李洪禎 沈珊珊

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化內(nèi)科，南京 210008

【提要】 液體活檢是一類新興和熱門的無創(chuàng)腫瘤檢測技術(shù)，主要包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、循環(huán)腫瘤RNA(ctRNA)、外泌體等的檢測。除外周血以外，內(nèi)鏡技術(shù)的進步使得對胰液、門靜脈血等體液來源進行液體活檢成為可能。近年來液體活檢在胰腺癌的早期篩查、早期診斷、腫瘤分層、腫瘤復(fù)發(fā)檢測以及治療反應(yīng)預(yù)測等方面顯示出無可比擬的優(yōu)勢。本文重點討論液體活檢在胰腺癌診治中的應(yīng)用現(xiàn)狀及未來的機遇和挑戰(zhàn)。

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，5年生存率僅為10%[1]，早期診斷和個體化治療對提高胰腺癌患者生存期至關(guān)重要。液體活檢作為一種無創(chuàng)腫瘤檢測技術(shù)，通過檢測人體體液中存在的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)、循環(huán)腫瘤RNA(circulating tumor RNA, ctRNA)、外泌體等成分，在胰腺癌的早期篩查、診斷、腫瘤分層以及治療反應(yīng)監(jiān)測中具有極大的應(yīng)用前景。借助液體活檢，有望實現(xiàn)對胰腺癌進行更加精準(zhǔn)的分子診斷，從而指導(dǎo)治療決策和預(yù)后。隨著EUS、ERCP等內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展，人們更容易獲取胰液、門靜脈血等替代的體液來源用于分析；但受限于現(xiàn)有研究結(jié)果的敏感性不高、可重復(fù)性差，目前仍沒有一種有效的液體活檢手段應(yīng)用于胰腺癌的臨床診療流程。要實現(xiàn)液體活檢從科研探索到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，需要科研人員和臨床醫(yī)師對檢測手段的可行性、可重復(fù)性和成本效益等方面進行綜合評估。本文著重討論液體活檢在胰腺癌診療中的應(yīng)用。

一、液體活檢的技術(shù)手段

1.ctDNA檢測：既往對胰腺癌組織進行DNA測序明確了胰腺癌的4個驅(qū)動基因，即Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, KRAS)、p53腫瘤蛋白(tumor protein p53, TP53)、細(xì)胞周期依賴激酶抑制劑2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A, CDKN2A)和SMAD同源蛋白4(SMAD family member 4, SMAD4)，這些基因突變可在胰腺癌發(fā)生的不同階段被檢測到[2]，其中90%以上的胰腺癌患者腫瘤組織可檢出KRAS突變。人體液中包含由凋亡或者壞死的細(xì)胞釋放的游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)，其中包括來源于原發(fā)和(或)轉(zhuǎn)移病灶脫落的ctDNA，可以檢測到腫瘤特征性的突變。ctDNA的檢測技術(shù)一般可分為靶向測序技術(shù)和非靶向測序技術(shù)，前者基于微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)技術(shù)，具有更高的靈敏度和特異度，但僅能檢測特定的已知突變；后者基于二代測序技術(shù)，具有更高通量，可以檢測未知的突變、結(jié)構(gòu)變異和拷貝數(shù)變異，但靈敏度略低。ctDNA片段在循環(huán)中的半衰期很短，從16 min到數(shù)小時不等[3]，這也給ctDNA突變的檢測帶來了挑戰(zhàn)。

在胰腺癌相關(guān)的研究中，KRAS突變最常應(yīng)用于ctDNA的檢測，其靈敏度在50%～70%不等[4-5]。近年來ctDNA分析技術(shù)取得了飛速進展，通過改進ctDNA檢測方法，例如基于單鏈建庫和測序方法，較傳統(tǒng)的二代測序和ddPCR技術(shù)，可以使早期胰腺癌患者中KRAS突變的檢出率提高20%[6]。但由于體液中ctDNA豐度受多種因素的影響，以及小部分不攜帶KRAS突變胰腺癌患者的存在，這一比例很難再有所突破。筆者所在課題組最新研究發(fā)現(xiàn)，中國人群不攜帶 KRAS突變的胰腺癌患者比例更高，可達(dá)到20%左右，且早期胰腺癌患者的外周血中KRAS突變的檢出率較低(30%～68%)，使得外周血的KRAS突變檢測很難用于胰腺癌的早期篩查。

