高麗麗 陳會(huì)娟 王玲

隨著人們生活方式的改變，結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)病率呈迅速上升趨勢(shì)，是全球范圍內(nèi)第四大致命惡性腫瘤[1]。目前，臨床上對(duì)于早期CRC患者主要采用手術(shù)切除治療，但大部分CRC患者在確診時(shí)已處于晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移失去手術(shù)機(jī)會(huì)?；煛⒎暖熀桶邢蛑委煹膽?yīng)用顯著改善了CRC患者的生存現(xiàn)狀，但仍帶來(lái)嚴(yán)重的副作用和不良反應(yīng)。因此，尋找高效、安全、低毒的治療方法是CRC臨床研究的重要課題。石上柏為卷柏科卷柏屬植物深綠卷柏的全草，具有清熱解毒、抗癌、止血等功效，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于肝炎、肺炎和風(fēng)濕病等的治療[2]。多項(xiàng)研究證實(shí)，石上柏對(duì)喉癌、鼻咽癌、肝癌和卵巢癌等多種惡性腫瘤具有顯著的抗腫瘤作用，但其對(duì)結(jié)直腸癌的防治作用鮮有報(bào)道[3-6]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長(zhǎng)度200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其通過(guò)在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、染色質(zhì)修飾和基因組印記水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過(guò)程，是腫瘤治療的重要靶標(biāo)[7]。長(zhǎng)基因間非編碼RNA 02474(LINC02474)位于染色體1q41，現(xiàn)有研究顯示結(jié)直腸癌組織LINC02474表達(dá)上調(diào)，LINC02474高表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[8,9]。本研究從細(xì)胞增殖、周期分布、遷移和侵襲角度研究了石上柏在CRC中的抗腫瘤作用，并檢測(cè)LINC02474表達(dá)變化，以期為開(kāi)發(fā)石上柏用于防治CRC奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌細(xì)胞Caco-2、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗購(gòu)自武漢普諾賽生命科技公司；空載體質(zhì)粒(pcDNA)、LINC02474過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-LINC02474)購(gòu)自上海生工生物公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；Transwell小室和基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)Millipore公司；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II購(gòu)于大連寶生物科技公司；兔源上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-cadherin)多克隆抗體、兔源神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)多克隆抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 石上柏乙酸乙酯萃取物制備:參考黃茹意等[3]方法制備石上柏乙酸乙酯萃取物。取500 g干燥石上柏，粉碎后等量分裝于兩個(gè)圓底燒瓶中，按照料液比1∶8加入70%乙醇，85℃回流提取2 h，回流提取3次后，合并提取液，過(guò)濾，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮得乙醇浸膏。用200 ml水復(fù)溶乙醇浸膏，用等體積乙酸乙酯萃取3次，濃縮干燥萃取液即為石上柏乙酸乙酯萃取物。用1 ml二甲亞砜溶解100 mg石上柏乙酸乙酯萃取物，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組:Caco-2細(xì)胞采用含20%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞80%匯合時(shí)，按照1:4比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿，每隔1 d 換液1次，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將Caco-2細(xì)胞接種96孔板，細(xì)胞貼壁后用石上柏乙酸乙酯萃取物終濃度分別為0、7.5、15.0、30.0 μg/ml的DMEM培養(yǎng)基孵育細(xì)胞48 h，依次記為對(duì)照組、石上柏-低、石上柏-中、石上柏-高組。為證石上柏的抗腫瘤作用與調(diào)控LINC02474表達(dá)有關(guān)，利用Lipofectamine 2000將pcDNA、pcDNA-LINC02474分別轉(zhuǎn)染融合度為50%的Caco-2細(xì)胞，48 h后用含30.0 μg/ml石上柏乙酸乙酯萃取物的DMEM培養(yǎng)基孵育細(xì)胞48 h，依次記為石上柏-高+pcDNA組、石上柏-高+pcDNA-LINC02474。

