李源 任帥 曹營營 郭凱 楊夢 趙雅桐 張雅平 王中秋

南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院(江蘇省中醫(yī)院)放射科，南京 210000

胰腺癌早期癥狀隱匿，臨床診斷困難，CA19-9是目前臨床上最常用的胰腺癌診斷標志物，但由于其在非胰腺癌中的假陽性率較高，導(dǎo)致診斷準確率下降[1-2]。因此，臨床亟待尋找一種高敏感性和高特異度的生物標志物來提示早期胰腺癌。外泌體是一類直徑40～100 nm的細胞外囊泡，包含蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等成分，廣泛分布于人體，在細胞通信間扮演重要角色。微小RNA(microRNA，miRNA)是真核生物中廣泛存在的一種小分子非編碼RNA，長度19～24 nt，是外泌體RNA載體中最豐富的類型，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用[3]。本研究擬對早期胰腺癌、慢性腫塊型胰腺炎及健康志愿者的血清外泌體miRNAs進行差異表達分析及驗證，并探討血清外泌體hsa-let-7f-5p在早期胰腺癌中的診斷價值。

材料與方法

一、一般資料

選取2019年1月至2020年1月間南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院行手術(shù)并經(jīng)病理證實的19例早期胰腺癌患者和16例慢性腫塊型胰腺炎患者。參照AJCC第八版胰腺癌分期系統(tǒng)[4]，將19例早期胰腺癌患者(ⅠA、ⅠB、ⅡA、ⅡB期)作為早期胰腺癌組，16例慢性腫塊型胰腺炎患者作為胰腺炎組。納入標準：年滿18周歲；無其他惡性腫瘤；無基礎(chǔ)代謝性疾?。慌R床資料完整。同時選取19名健康志愿者作為正常對照組。將2019年1月至2019年6月收集的21例納入測序組以篩選差異表達的miRNA：早期胰腺癌8例，其中男性5例，女性3例，年齡48～78歲，平均年齡62歲；慢性腫塊型胰腺炎5例，其中男性2例，女性3例，年齡50～58歲，平均年齡53歲；健康對照8例，其中男性5例，女性3例，年齡32～59歲，平均年齡45歲。將2019年7月至2020年1月收集的33例納入驗證組以驗證篩選出的差異表達的miRNA：早期胰腺癌11例，其中男性7例，女性4例，年齡52～73歲，平均年齡62歲；慢性腫塊型胰腺炎11例，其中男性4例，女性7例，年齡41～61歲，平均年齡53歲；健康對照11例，其中男性4例，女性7例，年齡41～63歲，平均年齡53歲。記錄患者的體重是否下降，是否有高血壓史、吸煙史、飲酒史及血清CA19-9水平。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過(2017NL-137-05)，患者及健康對照者均簽署知情同意書。

二、樣本收集

清晨空腹肘靜脈采血，抽取5 ml于EDTA抗凝管中；室溫靜置30 min后，4℃、1 200×g離心10 min，吸取上清液于15 ml離心管內(nèi)；4℃、3 000×g再次離心15 min，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

三、外泌體的分離與鑒定

采用exoEasy Maxi Kit試劑盒(德國QIAGEN公司)分離血清外泌體，透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)下觀察外泌體的結(jié)構(gòu)特征，納米顆粒追蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)觀察外泌體的粒徑大小，蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測外泌體表面特異性標志物CD63、CD81蛋白表達。

四、外泌體總RNA抽提與質(zhì)檢

采用miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒(德國QIAGEN公司)抽提外泌體總RNA，采用Agilent 2100生物分析儀及RNA 6000 Nano Reagents PartⅠ試劑盒(德國QIAGEN公司Cat.No 1545)檢測總RNA的完整性，以RNA完整系數(shù)(RNA integrity number, RIN)表示，為1～10，完整性越高數(shù)值越接近于10。

五、小RNA文庫構(gòu)建與質(zhì)檢

取上述提取的總RNA作為原料進行小RNA的文庫構(gòu)建，在小RNA兩端加上3′和5′接頭，以其作模板進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA片段，通過PCR擴增技術(shù)，使用凝膠電泳分離出長度不同的小RNA文庫。Illumina小RNA建庫試劑盒標準文庫條帶理論值為145～150 bp，故將此范圍內(nèi)的片段進行割膠回收和純化，借助Aglient 2100觀察切膠純化后的條帶分布。

六、小RNA高通量測序及miRNA的篩選

采用Illumina高通量測序技術(shù)完成對小RNA的測序，參照miR Base數(shù)據(jù)庫，比對測序結(jié)果，去除miRNA以外的其他小RNA后，對早期胰腺癌組、胰腺炎組及正常對照組差異表達的外泌體miRNA進行篩選。篩選標準為差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)>2或<0.5；P<0.05；以每百萬比配成對序列做miRNA表達量指標(transcript per million，TPM)>2。