ctDNA還可以用于對胰腺癌患者治療反應(yīng)的預(yù)測。體液中ctDNA比蛋白標(biāo)志物變化更迅速，治療期間突變KRAS ctDNA水平的變化是治療反應(yīng)的早期指標(biāo)[7-8]。此外，ctDNA還可用于檢測微小殘留病灶和預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)，術(shù)后檢測到KRAS ctDNA突變的患者，腫瘤復(fù)發(fā)率更高[4]。

2.外泌體檢測：外泌體是由多種機體細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞分泌并釋放到各種體液中的一種細(xì)胞外囊泡,直徑40～100 nm，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，并攜帶細(xì)胞特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸[9]。研究發(fā)現(xiàn)，通過蛋白質(zhì)組學(xué)對血漿來源的外泌體進行分析可以識別特定的癌癥類型和腫瘤[10]。外泌體的提取有多種方法，包括超速離心法、密度梯度離心法、聚合物沉淀法、超濾法，以及特定抗體免疫親和捕獲法。外泌體的分析主要是對外泌體組成成分包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)的檢測，其優(yōu)勢在于外泌體結(jié)構(gòu)的循環(huán)穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)外泌體內(nèi)RNA類物質(zhì)如miR-10b[11]、蛋白質(zhì)類如磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican 1, GPC1)[12]等標(biāo)志物對鑒別胰腺癌具有較高的靈敏度和特異度。利用多種外泌體來源的生物標(biāo)志物的組合可以進一步提高診斷胰腺癌的靈敏度和特異度[13]。

3.CTCs檢測：CTCs是指腫瘤原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶脫落的腫瘤細(xì)胞進入循環(huán)系統(tǒng)，其在外周血有核細(xì)胞中占有量極少，每106～8個白細(xì)胞中僅含10～100個CTCs。理論上CTCs可以來源于多個腫瘤區(qū)域以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶，相較于單一位點的組織活檢，CTCs更能反映腫瘤的全貌和一致性，使得CTCs檢測在腫瘤早期診斷、殘留病灶檢出、治療反應(yīng)監(jiān)測等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。CTCs的檢測可以通過RT-PCR手段或基于抗原抗體捕獲技術(shù)，隨著技術(shù)的發(fā)展，CTCs富集手段不斷進步。目前最常應(yīng)用的CellSearch是唯一被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于檢測血液中CTCs的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，該技術(shù)利用包被上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)抗體的免疫納米顆粒捕獲CTCs[14]。

在胰腺癌領(lǐng)域，研究者發(fā)現(xiàn)約42%的患者在外周血中可以檢測到至少1個CTCs，但CTCs陽性通常預(yù)示著進展期病變和更短的生存期，因此對于早期胰腺癌患者或交界可切除的胰腺癌患者，CTCs的檢測價值可能不高[15]。在一項納入75例局部晚期胰腺癌患者的多中心研究中，僅有5%的患者可以檢測到CTCs[16]。

二、液體活檢的體液來源

作為消化器官，胰腺相關(guān)的液體活檢取材來源廣泛。由于侵入性極小，獲取方便，外周血是液體活檢來源的首選。然而，在胰腺惡性腫瘤中，盡管腫瘤物質(zhì)富集技術(shù)取得了進展，但外周血分析仍然依賴于腫瘤負(fù)荷的程度。在胰腺癌廣泛轉(zhuǎn)移之前，外周血中腫瘤來源的成分一直非常低，因此尋找可替代的含有腫瘤特異性物質(zhì)更多的體液來源是拓展液體活檢在胰腺癌中應(yīng)用的重要途經(jīng)。除常規(guī)利用的外周血、尿液和唾液外，還可以利用胰液、門靜脈血以及囊液等進行液體活檢，但這些液體的獲取具有一定的侵入性和操作難度。

