胡丕波 劉蒙蒙 陳炯

1湖州市中心醫(yī)院普外科，湖州 313000；2湖州市中心醫(yī)院病理科，湖州 313000；3中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)普外科，合肥 230001

胰腺癌起病隱匿，進(jìn)展迅速，被確診后往往處于晚期階段[1]。手術(shù)根治性切除仍然是目前胰腺癌最優(yōu)先采用的治療方式，但只有10%～20%的患者有根治性手術(shù)的機(jī)會(huì)，且5年生存率也僅為15%～25%[2]，因此尋找胰腺癌的生物標(biāo)志物來(lái)提高其早期診斷率尤為重要。組織激肽釋放酶(kallikrein related peptidase, KLKs)屬于蛋白水解酶的絲氨酸蛋白酶家族，共有15個(gè)成員(KLK1～KLK15)，在多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中起作用，被認(rèn)為是潛在的腫瘤標(biāo)志物[3]。KLK12作為KLKs成員之一，在人體的多種腫瘤中異常表達(dá)，且與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)[4-5]，但關(guān)于其在胰腺癌中的表達(dá)及作用少有報(bào)道。本研究檢測(cè)KLKL12在胰腺癌組織及胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)，探討其作用機(jī)制及臨床意義。

材料與方法

一、臨床標(biāo)本和胰腺癌細(xì)胞株

收集2014年2月至2018年10月間中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院膽胰外科行根治性手術(shù)切除且病理確診的95例胰腺癌患者的癌組織和匹配的癌旁正常胰腺組織(距離手術(shù)切緣>3 cm)。其中男性58例，女性37例，年齡43～78(60±11)歲，≤60歲者36例，>60歲者 59 例；腫瘤位于胰頭部51例，胰體尾部44例；腫瘤高分化54例，中、低分化41例；參照第八版AJCC分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ+Ⅱ期73例，Ⅲ+Ⅳ期22例；神經(jīng)浸潤(rùn) 50 例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70例。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及免疫治療。

正常胰腺腺泡細(xì)胞株HPDE6-C7和胰腺癌細(xì)胞株SW1990、PANC1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)及傳代。

二、方法

1.KLK12蛋白表達(dá)檢測(cè)：取石蠟包埋的胰腺癌組織及相應(yīng)的癌旁組織，常規(guī)脫蠟及抗原修復(fù)后，采用EnVision 法檢測(cè)組織的KLK12蛋白表達(dá)。兔抗人KLK12一抗購(gòu)自R&D system公司，工作濃度1∶200；山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自武漢三鷹生物公司，工作濃度1∶5 000；顯色底物DAB購(gòu)自北京中杉金橋公司。采用半定量法評(píng)分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的0～10%計(jì)0分，11%～50%計(jì)2分，>50%計(jì)3分；細(xì)胞胞質(zhì)未著色計(jì)0分，呈淡黃色計(jì)1分，黃色計(jì)2分，棕黃色計(jì)3分。兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)乘積≤3分為低表達(dá)，>3分為高表達(dá)[6]。所有切片均由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師獨(dú)立評(píng)分，再共同協(xié)商一致。

分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HPDE6-C7、SW1990和PANC1細(xì)胞，離心后加細(xì)胞裂解液置冰上充分裂解，離心取上清，加上樣緩沖液，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞KLK12蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照。抗KLK12一抗購(gòu)自R&D system公司，工作濃度1∶500；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG購(gòu)自武漢三鷹生物公司，工作濃度1∶10 000。ECL(美國(guó)Thermo公司)發(fā)光，X片曝光、顯影、定影，Image J軟件掃描條帶的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示目的蛋白表達(dá)量。

