宿晶 王吉磊 劉世賓
腎間質(zhì)纖維化(RIF)是糖尿病腎病(DN)最常見特征之一,其在糖尿病腎損傷早期出現(xiàn),是DN等慢性腎病發(fā)展為終末期腎病的最終共同途徑。因此,探討RIF進(jìn)展的分子機(jī)制對(duì)開發(fā)有效的DN治療策略意義重大。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)定義為一類長(zhǎng)度超過200核苷酸蛋白編碼潛能缺失的RNA轉(zhuǎn)錄本,其可在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)廣泛參與表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、凋亡等生物學(xué)過程[1]。lncRNAs的異常表達(dá)與包括DN在內(nèi)的多種疾病進(jìn)展有關(guān)[2]。生長(zhǎng)抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5(GAS5)是一種lncRNA,研究指出2型糖尿病患者外周血單核細(xì)胞中GAS5表達(dá)顯著升高[3]。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中GAS5的表達(dá)差異可能與糖尿病相關(guān)并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制有關(guān)[4]。然而GAS5在RIF中的作用和分子機(jī)制鮮有報(bào)道。miR-136是一種與多種病理過程相關(guān)的非編碼RNA,研究指出過表達(dá)miR-136顯著抑制腎癌、肺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程[5,6]。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-136是GAS5的潛在靶基因,于是推測(cè)GAS5可能通過靶向miR-136參與調(diào)控RIF進(jìn)程。因此,本研究以高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)建立RIF體外細(xì)胞模型[7],探討GAS5靶向miR-136對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎性和纖維化因子表達(dá)的影響,以期為改善RIF、延緩DN進(jìn)展提供有效靶點(diǎn)。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人腎小管上皮細(xì)胞HK-2購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);miR-136模擬物(mimics)、抑制物(anti-miR-136)以及相應(yīng)對(duì)照(miR-NC、anti-miR-NC),GAS5小干擾RNA(Si-GAS5)、過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-GAS5)以及相應(yīng)對(duì)照(Si-NC、pcDNA),熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自上海吉瑪制藥公司;PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄Master Mix購(gòu)于大連TAKARA公司;Power SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)于美國(guó)ABI公司;IL-6、TNF-α酶聯(lián)吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購(gòu)于上??道噬锕荆煌迷醇?dòng)蛋白α(α-SMA)、纖維連接蛋白(FN1)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體以及山羊抗兔IgG二抗購(gòu)于北京博奧森生物公司。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與模型構(gòu)建:HK-2細(xì)胞采用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基,在37℃、CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí),加入胰酶消化后按照1∶3比例接種新的培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代。用含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液孵育HK-2細(xì)胞24 h建立RIF體外細(xì)胞模型[7],記為高糖(HG)組。
1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)GAS5和miR-136表達(dá)水平:首先以TRIzol試劑提取HK-2細(xì)胞中總RNA,利用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄Master Mix合成互補(bǔ)DNA,再用Power SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。2-ΔΔCt法分析GAS5和miR-136表達(dá)水平。GAS5上游引物5’-CCTGTGAGGTATGGTGCTGG-3’,下游引物5’-CTGTGTGCC AATGGCTTGAG-3’;內(nèi)參GAPDH上游引物5’-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3’,下游引物5’-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3’;miR-136上游引物5’-ACUCCAUUUGUUUUGAU GAUGGA-3’,下游引物5’-UCCAUCAUCAAAACAAAUGGAGU-3’;內(nèi)參U6上游引物5’-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3’,下游引物5’-GTACAACACATTGTTTCCTCG GA-3’。
1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組:將對(duì)數(shù)期HK-2細(xì)胞鋪96孔板,利用脂質(zhì)體試劑分別將Si-NC、Si-GAS5、miR-NC、miR-136 mimics、Si-GAS5+anti-miR-NC、Si-GAS5+anti-miR-136轉(zhuǎn)染50%融合的細(xì)胞,收獲轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。用含5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液孵育HK-2細(xì)胞24 h記為正常對(duì)照(NC)組;HG組參照建模方法進(jìn)行細(xì)胞處理;用含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液孵育分別轉(zhuǎn)染Si-NC、Si-GAS5、miR-NC、miR-136 mimics、Si-GAS5+anti-miR-NC、Si-GAS5+anti-miR-136的HK-2細(xì)胞24 h,依次記為Si-NC組、Si-GAS5組、miR-NC組、miR-136組、Si-GAS5+anti-miR-NC組、Si-GAS5+anti-miR-136組。