1.胰液：胰液是由胰腺分泌的消化液，是胰腺癌相關(guān)的液體活檢最好的體液，理論上包含更多腫瘤細(xì)胞來源的DNA、RNA、蛋白質(zhì)和外泌體，對其檢測有可能提高這些生物標(biāo)志物的靈敏度和特異度[17]。國外報道常用的胰液獲取的方式是通過ERCP技術(shù)插入造影劑導(dǎo)管負(fù)壓抽吸胰液，同時應(yīng)用促胰液素可獲取更多的胰液，但目前促胰液素在我國尚未應(yīng)用，且考慮到ERCP術(shù)后有1%～25%的患者有胰腺炎的并發(fā)癥，因此ERCP手段收集胰液具有一定的風(fēng)險性。內(nèi)鏡下鼻胰管引流(endoscopic nasopancreatic drainage, ENPD)是另外一種在臨床上收集胰液的方法，ENPD管可以在主胰管放置3 d，這種方式可以持續(xù)引流大量胰液用于后續(xù)分析[18]。與其他液體活檢類似，胰液可以進行CTCs、ctDNA、ctRNA和外泌體分析。由于胰液中富含消化酶，因此需要關(guān)注樣本收集的時效性[19]，警惕降解的可能，收集后立刻放在深低溫冰箱儲存，并且加入蛋白酶抑制劑或RNA穩(wěn)定劑以防止待測物質(zhì)降解。

胰液中KRAS突變檢測診斷胰腺癌的靈敏度在66%～100%，診斷胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液腫瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm，IPMN)的靈敏度為60%～92%[18]。部分蛋白質(zhì)標(biāo)志物如S100鈣結(jié)合蛋白P(S100 calcium binding protein P, S100P)、黏蛋白1(mucin1, MUC1)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)、白介素8(interleukin 8, IL8)，中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)和黏蛋白5AC(mucin 5AC, MUC5AC)等在胰腺癌患者來源的胰液中的水平增加[20-21]。此外，胰液外泌體中包含的核酸和蛋白質(zhì)類物質(zhì)較為穩(wěn)定，因此分離胰液中外泌體進行檢測理論上具有更高的價值[22]。筆者所在課題組通過ENPD方式收集的胰液可以成功地提取外泌體，發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者胰液中的外泌體蛋白含量較胰腺良性腫瘤患者明顯增多。

2.門靜脈血：門靜脈血是另外一種可行的胰腺癌液體活檢的樣本來源。由于肝臟是胃腸道靜脈經(jīng)門靜脈系統(tǒng)引流血液的首個器官，臨床上大多數(shù)胃腸道惡性腫瘤(胰、膽、結(jié)腸)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移擴散最常見的部位是肝臟。由于胰腺靜脈血液首先流入肝臟，在肝臟的過濾作用后進入外周，使得更靠近胰腺的門靜脈血中富含更多的胰腺癌來源的物質(zhì)。門靜脈血的獲取主要依賴術(shù)中或者EUS引導(dǎo)下細(xì)針穿刺活檢(EUS-guided fine needle aspiration, EUS-FNA)技術(shù)，目前技術(shù)成熟，安全可靠，但操作難度相對較高。

門靜脈血在CTCs檢測中具有較大的優(yōu)勢，平均每7.5 ml血液可以獲取(118.4±36.8)個CTC，是外周血含量的100多倍[23]。在可切除或交界可切除胰腺癌患者中，門靜脈血CTCs數(shù)值略低，約83.2個/7.5 ml[24]。即便如此，多項研究發(fā)現(xiàn)門靜脈血CTCs在96%～100%的胰腺癌患者中均可以檢測到[23,25]。門靜脈血CTCs數(shù)值更高的患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的風(fēng)險更高[26]。筆者所在課題組的一項新近研究發(fā)現(xiàn)，31例胰腺癌患者有30例可以在門靜脈血中檢測到CTCs，27例在外周血中檢測到CTCs，且門靜脈血中CTCs數(shù)量較外周血明顯增加。TWIST陽性的間質(zhì)型CTCs較EpCAM陽性的上皮型CTCs與患者的腫瘤負(fù)荷和預(yù)后顯著相關(guān)[27]。Kawamura等[28]報道，胰腺癌患者門靜脈血的外泌體內(nèi)的某些miRNA如miR-4525、miR-451a和miR-21較外周血更高，可作為胰腺癌患者預(yù)后的標(biāo)志物。