七、差異表達miRNA的驗證

采用實時熒光定量PCR法對篩選出的差異miRNA進行定量驗證。PCR反應(yīng)體系：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，反應(yīng)45個循環(huán)。hsa-miR-486-5p、hsa-miR-423-5p在所有樣本中的表達穩(wěn)定且無差異，因此以兩者表達量的平均值來計算目標miRNA的相對表達量，利用擴增循環(huán)數(shù)法(cycle threshold，Ct)計算研究中miRNA的表達量(2-ΔΔCt)，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實驗組樣本-ΔCt對照組樣本。

八、差異表達miRNA的功能富集分析

使用R語言軟件中clusterprofiler包對差異表達miRNA的功能進行功能富集分析。利用基因本體(gene ontology，GO)數(shù)據(jù)庫富集分析篩選出差異miRNA的靶基因，對其生物過程、分子功能及細胞組分3個方面進行分類注釋，并應(yīng)用京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫分析靶基因在細胞中參與的信號通路及功能。

九、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、一般情況

與胰腺炎組及正常對照組比較，早期胰腺癌組CA19-9水平增高、年齡大、體重下降，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，其余指標差異均無統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 早期胰腺癌組與胰腺炎組、正常對照組患者臨床資料比較

二、外泌體的鑒定

TEM下可見外泌體特征性碟形雙層囊膜結(jié)構(gòu)(圖1A)。NTA顯示外泌體粒徑主峰在150 nm左右，符合外泌體的粒徑分布范圍(圖1B)。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，外泌體特異性蛋白CD63、CD81表達陽性(圖1C、1D)。

圖1 外泌體鑒定。外泌體特征性碟形雙層囊膜結(jié)構(gòu)(1A)；外泌體NTA粒徑圖(1B)；外泌體蛋白CD63(1C)、CD81(1D)表達陽性(1～9代表9個獨立的外泌體樣本)

三、外泌體總RNA質(zhì)檢及小RNA文庫構(gòu)建

研究結(jié)果顯示，各樣本的RIN均在6～8之間，可適用于后續(xù)實驗。所有樣本切膠前與切膠后的條帶分布均集中在145～150 bp之間，與標準條帶分布范圍接近，說明小RNA文庫構(gòu)建成功。

四、miRNA篩選結(jié)果

對比早期胰腺癌組與胰腺炎組，篩選出93個miRNA，其中表達上調(diào)73個，下調(diào)20個；對比早期胰腺癌組與正常對照組，篩選出99個miRNA，其中表達上調(diào)69個，下調(diào)30個(圖2)。兩比較組共有的差異miRNA為42個，其中表達上調(diào)33個，下調(diào)9個。排除尚未明確命名的miRNA，得到2個表達上調(diào)的miRNA：hsa-let-7f-5p和hsa-miR-11401。目前hsa-miR-11401被證實可減輕阿霉素誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡[5]，而hsa-let-7f-5p在多種癌癥中被證實具有調(diào)控作用，且與胰腺癌的發(fā)生有關(guān)[6]，因此最終選取hsa-let-7f-5p進行驗證。

圖2 早期胰腺癌組與胰腺炎組差異外泌體miRNA的分布情況(2A)及早期胰腺癌組與正常對照組差異外泌體miRNA的分布情況(2B)

五、差異表達外泌體hsa-let-7f-5p的驗證

與胰腺炎組及正常對照組比較，早期胰腺癌組外泌體hsa-let-7f-5p表達量均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表2)。ROC曲線評估血清外泌體hsa-let-7f-5p及CA19-9分別在早期胰腺癌組中的診斷效能見圖3。外泌體hsa-let-7f-5p鑒別早期胰腺癌組和胰腺炎組的AUC值為0.843(95%CI為0.640～1.000)，靈敏度和特異度分別為100%和81.82%；鑒別早期胰腺癌組和正常對照組的AUC值為1.000(95%CI1.000～1.000)，靈敏度和特異度均為100%。CA19-9鑒別早期胰腺癌組和胰腺炎組的AUC值為0.893(95%CI0.721～1.000)，靈敏度和特異度分別為81.82%和100%；鑒別早期胰腺癌組和正常對照組的AUC值為0.909(95%CI0.739～1.000)，靈敏度和特異度分別為90.9%和100%。Delong檢驗結(jié)果顯示，外泌體hsa-let-7f-5p診斷早期胰腺癌的效能與CA19-9相當，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖3 hsa-let-7f-5p、CA19-9在早期胰腺癌組與胰腺炎組(3A)、早期胰腺癌組與正常對照組(3B)鑒別中的ROC曲線

