA-APPL1、pcDNA，共轉(zhuǎn)染si-NC與anti-miR-483-3p、si-APPL1與anti-miR-483-3p。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細胞備用。

1.2.2 細胞分組處理:調(diào)整小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞濃度為2.5×104個/ml，以1.0 ml/孔接種于24孔板中。未轉(zhuǎn)染的細胞分為對照組(Con組)和LPS組。Con組細胞正常培養(yǎng)24 h，LPS組細胞用含10 μg/ml[7]LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)基24 h。轉(zhuǎn)染anti-miR-483-3p、anti-miR-NC、pcDNA-APPL1、pcDNA、si-NC與anti-miR-483-3p、si-APPL1與anti-miR-483-3p的細胞，均用含10 μg/ml LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，并分別記為LPS+anti-miR-483-3p組、LPS+anti-miR-NC組、LPS+pcDNA-APPL1組、LPS+pcDNA組、LPS+anti-miR-483-3p+si-NC組、LPS+anti-miR-483-3p+si-APPL1組。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞，進行相應(yīng)指標檢測。

1.2.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細胞中miR-483-3p和APPL1表達:Trizol試劑RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR擴增。引物序列：miR-483-3p上游5’-CCCGGGCTTGTCTTTTGTT-3’，下游5’-GAGTGGG TGGCTCACTCTTCTG-3’；APPL1上游5’-GTGCCACAGCTGAGCTGCCCG-3’，下游5’-TGCCCAGATCCTTCGCAGCC-3’；U6上游5’-TGGCCCATGCTATATGCTCC-3’，下游5’-CGGATAGGCCCTCTTGAGA-3’；GAPDH上游5’-TATGATGATATCAAGAGGG T AGT-3’，下游5’-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3’。miR-483-3p以U6為內(nèi)參，APPL1以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算miR-483-3p和APPL1 mRNA的相對表達水平。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞中MDA和SOD水平:裂解細胞，3 500 r/min離心10 min，上清液-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。分別參照MDA和SOD試劑盒說明書，硫代巴比妥酸法檢測上清中MDA含量，黃嘌呤氧化酶法檢測上清中SOD水平。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡:PBS清洗細胞2次，參照Annexin V-FITC/PI試劑盒，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 蛋白印跡(western blot)法檢測細胞中APPL1、Bcl-2和Bax蛋白表達:RIPA試劑提取總蛋白，BCA法對蛋白定量，然后行SDS-PAGE電泳，并將分離蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。置于5 %脫脂奶粉溶液中封閉1 h，分別加入APPL1(1∶1 000)、Bcl-2(1∶8 000)、Bax(1∶8 000)和GAPDH(1∶1 500)一抗，4℃孵育過夜。加入山羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。加顯影液避光顯影，曝光拍照。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-483-3p與APPL1靶向關(guān)系:PCR擴增含miR-483-3p結(jié)合位點的APPL1的3’UTR序列，克隆到p-GL3.0質(zhì)粒，構(gòu)建APPL1野生型(WT-APPL1)雙熒光光素酶報告載體。同時利用基因突技術(shù)將結(jié)合位點突變，克隆到p-GL3.0質(zhì)粒，構(gòu)建突變型(MUT-APPL1)雙熒光光素酶報告載體。將載體分別與miR-483-3p mimic、miR-NC共轉(zhuǎn)染至細胞。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細胞，檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-483-3p和APPL1在LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中的表達 與Con組比較，LPS組miR-483-3p水平升高(P<0.05)，APPL1的mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 LPS誘導(dǎo)小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后細胞中APPL1蛋白表達

表1 miR-483-3p和APPL1在LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中的表達

2.2 干擾miR-483-3p表達對LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的影響 與Con組比較，LPS組MDA含量升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)，細胞凋亡率和Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)。與LPS+anti-miR-NC組比較，LPS+anti-miR-483-3p組MDA含量降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，細胞凋亡率和Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。見圖2、3，表2。

圖2 LPS誘導(dǎo)干擾miR-483-3p表達的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后Bax和Bcl-2蛋白表達

圖3 LPS誘導(dǎo)干擾miR-483-3p表達的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后細胞凋亡流式圖

表2 干擾miR-483-3p表達對LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的影響

2.3 APPL1過表達對LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的影響 與LPS+pcDNA組比較，LPS+pcDNA-APPL1組MDA含量降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，細胞凋亡率和Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。見表3，圖4。

2.4 miR-483-3p靶向調(diào)控APPL1的表達 與共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-APPL1的miR-NC組比較，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-APPL1的miR-483-3p組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。與共轉(zhuǎn)染MUT-APPL1的miR-NC組比較，共轉(zhuǎn)染MUT-PPL1的miR-483-3p組熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。miR-483-3p組APPL1蛋白水平低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-483-3p組APPL1蛋白水平高于anti-miR-NC組(P<0.05)。見圖5、6，表4、5。

表3 APPL1過表達對LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的影響

圖4 APPL1過表達對LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡的影響;A LPS誘導(dǎo)過表達APPL1的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后APPL1、Bax和Bcl-2蛋白表達；B LPS誘導(dǎo)過表達APPL1的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后細胞凋亡流式圖