三、液體活檢在胰腺癌診療中的應(yīng)用

1.胰腺癌的篩查：近期由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科牽頭的《中國胰腺癌高危人群早期篩查和監(jiān)測共識意見》[29]指出，對具有遺傳性胰腺癌家族史的高危個體，例如Peutz-Jeghers綜合征的患者[種系絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶11(serine-threonine kinase 11, STK11)基因突變攜帶者]、CDKN2A基因突變攜帶者以及陽離子胰蛋白酶原基因(cationic trypsinogen gene, PRSS1)突變的常染色體顯性遺傳性胰腺炎患者，應(yīng)進行胰腺癌早期篩查?；谕庵苎獦颖镜亩鷾y序技術(shù)對于明確是否攜帶上述基因突變至關(guān)重要，有助于篩選和富集胰腺癌高危人群，納入后續(xù)篩查流程。

2.胰腺癌的診斷：臨床上胰腺癌的診斷依賴于影像學(xué)檢查和EUS-FNA獲取組織進行腫瘤活檢，但EUS-FNA面臨假陰性的問題，有時即使重復(fù)活檢，仍然難以獲取腫瘤細(xì)胞用于診斷。液體活檢是胰腺癌診斷的重要補充手段。但目前為止，回顧大量胰腺癌液體活檢相關(guān)的研究，即便是同一種標(biāo)志物，在胰腺癌診斷中的效能在不同的研究中差異很大，結(jié)果一致性低。為了提高液體活檢在胰腺癌診斷中的檢出率，其中一種策略是將不同類型的液體活檢手段比如DNA、RNA、蛋白等結(jié)合起來，以捕獲更多腫瘤的生物學(xué)特征。一項研究中聯(lián)合兩種外泌體來源的蛋白(GPC1和CD63)在區(qū)分胰腺癌和健康人群的靈敏度和特異度可以達(dá)到99%和82%[30]。另一項納入501例患者的研究中，作者開發(fā)了一種含有8個來自血漿外泌體的長鏈非編碼RNA組合能夠識別可切除的Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌患者(AUC=0.949)[31]。

3.胰腺癌手術(shù)和復(fù)發(fā)監(jiān)測及治療應(yīng)答：胰腺癌治療決策選擇的關(guān)鍵是對可切除性的判斷，主要取決于局部血管受累程度和有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。影像學(xué)是用于評估患者能否切除的最佳手段，但部分微小轉(zhuǎn)移灶很難通過影像學(xué)發(fā)現(xiàn)[32-33]。在可切除胰腺癌患者中，約有60%的胰腺癌患者術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)，這可能提示這些患者在手術(shù)切除之前已發(fā)生微小轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)液體活檢有助于發(fā)現(xiàn)這些隱匿性轉(zhuǎn)移性病灶的潛力，從而使患者避免不必要的手術(shù)帶來的并發(fā)癥。相對于原發(fā)灶，ctDNA被證實與遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移灶突變一致性更高[33]。很多研究探究了液體活檢手段在胰腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)檢測中的價值。據(jù)報道，術(shù)前檢測到KRAS突變的可切除胰腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險更高，若術(shù)后突變KRAS ctDNA轉(zhuǎn)陰，復(fù)發(fā)風(fēng)險也相應(yīng)下降[4]。與之類似，術(shù)后CTCs陽性患者發(fā)生轉(zhuǎn)移風(fēng)險也更高[34]。此外，也有報道，一些miRNA(如miR-373-3p、miR-744、miR-415a)[35]、蛋白標(biāo)志物(如GPC1)[36]等也可用于胰腺癌復(fù)發(fā)檢測。