2.KLK12 mRNA表達(dá)檢測(cè)：分別提取3株胰腺癌細(xì)胞總RNA，使用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo公司)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，采用熒光定量PCR法檢測(cè)KLK12 mRNA的表達(dá)。KLK12正向引物序列為5′-GCCTCAACCTCTCCATCGTC-3′，反向引物序列為5′-CTTGAAGGACTCCCCCACAC-3′。以β-actin為內(nèi)參，其正向引物序列為5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′，反向引物序列為5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。95℃ 3 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s，70℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。由PCR儀自帶軟件獲取Ct值，通過(guò)公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

3.KLK12基因表達(dá)抑制及過(guò)表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞株構(gòu)建：攜帶靶向KLK12基因的siRNA質(zhì)粒(siRNA-KLK12)及KLK12過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(KLK12-OE)由武漢淼靈生物公司制備。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胰腺癌細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染的胰腺癌細(xì)胞作為空白對(duì)照組(NC)，以轉(zhuǎn)染攜帶相應(yīng)陰性對(duì)照質(zhì)粒siRNA-NC、OE-NC的胰腺癌細(xì)胞作為陰性對(duì)照組。過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒選用pCMV-3×FLAG，LipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)自賽默飛公司，按說(shuō)明書操作。引物序列(5′-3′)：siRNA-KLK12上游為AAACAGUGACAGCCACGUATT，下游為UACGUGGCUGUCACUGUUUGG；siRNA-NC上游為UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，下游為ACGUGACAAGAATT；KLK12-OE上游為TGGCAGACAAAGAGACAAGAC，下游為GTTGAACGCTGCTGGTTACG；OE-NC上游為GCAAATGGGCGGTAGGCGTG，下游為TCGTTGGGCGGTCAGC。

4.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：收集轉(zhuǎn)染24～48 h的上述各組細(xì)胞，培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/ml，96孔板每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)到時(shí)間點(diǎn)后每孔加入10 μl CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，上酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處的吸光值(A450值)。CCK8試劑盒購(gòu)自上海貝博公司，按說(shuō)明書操作。

5.細(xì)胞侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)：分別收集并重懸轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞(5×105/ml))。Transwell小室上層加入200 μl細(xì)胞懸液，下層加入培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)48 h，取出小室隔膜，用棉棒輕輕擦去隔膜上表面未穿膜細(xì)胞，甲醛固定隔膜20 min，結(jié)晶紫染色15 min，清洗后烘干，置顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值。隔膜鋪基質(zhì)膠的小室做侵襲實(shí)驗(yàn)，隔膜未鋪基質(zhì)膠的小室做遷移實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌組織KLK12蛋白陽(yáng)性表達(dá)率及其與臨床病理特征的關(guān)系

KLK12蛋白主要定位于胞質(zhì)，呈現(xiàn)棕黃色顆粒。95例胰腺癌組織中67例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為70.5%；匹配的癌旁組織中28例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為29.5%，胰腺癌組織KLK12陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.01，P<0.001)。

胰腺癌組織KLK12的蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度低(P=0.007)、TNM分期晚(P=0.001)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.018)呈顯著相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤位置、神經(jīng)浸潤(rùn)等無(wú)相關(guān)性(表1)。

表1 胰腺癌組織KLK12表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性(例)

二、HPDE6-C7、SW1990、PANC1細(xì)胞KLKL12蛋白及mRNA表達(dá)量

HPDE6-C7、SW1990及PANC1細(xì)胞KLK12蛋白表達(dá)量分別為0.21±0.01、0.34±0.01、0.28±0.01(圖1)，KLKL12 mRNA表達(dá)量分別為1.41±0.20、3.31±0.10、2.91±0.09，SW1990及PANC1細(xì)胞的表達(dá)量均顯著高于HPDE6-C7細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)只采用SW1990、PANC1細(xì)胞。

圖1 HPDE6-C7(1)、SW1990(2)、PANC1(3)細(xì)胞的KLKL12蛋白表達(dá)