表2 早期胰腺癌組與胰腺炎組患者及正常對照組血清外泌體hsa-let-7f-5p相對表達量比較

六、外泌體hsa-let-7f-5p的功能富集分析

GO分析結(jié)果表明，hsa-let-7f-5p的靶基因主要參與補體激活凝集素途徑；表達蛋白主要分布于纖毛層發(fā)揮作用；主要發(fā)揮與一氧化氮合酶結(jié)合的功能(圖4A)。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，hsa-let-7f-5p的靶基因主要參與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路(圖4B)。

圖4 外泌體hsa-let-7f-5p的GO富集分析(4A)及KEGG通路分析(4B)

討 論

胰腺癌早期診斷困難、惡性程度高。研究表明，外泌體miRNAs表達的上調(diào)或下調(diào)在多種癌癥中具有診斷意義[7]。血清外泌體miRNAs作為診斷標志物具有如下優(yōu)勢：(1)其在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中廣泛表達，便于取樣；(2)通過測定外泌體miRNAs的表達譜，可以在不進行活檢的情況下檢測腫瘤細胞的miRNAs表達譜；(3)攜帶細胞內(nèi)生物活性物質(zhì)至靶細胞，傳遞遺傳信息，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；(4)其脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，可以保護miRNAs不被核糖核酸酶降解，保持活性及穩(wěn)定性[8]。此外，有研究表明外泌體miRNAs對癌癥早期診斷的靈敏度和特異度較好，可作為潛在標志物[7]。

本研究結(jié)果表明，外泌體hsa-let-7f-5p在鑒別早期胰腺癌與慢性腫塊型胰腺炎和健康人群中的診斷效能與CA19-9相當，可作為早期胰腺癌的診斷標志物。外泌體let-7f-5p與早期胰腺癌之間的關(guān)系尚未見詳細報道，但其在其他惡性腫瘤中的作用已有研究。let-7可以靶向多種致癌因子，通過直接靶向蛋白的轉(zhuǎn)錄因子或靶向其下游效應(yīng)分子來調(diào)控腫瘤的發(fā)生[9]，其家庭成員let-7f在卵巢癌[10]、乳腺癌[11]等腫瘤中表達下調(diào)。Shee等[12]研究發(fā)現(xiàn)外泌體let-7f-5p是非基層浸潤型膀胱癌復(fù)發(fā)的生物標志物。此外，外泌體let-7f-5p在甲狀腺癌[9]中表達上調(diào)，在結(jié)直腸癌[13]、肺癌[14]中表達下調(diào)。劉宇亭等[15]研究發(fā)現(xiàn)同時使用miR-34a和miR-let7轉(zhuǎn)染人胰腺癌細胞，可以使其增殖活性、細胞遷移和侵襲力顯著下降，細胞凋亡率顯著增加，從而發(fā)揮更顯著的協(xié)同抗腫瘤作用。

本研究結(jié)果顯示，血清外泌體hsa-let-7f-5p的靶基因主要參與補體激活凝集素途徑，表達蛋白位于纖毛層，功能方面主要發(fā)揮與一氧化氮合酶結(jié)合的功能，且靶基因與MAPK信號通路關(guān)系密切。炎癥參與腫瘤發(fā)生和癌癥進展的各個階段，而補體系統(tǒng)是炎癥反應(yīng)的重要組成部分，激活補體的凝集素途徑可促進腫瘤發(fā)生、驅(qū)動巨噬細胞募集并抵抗抗PD-1免疫治療[16]，其相關(guān)蛋白MASP-2在胰腺癌中高表達[17]。一氧化氮主要由一氧化氮合酶催化而成，通過誘導(dǎo)硝基氧化應(yīng)激，干擾氧化還原平衡，導(dǎo)致癌變，因此抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，在抑制胰腺癌細胞生長、誘導(dǎo)其凋亡中起重要作用[18-19]。MAPK信號通路是一類將信號從細胞膜傳遞到細胞核的蛋白激酶家族，參與調(diào)控細胞的增殖、分化、死亡，已被證實在胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用[20]。

本研究存在以下不足：(1)測序組及驗證組的樣本量較?。?2)僅將早期胰腺癌組與胰腺炎組及正常對照組進行比較，未與胰腺其他良性腫瘤比較；(3)組間年齡未匹配，早期胰腺癌組較胰腺炎組及正常對照組年齡大，但這符合胰腺癌好發(fā)于老年人的流行病學特征[4]。未來會在本研究結(jié)果基礎(chǔ)上，加大樣本量，增加分組，以評估外泌體hsa-let-7f-5p的診斷和預(yù)測作用，并進一步探索其在胰腺癌治療和預(yù)后方面的價值。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明李源：研究操作、論文撰寫；任帥：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學分析；曹營營、郭凱、楊夢、趙雅桐、張雅平：研究醞釀、研究指導(dǎo)、工作支持；王中秋：研究設(shè)計、研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費支持