1.2.3 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆能力:每組取2 ml單細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約為3×102)接種到6孔板中，輕輕振動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞均勻擴(kuò)散，并置于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞14～21 d。當(dāng)觀察到可見(jiàn)細(xì)胞時(shí)終止培養(yǎng)。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，10%甲醇和10%乙酸固定細(xì)胞，0.4%的結(jié)晶紫染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)周期分布:用胰酶消化各組細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min棄去培養(yǎng)基。PBS洗滌細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后收集細(xì)胞。用預(yù)冷的70%乙醇4℃固定細(xì)胞12 h，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入RnaseA室溫避光孵育細(xì)胞30 min。加入碘化丙啶染色1 h后，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲:每組取200 μl細(xì)胞懸液(細(xì)胞約為1×104，不含胎牛血清)接種涂有基質(zhì)膠的Transwell小室中；將含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基加入到24孔板下室作為誘導(dǎo)劑。將Transwell裝置至于培養(yǎng)箱中孵育24 h后，去除Transwell膜上表面的基質(zhì)膠和細(xì)胞，甲醇固定Transwell膜下表面30 min，結(jié)晶紫染色20 min。倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，以5個(gè)視野的均值表示侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移:每組取1×106個(gè)細(xì)胞接種6孔板，當(dāng)細(xì)胞80%融合時(shí)用移液槍頭尖端劃線，記為劃痕0 h，在劃痕0 h、48 h時(shí)分別測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(劃痕寬度0 h-劃痕寬度48 h)/劃痕寬度0 h×100%。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)LINC02474表達(dá):按照Trizol使用說(shuō)明書提取總RNA，利用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將500ng RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR Premix Ex Taq II說(shuō)明進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算LINC02474相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：LINC02474上游5’-CAGCATCTGCCTTT GACCACA-3’，下游5’-CCCATTTCAGGGTAGGGAAAAT-3’；GAPDH上游5’-CTGGGCTAC ACTGAGCACC-3’，下游5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’。

1.2.8 蛋白質(zhì)印記(Western blot)檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá):放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)緩沖液裂解各組細(xì)胞，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離適量蛋白樣品，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。用5%脫脂奶封閉膜2 h，加入兔源E-cadherin抗體(1∶1 000)、兔源N-cadherin抗體(1∶500)4℃下孵育12 h。用二抗(1∶1 000)室溫下孵育膜2 h。加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色試劑顯影，Image J軟件分析E-cadherin、N-cadherin相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 石上柏乙酸乙酯萃取物對(duì)Caco-2增殖的影響 與對(duì)照組比較，石上柏-低、中、高組Caco-2細(xì)胞克隆形成數(shù)、S期細(xì)胞比例顯著降低，G0-G1期細(xì)胞比例顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且石上柏-低、中、高組間克隆形成數(shù)、S期和G0～G1期細(xì)胞比例比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 石上柏乙酸乙酯萃取物對(duì)Caco-2增殖的影響

2.2 石上柏乙酸乙酯萃取物對(duì)Caco-2遷移侵襲的影響 與對(duì)照組比較，石上柏-低、中、高組Caco-2細(xì)胞侵襲數(shù)、劃痕愈合率、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且石上柏-低、中、高組間比較，侵襲細(xì)胞數(shù)、劃痕愈合率、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

表2 石上柏乙酸乙酯萃取物對(duì)Caco-2遷移侵襲的影響

圖1 石上柏乙酸乙酯萃取物對(duì)Caco-2中E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達(dá)

2.3 石上柏乙酸乙酯萃取物對(duì)Caco-2中LINC02474表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，石上柏-低、中、高組Caco-2細(xì)胞LINC02474表達(dá)顯著降低(P<0.05)，且石上柏-低、中、高組間LINC02474表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 石上柏乙酸乙酯萃取物對(duì)Caco-2中LINC02474表達(dá)的影響

2.4 LINC02474可減弱石上柏乙酸乙酯萃取物對(duì)Caco-2的增殖抑制作用 與石上柏-高+pcDNA組比較，石上柏-高+pcDNA-LINC02474組Caco-2細(xì)胞克隆形成數(shù)、S期細(xì)胞比例顯著升高，G0-G1期細(xì)胞比例顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 LINC02474可減弱石上柏乙酸乙酯萃取物對(duì)Caco-2的增殖抑制作用