1.2.4 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-6和TNF-α表達(dá):胰酶消化各組細(xì)胞,3 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞;用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞3次,用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液;再將帶破碎細(xì)胞在-20℃下冰凍,室溫溶解,反復(fù)3次,使細(xì)胞溶脹破碎。將標(biāo)本于4℃離心機(jī)1 500 r/min離心10 min,收集上清按照試劑盒說明書檢測(cè)IL-6和TNF-α表達(dá)量。
1.2.5 免疫印跡法檢測(cè)α-SMA和FN1蛋白表達(dá):RIPA裂解法處理HK-2細(xì)胞獲得總蛋白,蛋白定量后利用SDS-PAGE電泳分離將蛋白樣品分離開。隨后用濕轉(zhuǎn)移法將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。室溫下用5%脫脂牛奶孵育2 h后加入一抗溶液(α-SMA為1∶300,F(xiàn)N1為1∶500)4℃孵育膜過夜。然后加入山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)室溫下孵育膜2 h。最后加入顯影劑顯色后,Image J軟件分析灰度值。目的蛋白表達(dá)量為目的條帶灰度值和內(nèi)參GAPDH灰度值比值。
1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn):收集HK-2細(xì)胞接種于24孔板,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用Lipofectamine 2000試劑將miR-NC、miR-136 mimics分別與WT-GAS5或MUT-GAS5共轉(zhuǎn)染。孵育48 h后收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液洗滌后,然后使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定熒光素酶活性。同時(shí)將pcDNA、pcDNA-GAS5、Si-NC、Si-GAS5分別轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞,按照上述RT-qPCR步驟檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞中miR-136表達(dá)量。
2.1 GAS5和miR-136在高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中的表達(dá) 與NC組比較,HG組HK-2細(xì)胞中GAS5表達(dá)量顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而miR-204-5p表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。
表1 GAS5和miR-136在高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中的表達(dá)
2.2 沉默GAS5對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎性與纖維化因子表達(dá)的影響 與NC組比較,HG組HK-2細(xì)胞GAS5表達(dá)量顯著升高(P<0.05),IL-6和TNF-α表達(dá)顯著升高(P<0.05),α-SMA和FN1蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與HG+Si-NC組比較,HG+Si-GAS5組HK-2細(xì)胞GAS5表達(dá)量顯著降低(P<0.05),IL-6和TNF-α表達(dá)顯著降低(P<0.05),α-SMA和FN1蛋白表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。
表2 沉默GAS5對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎性與纖維化因子表達(dá)的影響
2.3 GAS5靶向調(diào)控miR-136的表達(dá) Starbase在線分析顯示,GAS5序列中含有miR-136特異性結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示,與轉(zhuǎn)染miR-NC比較,轉(zhuǎn)染miR-136顯著降低HK-2細(xì)胞WT-GAS5的相對(duì)熒光素酶活性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而對(duì)MUT-GAS5的相對(duì)熒光素酶活性無(wú)顯著影響。pcDNA-GAS5組HK-2細(xì)胞miR-136表達(dá)量顯著低于pcDNA組(P<0.05);Si-GAS5組HK-2細(xì)胞miR-136表達(dá)量顯著高于Si-NC,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1,表3、4。
圖1 GAS5中含有miR-136結(jié)合位點(diǎn)
表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)
表4 lncRNA GAS5調(diào)控miR-136表達(dá)
2.4 過表達(dá)miR-136對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎性與纖維化因子表達(dá)的影響 與NC組比較,HG組HK-2細(xì)胞miR-136表達(dá)量顯著降低(P<0.05),IL-6和TNF-α表達(dá)顯著升高(P<0.05),α-SMA和FN1蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與HG+miR-NC組比較,HG+miR-136組HK-2細(xì)胞miR-136表達(dá)量顯著升高(P<0.05),IL-6和TNF-α表達(dá)顯著降低(P<0.05),α-SMA和FN1蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表5,圖2。
圖2 過表達(dá)miR-136對(duì)高糖誘導(dǎo)的纖維化因子的影響