三、轉(zhuǎn)染后SW1990、PANC1細(xì)胞KLKL12蛋白表達(dá)量的變化

SW1990細(xì)胞的NC組、siRNA-NC組、siRNA-KLK12組KLK12蛋白的表達(dá)量分別為1.00±0.02、0.98±0.04、0.51±0.04，PANC1細(xì)胞3組KLK12蛋白表達(dá)量分別為0.65±0.03、0.62±0.04、0.38±0.03。siRNA-KLK12組細(xì)胞KLK12蛋白表達(dá)量均顯著低于NC組和siRNA-NC組(P值均<0.05，圖2)，表明抑制KLK12表達(dá)的細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖2 SW1990(2A)、PANC1(2B)的空白對(duì)照組(1)、siRNA-NC組(2)、siRNA-KLK12組(3)細(xì)胞的KLK12蛋白表達(dá) 圖3 SW1990(3A)、PANC1(3B)的空白對(duì)照組(1)、OE-NC組(2)、KLK12-OE組(3)細(xì)胞的KLK12蛋白表達(dá)

SW1990細(xì)胞的NC組、OE-NC組、KLK12-OE組KLK12蛋白表達(dá)量分別為0.81±0.01、0.84±0.02、1.08±0.02，PANC1細(xì)胞3組KLK12蛋白表達(dá)量分別為0.75±0.02、0.81±0.02、1.11±0.03，KLK12-OE組細(xì)胞KLK12蛋白表達(dá)量均顯著高于NC組和OE-NC組(P值均<0.05，圖3)，表明KLK12過(guò)表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功。

四、轉(zhuǎn)染后SW1990、PANC1細(xì)胞增殖能力的變化

培養(yǎng)72 h，SW1990、PANC1細(xì)胞的siRNA-KLK12組A450值分別為0.94±0.02、0.96±0.03，NC組分別為1.12±0.03、1.15±0.03，siRNA-NC組分別為1.16±0.05、1.21±0.03，siRNA-KLK12組A450值均小于NC組和siRNA-NC組(P值均<0.05，圖4)，表明抑制KLK12表達(dá)能有效抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖能力。

圖4 SW1990(4A)、PANC1(4B)的空白對(duì)照組、siRNA-NC組、siRNA-KLK12組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線 圖5 SW1990(5A)、PANC1(5B)的空白對(duì)照組、OE-NC組、KLK12-OE組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

培養(yǎng)72 h，SW1990、PANC1細(xì)胞的KLK12-OE組A450值分別為1.32±0.03、1.26±0.04，NC組分別為1.06±0.02、1.05±0.03，OE-NC組分別為1.11±0.03、1.08±0.03，KLK12-OE組A450值均顯著大于NC組和OE-NC組(P值均<0.01，圖5)，表明KLK12過(guò)表達(dá)能明顯增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的增殖能力。

五、轉(zhuǎn)染后SW1990、PANC1細(xì)胞的侵襲、遷移能力變化

SW1990、PANC1的siRNA-KLK12組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(373.7±14.8)、(556.3±13.6)個(gè)/高倍視野，NC組分別為(741.7±11.6)、(668.3±16.5)個(gè)，siRNA-NC組分別為(726.0±11.8)、(646.0±15.1)個(gè)/高倍視野(圖6)；siRNA-KLK12組的遷移細(xì)胞數(shù)分別為696.0±13.1、449.0±16.5個(gè)/高倍視野，NC組分別為854.3±21.5、610.3±11.9個(gè)/高倍視野；siRNA-NC組分別為841.3±15.4、595.7±8.6個(gè)/高倍視野(圖7)。siRNA-KLK12組穿膜細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均較NC組和siRNA-NC組顯著減少(P值均<0.05)，表明抑制KLK12表達(dá)可明顯降低細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

圖6 SW1990(左)、PANC1(右)的空白對(duì)照組(上)、siRNA-NC組(中)、siRNA-KLK12組(下)穿膜細(xì)胞(結(jié)晶紫染色 ×200)