2.5 LINC02474可減弱石上柏乙酸乙酯萃取物對(duì)Caco-2遷移和侵襲的抑制作用 與石上柏-高+pcDNA組比較，石上柏-高+pcDNA-LINC02474組Caco-2細(xì)胞侵襲數(shù)、劃痕愈合率、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表5，圖2。

表5 LINC02474可減弱石上柏乙酸乙酯萃取物對(duì)Caco-2的遷移、侵襲抑制作用

圖2 E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達(dá)

3 討論

石上柏參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、周期分布、遷移侵襲等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程[2]。李三華等[10]發(fā)現(xiàn)石上柏乙酸乙酯提取物對(duì)肺癌細(xì)胞A-549和肝癌細(xì)胞SMMC-7721具有顯著的抑制作用，當(dāng)藥物濃度為200 μg/ml作用48 h時(shí)，對(duì)細(xì)胞抑制率可高達(dá)90%。黃茹意等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，石上柏乙酸乙酯提取物可抑制喉癌Hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，誘導(dǎo)G1期周期阻滯。此外，石上柏石油醚和乙酸乙酯提取物還可有效降低卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3的侵襲能力[6]。本研究采用低、中、高劑量濃度探討石上柏在CRC中的抗腫瘤作用，結(jié)果顯示，石上柏乙酸乙酯提取物作用后Caco-2細(xì)胞的克隆形成能力、S期細(xì)胞比例可顯著降低，G0-G1期細(xì)胞比例顯著升高，并呈劑量依賴效應(yīng)。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多階段的過(guò)程，與癌細(xì)胞和與之生長(zhǎng)的內(nèi)部環(huán)境有關(guān)。E-cadherin是維持典型上皮細(xì)胞胞間連接結(jié)構(gòu)的Ca2+依賴性粘附分子，E-cadherin表達(dá)缺失、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)增加導(dǎo)致細(xì)胞骨架重塑和形態(tài)發(fā)生改變，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[11,12]。E-cadherin低表達(dá)和N-cadherin高表達(dá)與CRC局部浸潤(rùn)深度、腫瘤分期、腫瘤分化程度和和較差的生存率密切相關(guān)[13,14]。本研究發(fā)現(xiàn)，石上柏乙酸乙酯提取物呈劑量依賴效應(yīng)降低侵襲細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率，降低E-cadherin蛋白表達(dá)，提高N-cadherin蛋白表達(dá)水平。以上研究結(jié)果提示，石上柏乙酸乙酯提取物可降低CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

近年來(lái)，多項(xiàng)研究證實(shí)lncRNA廣泛參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控[15-17]。Wang等[15]研究證實(shí)lncRNA小核仁RNA宿主基因6(SNHG6)通過(guò)靶向上游移碼突變體(UPF1)激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)/Smad信號(hào)通路促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)lncRNA CPS1內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本1(CPS1-IT1)顯著降低CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并加速細(xì)胞凋亡。此外，銀杏葉提取物通過(guò)上調(diào)lincRNA-p21表達(dá)還可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移[17]。最近發(fā)現(xiàn)LINC02474在結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)，LINC02474表達(dá)水平對(duì)結(jié)腸癌患者預(yù)后具有預(yù)測(cè)價(jià)值[9]。

本研究中石上柏乙酸乙酯提取物處理后Caco-2細(xì)胞中LINC02474表達(dá)呈劑量依賴性降低，提示石上柏乙酸乙酯提取物抗腫瘤作用可能與調(diào)控LINC02474表達(dá)有關(guān)。通過(guò)轉(zhuǎn)染pcDNA-LINC02474發(fā)現(xiàn)上調(diào)LINC02474表達(dá)可降低石上柏乙酸乙酯提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞克隆形成、周期分布、遷移和侵襲的影響，恢復(fù)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，這進(jìn)一步表明石上柏乙酸乙酯提取物在CRC中抗腫瘤作用可能與下調(diào)LINC02474表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，石上柏乙酸乙酯提取物可能通過(guò)下調(diào)LINC02474抑制CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，這可能是石上柏在CRC中發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制，為石上柏開(kāi)發(fā)成CRC臨床治療的藥物提供了理論依據(jù)。