藺玉珍，王偉偉，黃孔陽(yáng)，盧 武

(嵊州市甘霖鎮(zhèn)人民政府，浙江 紹興 312462；嵊州市畜牧業(yè)發(fā)展中心，浙江 紹興 312400)

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)作為水產(chǎn)品的重要來(lái)源，逐漸受到重視。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)向規(guī)模化和品種多樣化方向發(fā)展的同時(shí)，我國(guó)的主要養(yǎng)殖水產(chǎn)品的成活率仍然很低，各種治療藥物不斷涌現(xiàn)，但治療病毒性疾病的藥物卻很少?？股睾突瘜W(xué)藥物的濫用已導(dǎo)致病原菌的嚴(yán)重耐藥，并對(duì)生態(tài)環(huán)境造成巨大壓力，最重要的是，化學(xué)藥物在魚(yú)類(lèi)體內(nèi)沉積，危及消費(fèi)者的健康。因此，疫苗研制則是解決魚(yú)類(lèi)疾病問(wèn)題的有效方式。

Duf f(1942)首次應(yīng)用滅活的殺鮭產(chǎn)氣單胞菌口服免疫硬頭鱒獲得成功。其發(fā)現(xiàn)不僅提高了魚(yú)的保護(hù)率，同時(shí)抗體水平也得到提高，開(kāi)創(chuàng)了魚(yú)類(lèi)免疫的先河。1986年我國(guó)第一個(gè)人工魚(yú)用疫苗(草魚(yú)出血病細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗)的誕生，為我國(guó)翻開(kāi)了魚(yú)用疫苗的新篇章。

隨著疫苗產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，魚(yú)類(lèi)免疫逐漸產(chǎn)生了注射、浸泡和口服3種途徑。本文分別從免疫機(jī)理和提高免疫效果等方面對(duì)3種免疫途徑進(jìn)行綜述，同時(shí)對(duì)水產(chǎn)疫苗的研究前景進(jìn)行展望。

一、注射免疫

注射免疫是利用少量已知數(shù)量的抗原，使其均勻地分布在魚(yú)體中，能夠獲得較好的免疫效果，同時(shí)相對(duì)口服與浸泡兩種免疫方法能夠提高和延長(zhǎng)免疫應(yīng)答反應(yīng)(Mitchel l H，1995)。它是早期魚(yú)類(lèi)疫苗給藥途徑中最有效和直接的，但該給藥途徑也存在一定的短板，如魚(yú)體損傷大、操作難度大、設(shè)備要求高且需較多的勞動(dòng)力，對(duì)較小的魚(yú)體注射也很不方便(Evel ym T P等，1980；Amend D F等，1981；Aguis C等，1983)。

一般情況下，注射免疫是針對(duì)體重大于20克的魚(yú)而言，注射所使用的疫苗有多種，有混合疫苗、單價(jià)疫苗和多價(jià)疫苗等(Busch R A，1997)。隨著接種設(shè)備的不斷更新，注射器由以往的簡(jiǎn)單手動(dòng)注射，變成高效自動(dòng)注射，注射效率極大提升。手動(dòng)注射則需要在注射前對(duì)魚(yú)體進(jìn)行麻醉，一般情況下，1個(gè)人在1小時(shí)內(nèi)可注射1 000～1 200尾魚(yú)(El l is A，2002)，而機(jī)器自動(dòng)化注射則在1小時(shí)之內(nèi)可達(dá)到7 000～9 000尾魚(yú)，此方法對(duì)魚(yú)體的規(guī)格要求更高。相對(duì)人工注射而言，機(jī)器注射具有減小魚(yú)體應(yīng)激反應(yīng)，減低人工勞動(dòng)強(qiáng)度的同時(shí)縮短注射過(guò)程，減少魚(yú)體控制時(shí)間等優(yōu)勢(shì)，克服了注射免疫方法本身存在的一些劣勢(shì)。與傳統(tǒng)的腹腔注射方法相比，最新開(kāi)發(fā)的針對(duì)IHN病毒和VHS病毒的DNA疫苗的肌肉注射是一種有效的方法(Cor beil S等，2000)。