圖7 SW1990(左)、PANC1(右)的空白對(duì)照組(上)、siRNA-NC組(中)、siRNA-KLK12組(下)的遷移細(xì)胞(結(jié)晶紫染色 ×200)

SW1990、PANC1的KLK12-OE組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為556.3±22.2、571.0±17.4個(gè)/高倍視野；NC組分別為393.0±15.5、354.3±14.9個(gè)/高倍視野，OE-NC組分別為402.7±10.5、426.7±23.3個(gè)/高倍視野(圖8)；KLK12-OE組遷移細(xì)胞數(shù)分別為639.3±16.5、740.3±13.0個(gè)/高倍視野，NC組分別為451.3±11.6、468.0±8.7個(gè)/高倍視野，OE-NC組分別為433.0±11.8、442.7±10.3個(gè)/高倍視野(圖9)。KLK12-OE組穿膜細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均較NC組和OE-NC組顯著增加(P值均<0.05)，表明KLK12過(guò)表達(dá)可明顯增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

圖8 SW1990(左)、PANC1(右)的空白對(duì)照組(上)、OE-NC組(中)、KLK12-OE組(下)的穿膜細(xì)胞(結(jié)晶紫染色 ×200)

圖9 SW1990(左)、PANC1(右)的空白對(duì)照組(上)、OE-NC組(中)、KLK12-OE組(下)的遷移細(xì)胞(結(jié)晶紫染色 ×200)

討 論

KLK家族在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、血管生成以及消化系統(tǒng)酶活化等多種生理過(guò)程中起作用。KLK以組織特異性的方式表達(dá)，并分別受類固醇激素和絲氨酸蛋白酶抑制劑等轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)控[7]。KLK3又稱前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen，PSA)，目前已被臨床常規(guī)用于前列腺癌的篩查[8]。KLK6可以通過(guò)切割纖維蛋白原、膠原蛋白和層黏連蛋白參與腫瘤的血管生成和轉(zhuǎn)移[9]。而本課題組所研究的KLK12也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)KLK12在結(jié)腸癌中呈高表達(dá)，進(jìn)一步利用基因沉默技術(shù)敲低結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中KLK12的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的活力及侵襲力明顯下降，且這一效應(yīng)可能是借助AMPK/mTOR信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。同樣在結(jié)腸癌中，Xia等[11]采用新型的硒納米顆粒技術(shù)下調(diào)了結(jié)腸癌細(xì)胞中KLK12的表達(dá)，通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)被顯著抑制。Li等[12]發(fā)現(xiàn)KLK12在AGS胃癌細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)于GES-1胃正常細(xì)胞，利用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)后發(fā)現(xiàn)AGS細(xì)胞的增殖及遷移能力顯著被抑制，并使其細(xì)胞周期停滯在G0/G1期。Gong等[13]通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)116例三陰性乳腺癌組織中KLK12 mRNA的表達(dá)，其中54例(47%)陽(yáng)性表達(dá)，并通過(guò)隨訪及生存分析發(fā)現(xiàn)KLK12mRNA的陽(yáng)性表達(dá)與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示KLK12蛋白和mRNA在胰腺癌細(xì)胞株SW1990、PANC1的表達(dá)均明顯高于正常胰腺細(xì)胞株HPDE6-C7，下調(diào)KLK12表達(dá)后，胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲以及遷移能力明顯下降，而上調(diào)其表達(dá)后上述能力又明顯增強(qiáng)。胰腺癌組織KLK12蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，且KLK12高表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)，提示KLK12促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，KLK12可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為，提示其可能成為新的潛在的生物學(xué)標(biāo)志物。關(guān)于KLK12在胰腺癌中的作用機(jī)制以及其是否會(huì)成為新的治療靶點(diǎn)仍需要更多研究進(jìn)一步深入。

利益沖突所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明胡丕波：研究操作、數(shù)據(jù)整理、論文撰寫；劉蒙蒙：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)分析；陳炯：研究設(shè)計(jì)、研究指導(dǎo)、論文修改