表5 過表達(dá)miR-136對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎性與纖維化因子表達(dá)的影響
2.5 干擾miR-136表達(dá)逆轉(zhuǎn)沉默GAS5對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎性與纖維化因子表達(dá)的影響 與HG+Si-GAS5+anti-miR-NC組比較,HG+Si-GAS5+anti-miR-136組HK-2細(xì)胞miR-136表達(dá)量顯著降低,IL-6和TNF-α表達(dá)顯著升高(P<0.05),α-SMA和FN1蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見圖3,表6。
圖3 干擾miR136表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞纖維化因子表達(dá)的影響
表6 干擾miR136表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎性與纖維化因子表達(dá)的影響
GAS5最初從小鼠NIH3T3細(xì)胞分離得到,其在細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)阻滯、凋亡和自噬等多個(gè)生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。近年研究證實(shí)GAS5表達(dá)失調(diào)與多種纖維化進(jìn)程有關(guān)[8]。心肌纖維化組織和活化的心肌成纖維細(xì)胞中GAS5表達(dá)降低,恢復(fù)GAS5表達(dá)水平顯著抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖,降低MMP-2、a-SMA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá),從而減輕心臟纖維化,改善心臟功能[8,9]。GAS5通過下調(diào)miR-23a表達(dá)調(diào)控信號(hào)通路抑制四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化[10]。本研究發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)后HK-2細(xì)胞中肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA、纖維化標(biāo)志蛋白FN1表達(dá)水平顯著增加,GAS5表達(dá)顯著增加,提示GAS5表達(dá)改變可能與高糖誘導(dǎo)的RIF相關(guān)。轉(zhuǎn)染Si-GAS5分析GAS5功能發(fā)現(xiàn),沉默GAS5顯著降低α-SMA和FN1蛋白表達(dá)水平,提示沉默GAS5可逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的RIF。
TGF-β1是一種極強(qiáng)的促纖維化因子,Wang等[11]指出在TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞、鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DN小鼠腎組織中GAS5表達(dá)升高,沉默GAS5表達(dá)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞纖維化,這與本研究發(fā)現(xiàn)的GAS5促纖維化作用一致。在DN中受損的腎小管上皮細(xì)胞、浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生炎性因子加劇腎臟炎性反應(yīng),介導(dǎo)腎臟纖維化[12]。本研究發(fā)現(xiàn)沉默GAS5表達(dá)顯著降低高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞IL-6和TNF-α表達(dá)水平,說明沉默GAS5可抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎性反應(yīng)。
lncRNA通過與miRNA相互作用影響miRNA活性進(jìn)而調(diào)控多種生物學(xué)過程[13]。為探討GAS5在高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥和纖維化中的可能機(jī)制,本研究通過Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析發(fā)現(xiàn)miR-136與GAS5序列存在結(jié)合位點(diǎn),并通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、RT-qPCR進(jìn)一步證實(shí)GAS5對(duì)miR-136的靶向負(fù)調(diào)控作用。目前對(duì)miR-136研究多集中在腫瘤方面,研究顯示口腔鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、黑色素瘤、乳腺癌中miR-136表達(dá)降低,miR-136低表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞EMT進(jìn)程[14-17]。
本研究發(fā)現(xiàn)高糖刺激顯著降低HK-2細(xì)胞中miR-136表達(dá)水平,提示miR-136低表達(dá)可能與高糖誘導(dǎo)的RIF和炎性反應(yīng)相關(guān)。轉(zhuǎn)染miR-136 mimics進(jìn)行功能驗(yàn)證顯示,恢復(fù)miR-136表達(dá)顯著削弱高糖刺激對(duì)HK-2細(xì)胞α-SMA、FN1、IL-6和TNF-α表達(dá)的影響,說明miR-136可抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2纖維化因子表達(dá)和炎性反應(yīng),這與Liu等[18]報(bào)道的miR-136的抗纖維化作用基本吻合。深入研究發(fā)現(xiàn),抑制miR-136表達(dá)還可逆轉(zhuǎn)沉默GAS5對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎性與纖維化因子表達(dá)的影響,這進(jìn)一步說明GAS5靶向miR-136在高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞炎性與纖維化因子表達(dá)中的的作用。
綜上所述,本研究表明沉默GAS5可抑制高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞炎性和纖維化因子表達(dá),其機(jī)制與上調(diào)miR-136表達(dá)有關(guān)。因此,GAS5/miR-136途徑是改善改善RIF、延緩DN進(jìn)展的潛在靶點(diǎn)。