僅有局部病變但伴有周圍大血管浸潤的胰腺癌患者可進一步根據(jù)受累程度分為交界性可切除胰腺癌和局部晚期胰腺癌，這一類患者有可能經(jīng)過術(shù)前新輔助放化療增加根治性切除的概率。目前新輔助化療后治療反應(yīng)的檢測手段有限，主要依據(jù)影像學(xué)和CA19-9，難以準(zhǔn)確評估。研究發(fā)現(xiàn)CTCs和ctDNA可以有效預(yù)測新輔助化療患者的治療反應(yīng)和復(fù)發(fā)[37]，新輔助化療后仍檢測到ctDNA的患者提示疾病發(fā)生進展[8,38]。此外，有研究還利用液體活檢手段進行化療敏感度的驗證。在不可切除的胰腺癌患者中，通過分離CTCs細(xì)胞和構(gòu)建藥物基因組學(xué)模型預(yù)測不同化療方案的療效，可以顯著提高患者的生存期[38]。在一項納入38例接受FOLFIRINOX一線化療的晚期胰腺癌患者的研究中，ctDNA檢出的增加與患者化療耐藥和病情進展有關(guān)[39]。

四、液體活檢的多種標(biāo)志物聯(lián)合和評分系統(tǒng)

多項胰腺癌的液體活檢研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)單一的標(biāo)志物很難滿足臨床上對胰腺癌診治的要求，因此開發(fā)多種標(biāo)志物聯(lián)合的液體活檢是目前液體活檢研究的方向之一。有研究利用外周血的蛋白標(biāo)志物和ctDNA開發(fā)了一種工具“CancerSEEK”，對包含胰腺癌在內(nèi)的5種癌癥的早期診斷特異性為69%～90%[40]。另外一項研究利用包含29種蛋白的微陣列可以有效將Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌患者與健康對照組區(qū)分開來(AUC=0.96)[41]。CA19-9作為一種臨床上廣泛應(yīng)用的糖類抗原標(biāo)志物，臨床價值有限?，F(xiàn)有研究探討了CA19-9聯(lián)合血清學(xué)或胰液中其他標(biāo)志物，如代謝標(biāo)志物[42]、DNA甲基化[43]、miRNAs[13]、蛋白[21]等，可以實現(xiàn)更高的準(zhǔn)確性和靈敏度。有研究通過患者尿液中的3種蛋白標(biāo)志物建立胰腺癌風(fēng)險評分“PancRISK”，可將早期胰腺癌檢測的靈敏度和特異度提高到85%以上[44]。此外，機器學(xué)習(xí)是近年來腫瘤早期診斷的熱門研究領(lǐng)域，通過多種類型的生物學(xué)標(biāo)志物，包括CA19-9、KRAS突變聯(lián)合部分蛋白、RNA等，利用機器學(xué)習(xí)建立預(yù)測模型，準(zhǔn)確性高達(dá)92%[45]。

綜上所述，未來提高胰腺癌生存期的有效策略是更早地發(fā)現(xiàn)病變，更加精準(zhǔn)的治療決策以及動態(tài)化的腫瘤檢測。液體活檢具備實時動態(tài)檢測、克服腫瘤異質(zhì)性、提供全面檢測信息等獨特優(yōu)勢，在未來極有可能被納入胰腺癌的綜合診療過程，為達(dá)到上述目標(biāo)提供有價值的信息，實現(xiàn)更加精準(zhǔn)的“分子診斷”。遺憾的是，截至目前仍沒有一種液體活檢手段應(yīng)用于臨床。筆者認(rèn)為，如何克服當(dāng)前液體活檢手段的敏感度差、規(guī)范性和可重復(fù)性不佳、經(jīng)濟效益低等瓶頸是胰腺癌液體活檢未來研究中需考慮的重要問題，后續(xù)仍需要大樣本量的前瞻性研究，以嚴(yán)格評估液體活檢在胰腺癌診療中的價值。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突