張榮 姚春和

胃癌是全球常見的消化道腫瘤，對其早期診斷、治療、預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和評估預(yù)后有重大意義[1]。Wnt/β-catenin信號通路的異?；罨c人類多種癌癥的發(fā)病相關(guān)，可調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移、黏附和凋亡等，β-catenin是Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子，β-catenin水平低時，Wnt通路關(guān)閉，反之，Wnt通路開啟[2]。研究發(fā)現(xiàn)胃癌轉(zhuǎn)移患者組織中Wnt1 mRNA水平明顯上調(diào)，β-catenin蛋白的水平也明顯增加，提示其與胃癌的進(jìn)展有關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在一定程度上可以防治胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。小白菊內(nèi)脂(parthenolide，PTL)是從中草藥小白菊中提取的一種倍半萜內(nèi)脂類化合物，其具有免疫調(diào)節(jié)功能，且還能抑制腫瘤細(xì)胞生長，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[5]。PTL能通過抑制PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)非小細(xì)胞性肺癌H1975細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制其侵襲和遷移[6]。PTL還能有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞及移植瘤的生長[7]。PTL還具有抑制胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡的作用[8]。但PTL對胃癌細(xì)胞侵襲遷移的影響及其作用機(jī)制還尚未可知，本實(shí)驗(yàn)旨在研究PTL是否調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路影響胃癌細(xì)胞侵襲、遷移和凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料 胃癌細(xì)胞SGC-7901、SNU-1(貨號：YS265C、YS1368C，上海雅吉生物科技有限公司)；胎牛血清(貨號：10437-028，美國Gibco公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號：R1145)、胰蛋白酶(貨號：T7409)購自美國Sigma公司；MTT試劑盒(貨號：8028，美國Sciencell公司)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(貨號：AD10-2，日本同仁研究所)；BCA試劑盒(貨號：23227，美國PIERCE公司)；RIPA蛋白裂解液(貨號：BB-3201，貝博生物技術(shù)公司)；SDS-PAGE試劑盒(貨號：PN1200-25T，金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司)；Wnt激活劑CHIR99021(貨號：S2924，美國Selleck公司)；Transwell小室(貨號：354480)、Matrigel(貨號：356234)(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組:將胃癌細(xì)胞SGC-7901、SNU-1接種于含10 %胎牛血清的滅菌的RPMI-1640培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞SGC-7901、SNU-1，將其用不同濃度的小白菊內(nèi)酯(0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L)處理SGC-7901、SNU-1細(xì)胞，記為對照組、10 μmol/L組、20 μmol/L組、40 μmol/L組、60 μmol/L組；用20 μmoL/L的小白菊內(nèi)酯作用于SGC-7901、SNU-1細(xì)胞培養(yǎng)12 h后再加入5 μmol/L的CHIR99021培養(yǎng)6 h，記為CHIR99021+PTL組。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞增殖:收集以上各組培養(yǎng)12 h、24 h、48 h的細(xì)胞，按試劑盒說明操作，酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度(A)值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=1-(A實(shí)驗(yàn)組值/A空白對照組值)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:收集以上各組細(xì)胞，按試劑盒說明書操作，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá):提取總蛋白，BCA試劑盒定量；然后分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉；然后加入一抗和二抗孵育，最后在暗室中曝光顯影，定影，檢測蛋白條帶吸光度，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲:收集以上各組細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell小室上室接種細(xì)胞懸液，下室中添加細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，PBS洗滌細(xì)胞，加入4%多聚甲醛固定，再用結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：用Matrigel覆蓋Transwell小室的上室，其余按照細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)步驟操作。

2 結(jié)果

2.1 PTL對SGC-7901、SNU-1細(xì)胞的增殖抑制作用 不同濃度小白菊內(nèi)酯后胃癌細(xì)胞SGC-7901、SNU-1的增殖抑制率均顯著高于對照組(P<0.05)。可見，小白菊內(nèi)酯抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901、SNU-1的增殖。見表1。

表1 MTT法檢測不同濃度PTL對SGC-7901、SNU-1細(xì)胞增殖的影響

2.2 PTL對SGC-7901、SNU-1細(xì)胞凋亡的影響 與對照組相比，不同濃度PTL組胃癌細(xì)胞SGC-7901、SNU-1的凋亡率升高(P<0.05)，胃癌細(xì)胞SGC-7901、SNU-1中Bax表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低(P<0.05)。可見，小白菊內(nèi)酯促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC-7901、SNU-1凋亡。見表2。

表2 不同濃度PTL對SGC-7901、SNU-1細(xì)胞凋亡影響

2.3 PTL對SGC-7901、SNU-1細(xì)胞侵襲和遷移的影響 與對照組相比，不同濃度PTL組胃癌細(xì)胞SGC-7901、SNU-1中Vimentin的表達(dá)水平降低(P<0.05)，snail的表達(dá)水平降低(P<0.05)，E-cadherin的表達(dá)水平升高(P<0.05)，細(xì)胞SGC-7901、SNU-1遷移和侵襲數(shù)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。小白菊內(nèi)酯抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901、SNU-1的遷移和侵襲。見表3，圖1。

表3 不同濃度PTL對SGC-7901、SNU-1細(xì)胞侵襲和遷移的影響

圖1 Transwell assay 檢測不同濃度PTL對SGC-7901、SNU-1細(xì)胞侵襲和遷移的影響(結(jié)晶紫染色×200)

2.4 PTL處理SGC-7901、SNU-1 細(xì)胞，wnt-1、β-catenin 蛋白表達(dá)情況研究 與對照組相比，不同濃度PTL處理組胃癌細(xì)胞SGC-7901、SNU-1中wnt-1、β-catenin的表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表4。