1.注射免疫的機(jī)理

魚(yú)類(lèi)的免疫系統(tǒng)較為簡(jiǎn)單，無(wú)哺乳動(dòng)物的骨髓和淋巴結(jié)，主要有胸腺、脾和頭腎，其中頭腎是最主要的免疫淋巴器官(Pr ess C M，1998)，其淋巴組織中包含有淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、血小板、肥大細(xì)胞以及非特異性細(xì)胞毒細(xì)胞(El l is A E，1977；Mil l er N W等，1985)。此外，Rowl ey等(1988)和Mil l er(1998)均證明淋巴細(xì)胞又分為類(lèi)似于哺乳動(dòng)物的B細(xì)胞和T細(xì)胞亞群。目前，普遍認(rèn)為注射免疫主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)免疫應(yīng)答。系統(tǒng)免疫應(yīng)答又分為非特異性免疫與特異性免疫反應(yīng)，其中非特異性免疫作為魚(yú)體廣譜抵抗水體環(huán)境中的不良因素的方式，而特異性免疫應(yīng)答作為注射疫苗免疫的基礎(chǔ)，對(duì)抗原要求具有特異性。其原理為：當(dāng)魚(yú)類(lèi)免疫系統(tǒng)受到特定抗原刺激時(shí)，相對(duì)應(yīng)的免疫細(xì)胞對(duì)抗原進(jìn)行識(shí)別和呈遞，喚起相對(duì)應(yīng)抗體的活化、增殖以及分化等反應(yīng)，最終形成大量的抗體，從而產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)(Mor r ison R N等，2002；Gr abowski L D等，2004；Sant os Y等，2005)。其具有特異性、多樣性、免疫記憶和自身調(diào)節(jié)的特點(diǎn)。而非特異性免疫則具有非特異性、反應(yīng)強(qiáng)度弱及不具有免疫記憶等特點(diǎn)(Dalmo R A等，1997)。兩者相輔相成，共同完成系統(tǒng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。例如，巨噬細(xì)胞既可以起到非特異性免疫的吞噬功能，同時(shí)也可以對(duì)抗原進(jìn)行吞噬、加工、處理及呈遞(Yano T，1996；安慶云，1998)。Ver varcke等(2005)研究發(fā)現(xiàn)利用疫苗注射的方式免疫魚(yú)體，其各部位產(chǎn)生免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱是不同的，鰓、皮膚及腸黏膜組織中免疫應(yīng)答較弱，甚至檢測(cè)不到，而其他部位則產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。

介導(dǎo)魚(yú)類(lèi)免疫系統(tǒng)的體液因子主要包括抗體的特異性免疫因子和補(bǔ)體、細(xì)胞溶素、干擾素、凝集素等非特異性免疫因子(MagnadOt t ir B等，2005)。其中，血液抗體蛋白是魚(yú)類(lèi)免疫系統(tǒng)的主要功能因子。魚(yú)類(lèi)血清中存在的免疫球蛋白引起廣泛的關(guān)注，傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為硬骨魚(yú)類(lèi)的血液中只存在類(lèi)似于哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白IgM(Jur d R D，1985)。但近年來(lái)的研究結(jié)果證實(shí)，存在有四類(lèi)Ig，分 別 是IgM(Pil st r om L，1996)、IgD(Saha N R等，2004)、IgZ/T(Danil ova N等，2005；Hansen J D等，2005)以及IgM-IgZ(Savan R等，2005)。目前，學(xué)者們對(duì)魚(yú)類(lèi)免疫系統(tǒng)有一定的研究，基本搞清楚補(bǔ)體、細(xì)胞溶素、干擾素、凝集素等魚(yú)類(lèi)非特異性免疫因子生物學(xué)活性和免疫學(xué)作用(Dal mo R A，1997)，但是一些具體免疫內(nèi)部機(jī)理仍需要進(jìn)一步的探索。

