伍錫棟 林引花

1 江西省醫(yī)療器械檢測中心 （江西 南昌 330000）

2 南昌大學藥學院 （江西 南昌 330000）

內容提要： 聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride，PVC）因為性能穩(wěn)定、價格低廉而廣泛應用于醫(yī)療器械領域。PVC需要根據(jù)使用的需求不同而加入不同比例的增塑劑、熱穩(wěn)定劑、色素等添加劑，但是因為添加劑的使用會造成一定的生物毒性，對人體健康造成危害。在PVC材料加工時增塑劑和熱穩(wěn)定劑的使用量最大。文章主要分析PVC材質中增塑劑、熱穩(wěn)定劑的生物毒性，概述PVC材質醫(yī)療器械的生物安全性評價及檢測方法，醫(yī)療器械的材質、狀態(tài)、組成及添加物質均決定了生物毒性檢測方法的選擇，在實際檢測過程中細胞毒性的檢測應盡可能綜合2種以上方法的結果進行評價。

聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride，PVC）是由氯乙烯單體在過氧化物等引發(fā)劑或者光熱條件下聚合而成的高分子聚合物。PVC是世界上最早實現(xiàn)工業(yè)化的合成樹脂之一，在20世紀30年代初實現(xiàn)工業(yè)化，往后的30年里其產量一直居于世界塑料產量的榜首，直至60年代才被聚乙烯（Polyethylene，PE）超越，但產量仍占世界產量的四分之一以上。PVC具有加工方便、可消毒、柔軟、耐壓等優(yōu)良特性，被廣泛應用于日常生活。在醫(yī)療器械領域發(fā)揮巨大的使用價值。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，2018年我國醫(yī)用塑料市場消費中PVC的用量占比最大，高達28%[1]。PVC材質使用范圍廣，在醫(yī)療器械領域因為會與人體接觸所以需要格外注意其生物安全性，需要對該類材質的醫(yī)療器械進行相關的生物學檢測和評價。

細胞毒性試驗是一種在體外借助相關的細胞，模擬細胞生長環(huán)境，具有廣泛的通用性，在醫(yī)療器械的生物學評價中作為常規(guī)評價方法之一，是對醫(yī)療器械生物學評價的重要指標之一。該方法能在快速檢測供試品或其浸提液對細胞的影響，能大批量篩選樣品并快速反應毒性物質的敏感性。該方法具有易標準化、可操作性強、結果具有很強的實驗室間比對性等特點，能為是否進行下一步生物學評價提供直接的參考依據(jù)。隨著分子生物學和細胞生物學技術的快速發(fā)展，細胞毒性的檢測方法也在不斷發(fā)展，現(xiàn)行GB/T16886和ISO10993相關標準中可操作的試驗方法主要包含浸提液試驗、直接接觸試驗、瓊脂擴散試驗、濾膜擴散試驗等。主要測試途徑為：細胞形態(tài)的觀察，細胞損傷的測定，細胞生長的測定和細胞代謝特性的測定。新生效版本緊跟國際ISO標準前沿，并保證了在方法學上與國際標準的近乎等同，讓國內申報數(shù)據(jù)與產品注冊更好地與國際接軌。

1.主要影響PVC材質醫(yī)療器械生物毒性的因素

1.1 增塑劑

PVC分子作為一種無定型高聚物，含有極性較大的C-Cl基團，分子間作用力強，在加工時需要添加增塑劑。增塑劑可以擴散進入PVC大分子之間并且與其聚合作用，通過削弱PVC分子間的范德華力，從而增加分子鏈的移動性，可以降低其玻璃化轉變溫度（Tg），提高PVC的可塑性[2]。但是PVC制品中的增塑劑會因為溫度、PVC制品特性、增塑劑分子特性及含量等因素而向外界擴散，并且對人體存在潛在毒性[3]。使用最多的增塑劑是鄰苯二甲酸類。在PVC材質醫(yī)療器械中DEHP（鄰苯二甲酸二乙基己酯）作為最常使用的增塑劑之一，它對于人體的生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)具有潛在毒性。李丹丹等[4]通過分析不同濃度的DEHP及其活性代謝產物MEHP對小鼠胚胎肝細胞的影響得出DEHP和MEHP對小鼠ESC活性都具有抑制作用，且存在濃度依賴性。李丹丹等[4]通過對妊娠大鼠連續(xù)DEHP灌胃染毒對子代大鼠神經(jīng)行為的影響，發(fā)現(xiàn)DEHP及其代謝產物可能通過干擾神經(jīng)類固醇CYP19A1芳香化酶基因的轉錄從而影響子代大鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。韓佳縈等[5]通過不同濃度劑量的DEHP處理小鼠巨噬細胞株RAW164.7和腹腔巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)DEHP抑制巨噬細胞分泌TNF- 、IL-12、IL-23等細胞因子，影響巨噬細胞的貼壁及吞噬能力，具有免疫抑制作用。