表4 不同濃度PTL處理SGC-7901、SNU-1細(xì)胞，wnt-1、β-catenin 蛋白表達(dá)情況

2.5 PTL和Wnt激活劑(CHIR99021)+PTL對SGC-7901、SNU-1細(xì)胞凋亡、侵襲、遷移的影響 與PTL組相比，CHIR99021+PTL組胃癌細(xì)胞SGC-7901、SNU-1中wnt-1、β-catenin、Bcl-2、Vimentin、snail的表達(dá)水平顯著升高，Bax、E-cadherin的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，胃癌細(xì)胞SGC-7901、SNU-1的凋亡率顯著降低(P<0.05)，胃癌細(xì)胞SGC-7901、SNU-1遷移和侵襲數(shù)量顯著升高(P<0.05)。見表5～7，圖2。

表5 PTL和Wnt激活劑(CHIR99021)+PTL對SGC-7901、SNU-1細(xì)胞凋亡、侵襲、遷移的影響

表6 Western blot檢測SGC-7901細(xì)胞中wnt-1、β-catenin 、Bax、Bcl-2、E-cadherin、Vimentin、snail的蛋白表達(dá)

表7 Western blot檢測SNU-1 細(xì)胞中wnt-1、β-catenin 、Bax、Bcl-2、E-cadherin、Vimentin、snail的蛋白表達(dá)

圖2 用Transwell assay 檢測不同濃度PTL對SGC-7901、SNU-1細(xì)胞侵襲和遷移的影響(結(jié)晶紫染色×200)

3 討論

胃癌的發(fā)病率及死亡率近年來不斷上升，目前主要采用以手術(shù)為主的綜合治療，但轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高，而在不同階段中醫(yī)藥可以發(fā)揮預(yù)防癌前病變、促進(jìn)術(shù)后康復(fù)、減輕放化療毒性，提高生活晚期患者質(zhì)量，延長生存期等作用[9]。PTL是一種天然產(chǎn)物，對腫瘤細(xì)胞有較好的殺傷作用，PTL不僅能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并抑制SW620細(xì)胞的遷移和侵襲[10]。PTL還能夠抑制宮頸癌Hela細(xì)胞株生長與遷移能力[11]。PTL通過下調(diào)GSK3β磷酸化抑制SNAIL蛋白入核，從而促進(jìn)了E-cadherin蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移、侵襲[12]。PTL降低了乳腺癌細(xì)胞分泌的MMP-9，VEGF和IL-8的水平，抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，遷移[13]。以上研究表明PTL具有抑制多種癌癥進(jìn)展的作用。為研究PTL是否對胃癌具有抑癌作用，本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的PTL處理SGC-7901、SNU-1細(xì)胞，結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖抑制率升高，凋亡率升高，胃癌細(xì)胞SGC-7901、SNU-1中Bax表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)降低；表明PTL可抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901、SNU-1增殖、遷移、侵襲，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，上皮性E-鈣粘蛋白(E-cadherin)是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)的蛋白，不僅可調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的粘附性，還可以調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá)影響胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移[14]。波形蛋白(Vimentin)是EMT相關(guān)的骨架蛋白，其高表達(dá)時腫瘤的遷移侵襲能力強(qiáng)[15]。Snail是一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，可以通過抑制E-cadherin影響EMT，抑制其表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞體外遷移和侵襲能力[16]。以上研究表明EMT過程與癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，PTL處理的胃癌細(xì)胞SGC-7901、SNU-1中Vimentin、snail蛋白下調(diào)表達(dá)，而E-cadherin上調(diào)表達(dá)表達(dá)；表明PTL可抑制胃癌細(xì)胞的EMT過程，推測PTL對胃癌細(xì)胞SGC-7901、SNU-1遷移、侵襲的抑制作用可能與抑制EMT過程有關(guān)。

Wnt信號傳導(dǎo)通路同腫瘤轉(zhuǎn)移早期的EMT現(xiàn)象密切相關(guān)，可直接或間接影響EMT相關(guān)蛋白和EMT的誘發(fā)因素，如β-catenin可使E-cadherin保持粘附功能。研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號參與胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，是介導(dǎo)胃組織癌變的關(guān)鍵信號；靶向抑制Wnt/β-catenin能夠抑制胃癌的生長、侵襲轉(zhuǎn)移[17]。研究報道下調(diào)胃癌中的Wnt /β-catenin通路能抑制細(xì)胞侵襲和遷移[18]。漢黃芩素可抑制Wnt/β-catenin通路進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)凋亡[19]。沉默YAP通過抑制Wnt/β-catenin信號通路激活誘導(dǎo)胃癌BGC823細(xì)胞的凋亡[20]。表明抑制Wnt/β-catenin通路可抑制胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，且藥物可影響Wnt/β-catenin通路激活與否。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度PTL處理胃癌細(xì)胞后，wnt-1、β-catenin蛋白表達(dá)水平降低，表明PTL可能抑制了Wnt信號通路的激活。此外,濃度為20 μmol/L的PTL對wnt-1、β-catenin蛋白表達(dá)的抑制率接近50%，因此選用此濃度與Wnt激活劑共同作用胃癌細(xì)胞，檢測其對胃癌細(xì)胞凋亡、侵襲、遷移的影響；結(jié)果顯示，激活Wnt信號通路可以逆轉(zhuǎn)PTL對胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移抑制和凋亡促進(jìn)的作用。提示，PTL對胃癌細(xì)胞侵襲、遷移的抑制作用和Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

綜上所述，小白菊內(nèi)酯可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控Wnt /β-catenin信號通路及相關(guān)蛋白有關(guān)，將可為胃癌的治療提供新思路和新靶點(diǎn)。