大量研究表明，魚(yú)類(lèi)腸組織中類(lèi)似于哺乳動(dòng)物M細(xì)胞的吞噬細(xì)胞主要分布在后腸中(Rombout J WH M等，1986；St r and H K等，1997)，主要作用是使魚(yú)體對(duì)有害抗原進(jìn)行捕獲、識(shí)別和加工。當(dāng)疫苗注射魚(yú)體后，顆粒狀或大分子抗原在魚(yú)體腸道內(nèi)由腸上皮層包裹處理后傳遞到固有層，通過(guò)巨噬細(xì)胞的識(shí)別、加工和呈遞，最后達(dá)到免疫的效果(Joost en P H M等，1997；Bosi G等，2005)。

2.提高注射免疫的措施

佐劑是一種非特異性的免疫增強(qiáng)劑，在改善注射免疫效果的過(guò)程中其本身沒(méi)有免疫原性，只是作為一種增強(qiáng)機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)的補(bǔ)充成分，當(dāng)佐劑和抗原同時(shí)注入魚(yú)體內(nèi)或者提前注入魚(yú)體內(nèi)時(shí)，能夠有效提升魚(yú)體對(duì)抗原因子的免疫反應(yīng)強(qiáng)度，甚至有時(shí)能改變免疫應(yīng)答類(lèi)型。現(xiàn)如今魚(yú)用疫苗聯(lián)用的佐劑有兩種類(lèi)型，分別為礦物質(zhì)乳膠為基礎(chǔ)的佐劑和油狀物質(zhì)為基礎(chǔ)的佐劑。其中現(xiàn)有的以礦物質(zhì)乳膠為基礎(chǔ)的佐劑較為常見(jiàn)且廣泛應(yīng)用在日常生產(chǎn)中，包括皂土、硫酸鋁以及氫氧化鋁乳膠等；以油狀物質(zhì)為基礎(chǔ)的佐劑常見(jiàn)的有弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)等(War d P D等，1985；Hor ne MT等，1984)。

佐劑的使用可以提高魚(yú)類(lèi)免疫保護(hù)效果，主要是由于佐劑能夠增加抗原表面積，延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)釋放的時(shí)間，與淋巴細(xì)胞的接觸更加充分，極大提升漿細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞兩者的活性(Bor ek F，1977；Wal ker P D等，1981)，促進(jìn)機(jī)體對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的敏感性(Dunier M，1984)，使循環(huán)抗體水平得到顯著提升(Maisse G等，1976；St ephen G N等，1985)。另?yè)?jù)報(bào)道，佐劑與疫苗聯(lián)用能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，尤其與滅活疫苗聯(lián)用效果更加明顯(劉振興等，2007)。Pat erson等(1974)利用殺鮭氣單胞菌對(duì)銀大麻哈魚(yú)進(jìn)行注射，同時(shí)輔以不同佐劑(氫氧化鋁佐劑和油乳佐劑)，結(jié)果表明兩者均能提升免疫效果，且無(wú)顯著性差異。

佐劑使用也并不是無(wú)弊端，在個(gè)別免疫過(guò)程中對(duì)魚(yú)體產(chǎn)生較大的影響。Midt l yng等(1996)研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)體聯(lián)用疫苗后，部分魚(yú)體注射部位發(fā)生潰瘍，對(duì)魚(yú)體產(chǎn)生較大的傷害。此外，Mut ol oki等(2004)也報(bào)道魚(yú)體聯(lián)用疫苗免疫后，造成不同程度的粘連現(xiàn)象，主要表現(xiàn)在器官之間、器官與腹腔壁之間。Aguis等(1983)認(rèn)為佐劑無(wú)效果，El l is等(1981)和War d等(1985)發(fā)現(xiàn)佐劑會(huì)降低魚(yú)的生長(zhǎng)速度，甚至得出較大的危害性結(jié)果。