圖5 APPL1的3’UTR中含有與miR-483-3p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5 抑制APPL1表達逆轉(zhuǎn)了干擾miR-483-3p表達對LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的作用 與LPS+anti-miR-483-3p+si-NC組比較，LPS+anti-miR-483-3p+si-APPL1組MDA含量升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)，細胞凋亡率和Bax蛋白水平升高(P<0.05)，APPL1和Bcl-2的蛋白水平降低(P<0.05)。見圖7，表6。

圖6 APPL1蛋白表達

表5 miR-483-3p調(diào)控APPL1蛋白表達

圖7 抑制APPL1表達逆轉(zhuǎn)了干擾miR-483-3p表達對LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡的影響;A LPS誘導(dǎo)的干擾miR-483-3p和APPL1表達的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后APPL1、Bcl-2和Bax蛋白表達；B LPS誘導(dǎo)的干擾miR-483-3p和APPL1表達的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡流式圖

表6 抑制APPL1表達逆轉(zhuǎn)了干擾miR-483-3p表達對LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的影響

3 討論

miRNA在真核生物體中廣泛存在，研究已表明，多種miRNA參與膿毒癥的發(fā)展進程。miR-19b-3p在膿毒癥患者血清中表達降低，是敗血癥患者28 d生存的獨立預(yù)后因素，過表達miR-19b-3p減輕了膿毒癥誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，其可能是膿毒癥患者早期診斷和預(yù)后的潛在生物標志物[8]；靶向下調(diào)miR-34b-5p表達可減輕膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞炎性反應(yīng)和細胞凋亡，為膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷提供了新的分子靶點[9]；miR-150-5p在LPS誘導(dǎo)H9c2細胞建立的膿毒癥細胞中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可減輕膿毒癥細胞模型炎性反應(yīng)[10]。

作為一種miRNA，miR-483-3p在腫瘤、心血管疾病等多種疾病中發(fā)揮調(diào)控作用，是疾病治療的潛在分子靶點[11,12]。例如，miR-483-3p在急性心肌梗死(AMI)患者中表達升高，其過表達可促進心肌細胞凋亡[13]。但目前，miR-483-3p對Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的影響和機制還未知。本研究首先通過LPS誘導(dǎo)小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后發(fā)現(xiàn)，miR-483-3p在LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中表達升高，提示其可能參與Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷。

膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中，肺組織中大量中性粒細胞和巨噬細胞被激活，導(dǎo)致肺局部氧自由基增多，過量的自由基打破肺組織中氧化/抗氧化平衡，損傷肺組織[14]。MDA和SOD是氧化應(yīng)激的重要指標[15]。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其表達水平可間接反映氧化應(yīng)激水平。SOD是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除自由基，減輕自由基對細胞和組織損傷。本研究顯示，LPS誘導(dǎo)小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后，細胞中MDA含量升高，SOD活性降低，與相關(guān)報道結(jié)果[16]一致，表明LPS誘導(dǎo)小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。而干擾miR-483-3p表達后，LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中MDA含量降低，SOD活性升高，表明干擾miR-483-3p表達可有效降低LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕細胞損傷。

氧化應(yīng)激可進一步誘導(dǎo)細胞凋亡。Bcl-2和Bax是細胞凋亡過程中重要的調(diào)控蛋白，Bcl-2表達升高可抑制細胞凋亡，而Bax表達升高則促進細胞凋亡[17]。本研究顯示，LPS處理小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后，細胞凋亡率和Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低，表明LPS可加劇小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡。而干擾miR-483-3p表達可有效抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡，提示靶向干擾miR-483-3p表達可能降低膿毒癥患者肺損傷，miR-483-3p可能是膿毒癥治療的潛在分子靶點。

為了進一步探討干擾miR-483-3p表達保護LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的分子機制，本研究利用雙熒光光素酶報告基因?qū)嶒灱癢estern Blot法檢測miR-483-3p對小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中APPL1蛋白表達的影響，證實了miR-483-3p靶向負調(diào)控APPL1表達。研究顯示，過表達APPL1可降低高糖誘導(dǎo)的小鼠足細胞凋亡，降低足細胞損傷，APPL1可能成為糖尿病腎病的新治療靶點[18]；APPL1可通過調(diào)控Nrf2/HO-1途徑抑制絨毛膜滋養(yǎng)層細胞氧化應(yīng)激和凋亡[19]。但是，目前還未見APPL1影響LPS誘導(dǎo)的Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的相關(guān)報道。本研究顯示，LPS可誘導(dǎo)小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中APPL1的表達，過表達APPL1可降低LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞氧化應(yīng)激和凋亡，表明APPL1是Ⅱ型肺泡上皮細胞的因子。本研究還顯示，抑制APPL1表達逆轉(zhuǎn)了干擾miR-483-3p表達對LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞氧化應(yīng)激和凋亡的抑制作用，提示干擾miR-483-3p表達通過靶向上調(diào)APPL1表達來抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞氧化應(yīng)激和凋亡，減輕細胞損傷。

綜上所述，干擾miR-483-3p表達可抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞氧化應(yīng)激和凋亡，減輕細胞損傷，其可能通過靶向負調(diào)控APPL1表達發(fā)揮作用，miR-483-3p/APPL1可能為膿毒癥急性肺損傷的治療提供了潛在分子靶點。