DEHP作為一種增塑劑被廣泛應用于PVC產品中，現(xiàn)行使用的醫(yī)療器械產品應用PVC材料也非常普遍，其中最為關注的為輸注類。文獻報道高分子材料對藥物存在不穩(wěn)定性，原因是呈脂溶性的DEHP不以共價鍵結合于PVC分子上，易從塑料中溶出，而且其溶出物和量對人體的影響是近年來不斷研究的對象[6]。DEHP的溶出量取決于溫度、輸注液體的脂溶性及與PVC材料塑料接觸的持續(xù)時間等。DEHP的急性毒性輕微，有研究報道，實驗動物通過多種途徑（如經(jīng)口或經(jīng)局部注射）接受此化合物的半數(shù)致死量范圍達到14～50g·kg，而靜脈注射的半數(shù)致死量甚至高達200mg·kg[7]。在正常情況下，少量DEHP會在24h內經(jīng)由尿液或糞便排出體外，但DEHP的主要代謝產物鄰苯二甲酸單乙基己酯（MEHP）則會在人體組織中長期蓄積，生物蓄積時間可長達6個月甚至更久。DEHP的慢性毒性主要表現(xiàn)在對生殖系統(tǒng)、血液系統(tǒng)的影響以及肝臟毒性，由于PVC材質的醫(yī)療器械會通過化學作用等影響輸出的藥液性質和有效性等，更嚴重的甚至會影響人體的毒性反應和生命健康。從此種現(xiàn)象反應，醫(yī)療器械在生產過程中，增塑劑不可避免的使用使得PVC材質醫(yī)療器械必須受到國家政府機構的嚴格監(jiān)管，如何減少增塑劑遷移或者開發(fā)環(huán)保型的可替代材料需要得到更多的關注。有文獻報道，當胰島素加入PVC袋裝輸液中時，1h即被吸附52.57%，到12h輸出胰島素濃度僅為開始時的36.89%，而在聚丙烯袋裝輸液時，輸出的胰島素濃度幾乎保持不變[8]。醫(yī)療器械產業(yè)中PVC材質用于輸液包材除了對某些藥物有吸附損失以外，而且其添加的增塑劑等化學物質的溶出也會影響用藥安全。聚丙烯是屬于非PVC包材之一，對藥物的吸附性小，且更加環(huán)保和安全，或許從醫(yī)療器械對藥物吸附性方面考慮，聚丙烯更具有應用前景。

1.2 熱穩(wěn)定劑

PVC在加工溫度>160?C才能塑化成型，但是在加熱過程中分子鏈增長會生成活潑的叔碳原子，叔碳原子與其相連的氯原子和氫原子很容易形成HCl并脫除。加入熱穩(wěn)定劑可以消除引起開始脫HCl的不穩(wěn)定部位，并且迅速結合脫落下的HCl，從而抑制PVC的分解[9]。PVC中常見的熱穩(wěn)定劑有鉛鹽類、有機錫類、金屬皂類。

鉛鹽類熱穩(wěn)定劑由于存在重金屬鉛，其遷移和在體內的累積必然會對人體的神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，造成智力和運動的異常，同時損傷骨髓造血系統(tǒng)引發(fā)貧血。含鉛鹽類熱穩(wěn)定劑的PVC材料也不適用于食品包裝。有機錫類作為鉛鹽類的最常用替代品之一，安全性較為提高，但不是所有的有機錫類穩(wěn)定劑是安全無毒的。國內常用的有機錫穩(wěn)定劑為硫醇甲基錫。王偉等[10]根據(jù)國家標準使用硫醇甲基錫對SFP級小鼠進行急性經(jīng)口毒性試驗，得出硫醇甲基錫為中級毒性的結果。同時在硫醇甲基錫生產控制中容易生成高毒性的雜質TMT（三甲基氯化錫），根據(jù)朱海兵等[11]的病例分析可以知道TMT多造成人體中、重度中毒，導致患者頭暈、精神行為異常和記憶力衰退。但是我國的有機錫穩(wěn)定劑國家標準GB/T26026-2010《硫醇甲基錫》中并沒有對TMT進行限量，缺乏對行業(yè)的標準限定，這對于生產人員和使用人員都存在一定的衛(wèi)生風險。