二、口服免疫

目前，口服疫苗的使用方法分為兩種：涂在飼料表面和直接混入飼料，疫苗通過(guò)進(jìn)入魚(yú)體內(nèi)達(dá)到免疫保護(hù)的效果。其優(yōu)勢(shì)較為明顯，不僅使用方便，對(duì)魚(yú)體影響小，而且不受魚(yú)體大小、時(shí)間、地點(diǎn)等影響，降低了勞動(dòng)強(qiáng)度。另?yè)?jù)相關(guān)報(bào)道，口服免疫能有效提升魚(yú)體免疫力，癤瘡病疫苗、弧菌病疫苗、類(lèi)結(jié)節(jié)癥疫苗等能得到預(yù)期效果，達(dá)到免疫水平。然而口服免疫產(chǎn)生的問(wèn)題還不容忽視，主要表現(xiàn)在免疫效果不夠好，尤其是與浸泡免疫相比，會(huì)產(chǎn)生攝食量大的魚(yú)浪費(fèi)疫苗，攝食量不足的魚(yú)無(wú)法得到足量的疫苗(Quentel C等，1997)。Johnson等(1981)用滅活的弧菌疫苗通過(guò)肛門(mén)插入法免疫紅大麻哈魚(yú)，獲得了良好免疫效果。該發(fā)現(xiàn)為口服疫苗提供了不同的接種路徑。為了讓其在后腸發(fā)揮充分效果，專(zhuān)家們采取各種技術(shù)和方法，來(lái)減少消化酶和胃酸對(duì)疫苗的破壞，提升其作用時(shí)間，充分引起魚(yú)體的免疫應(yīng)答，達(dá)到更好的保護(hù)效果。

1.口服免疫的機(jī)理

魚(yú)類(lèi)雖然是低等脊椎動(dòng)物，但它仍具有較為完善的免疫系統(tǒng)，在魚(yú)的腸道中，尤其是后腸中分布著大量的淋巴細(xì)胞(Dal mo R A等，1997)。Quent el等(1997)研究表明，在魚(yú)的整個(gè)腸道中都存在淋巴細(xì)胞，主要包括巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和漿細(xì)胞3種細(xì)胞，而且真骨魚(yú)類(lèi)的頭、腎、脾、胸腺、消化道的淋巴組織、血液和淋巴是產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要器官與組織(Neal e N T，1971；Ell is A E，1977；Rij ker s G T等，1980)。Abel l i等(1997)通過(guò)單克隆抗體技術(shù)，應(yīng)用胸腺細(xì)胞在舌齒鱸的腸道中檢測(cè)到了淋巴細(xì)胞的存在。但是抗原具體是在魚(yú)體消化道的哪個(gè)部位被吸收，則眾說(shuō)紛紜。Companj en(2005)證實(shí)，魚(yú)類(lèi)抗原的攝入與加工的功能區(qū)主要在后腸，進(jìn)入后腸的抗原被巨噬細(xì)胞攝取，誘導(dǎo)魚(yú)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。同時(shí)Gr ove等(2006)也表明了大西洋比目魚(yú)的后腸、鰓等組織含有IgM細(xì)胞。而且，也有研究表明，越靠近肛門(mén)的地方，其淋巴細(xì)胞的數(shù)量越多(Abel l i L等，1997)。Daml o等(1997)卻提出了相反的觀點(diǎn)，認(rèn)為抗原是在前腸被吸收的。盡管如此，目前普遍認(rèn)為后腸是魚(yú)類(lèi)攝取抗原的主要部位(Pr ess C M等，1999)。

魚(yú)類(lèi)的腸道黏膜層可分為上皮層和固有層兩層(Pr ess C M等，1999；Four nier-bet z V等，2000)。而且粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等白細(xì)胞主要存在于腸道黏膜層的固有層中(Mc Mil l an D N等，1997)。Rombout等(1993)通過(guò)免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在魚(yú)的后腸上皮層中存在大量的Ig-細(xì)胞，而在固有層中，則主要分布的是Ig+細(xì)胞。同時(shí)，也有研究表明，在大菱鲆的腸上皮中主要分布的是Ig-細(xì)胞，而固有層卻主要含有大量的Ig+細(xì)胞(Four nier-bet z V等，2000)，也有報(bào)道稱(chēng)在中腸的上皮層分布有Ig+細(xì)胞(Scapigl iat i G等，1996)。為了研究魚(yú)類(lèi)是否存在T、B淋巴細(xì)胞，Sizemor e等(1984)從外周血細(xì)胞中分離出能與LPS作用的SmIg+細(xì)胞，當(dāng)有輔佐細(xì)胞存在時(shí)，則SmIg-可與ConA作用。也有研究者用Per ol l不連續(xù)梯度的方法對(duì)褐鱒外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行分離發(fā)現(xiàn)，分布于低密度、表面光滑并且對(duì)PHA刺激敏感的淋巴細(xì)胞可能相當(dāng)于人類(lèi)的T細(xì)胞，而相反，分布于高密度、大多表面被毛的淋巴細(xì)胞可能相當(dāng)于人類(lèi)的B細(xì)胞。隨著各種分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，Secombes等(1983)、Xia等(1993)、Par t ul a等(1999)、Scapigl iat i等(2000)研究均表明魚(yú)類(lèi)存在相當(dāng)于哺乳動(dòng)物的T、B細(xì)胞的兩類(lèi)淋巴細(xì)胞。T細(xì)胞分布在腸黏膜的上皮層中，而B(niǎo)細(xì)胞則分布在腸黏膜的固有層中來(lái)參與黏膜免疫應(yīng)答反應(yīng)。

魚(yú)類(lèi)黏膜免疫反應(yīng)是否能夠獨(dú)立地完成局部特異性的免疫應(yīng)答，針對(duì)這一問(wèn)題，有著不同的說(shuō)法。Quent el(1997)認(rèn)為魚(yú)類(lèi)口服免疫既能產(chǎn)生局部的黏膜免疫，同時(shí)也可引起全身的免疫反應(yīng)。黏膜免疫在魚(yú)類(lèi)的疾病防御中起著舉足輕重的作用。羅曉春等(2005)對(duì)斜帶石斑魚(yú)黏膜組織結(jié)構(gòu)(皮膚、鰓、眼角膜、前腸及后腸)進(jìn)行研究表明，杯狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫相關(guān)細(xì)胞存在于黏膜組織中，具有黏膜免疫獨(dú)立應(yīng)答基礎(chǔ)。Pr ess等(1999)均認(rèn)為在真骨魚(yú)類(lèi)腸道黏膜淋巴組織中有不同種免疫細(xì)胞，保障魚(yú)體各個(gè)部分能獨(dú)立完成免疫反應(yīng)。Maki等(2003)也發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)叉尾鮰血清和黏液分泌物中抗體的產(chǎn)生是不同步的。雖然口服免疫既能引起黏膜免疫反應(yīng)，也能引起系統(tǒng)免疫反應(yīng)。但是，一般認(rèn)為口服免疫以黏膜免疫為主。

雖在魚(yú)類(lèi)的免疫學(xué)方面做了大量的工作，但是目前，魚(yú)類(lèi)口服免疫轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制卻不是十分清楚。一些研究表明蛋白或者抗原由后腸上皮細(xì)胞以吞噬的方式吸收。Str and等(1997)也認(rèn)為后腸上皮細(xì)胞以?xún)?nèi)吞方式攝取大分子抗原，小分子可溶性抗原物質(zhì)可經(jīng)腸黏膜細(xì)胞間隙滲入血液中，而大分子顆?？乖瓌t先由巨噬細(xì)胞吞噬到細(xì)胞中經(jīng)過(guò)加工以后，轉(zhuǎn)運(yùn)到相關(guān)的淋巴組織或細(xì)胞中，然后運(yùn)輸?shù)窖h(huán)系統(tǒng)，最后經(jīng)血液或淋巴液轉(zhuǎn)運(yùn)至淋巴結(jié)產(chǎn)生相關(guān)的免疫應(yīng)答反應(yīng)(Schep L J等，1999)。另?yè)?jù)相關(guān)研究，許多真骨魚(yú)類(lèi)后腸的巨噬細(xì)胞也有胞飲作用。

(待 續(xù))