金屬皂類熱穩(wěn)定劑是復合型熱穩(wěn)定劑的主要成分，多為脂肪酸（月桂酸、硬脂酸等）的金屬（鋇、鎘、鋅、鈣等）鹽，這類熱穩(wěn)定劑除了與HCl作用外，還可以置換出活潑的烯丙基氯原子。近年來常見的金屬皂類熱穩(wěn)定劑有復合鈣鋅熱穩(wěn)定劑，屬于環(huán)保型材料。程建軍等[12]通過流變實驗和規(guī)?；a對應用了鈣鋅熱穩(wěn)定劑的PVC材料考查，認為環(huán)保型鈣鋅熱穩(wěn)定劑可以替代有毒性的鉛鹽類熱穩(wěn)定劑。

2.常用的細胞毒性檢測方法

2.1 直接接觸試驗

直接接觸試驗對材料的敏感性最高，可以檢測出材料微弱的細胞毒性，適用于同時提取并測試從含血清培養(yǎng)基中提取到的化學物質。由于結果需要在顯微鏡下直接觀察，所以操作過程中應避免不必要的移動，減少對細胞的物理損傷，避免假陽性的發(fā)生。個別產品不能單一依據(jù)此類方法的評價產品的細胞毒性，例如對于一些蛋白纖維類的材料在直接接觸試驗中沒有出現(xiàn)細胞毒性，還需進行間接試驗綜合評價。Kuhbier等[13]對蜘蛛絲材料進行細胞毒性檢測時發(fā)現(xiàn)蜘蛛絲材料進行直接接觸試驗時無細胞毒性，在間接接觸試驗中卻有細胞毒性。所以僅憑直接接觸試驗的結果判斷醫(yī)療器械的生物性能太過于片面，有時需要借助多種試驗方法綜合評價。

2.2 間接接觸試驗

間接接觸試驗是利用瓊脂或者濾膜將樣本和細胞分隔，觀察樣本中可通過中間介質的濾過性物質對細胞生長增殖以及細胞形態(tài)學的影響，適用于細胞毒性的定性評價，主要包括瓊脂擴散法和濾膜擴散法兩種試驗方法。瓊脂擴散法需要將含血清的培養(yǎng)基和融化的瓊脂相混合，鋪展在細胞表面并用中性紅染液進行染色，中性紅染色等瓊脂凝膠化后將藥品放置在瓊脂上，觀察樣品褪色區(qū)域的大小來評定細胞毒性的等級。中性紅是一種弱陽離子染料，通過進入到細胞內部溶酶體內，依賴于活細胞細胞膜的完整性進行顯色，死細胞或無細胞不進行顯色，所以可以根據(jù)顯色區(qū)域的大小等來評價細胞活力[14]。而濾膜擴散法的不同點是將樣品接種到濾膜上，將含細胞面朝下，放在凝膠化的瓊脂上并將樣品放在另外無細胞的一面，最后在培養(yǎng)24h后，采用琥珀酸脫氫酶等進行染色處理，觀察褪色區(qū)域大小，結合相關的評價標準進行細胞毒性分級。

2.3 浸提液試驗

浸提液試驗主要為MTT比色法，原理是屬于水溶性四氮唑染料的MTT在活細胞還原為紫色非水溶性甲瓚，用DMSO溶解后可以通過酶標儀定量甲瓚，通過對比試驗組和對照組的吸光度來評估樣品細胞毒性。MTT比色法靈敏度高，可用于細胞毒性的定量分析，但是重復性稍差[15]。該方法是按照GB/T 16886.12和ISO10993.12相關標準中相關方法對受試材料進行浸提液制備，在特定的溫度、濕度和轉速的搖床中浸提一定時間后，用浸提液直接與一定濃度的細胞作用一定的時間。對受試材料溶出物的毒性檢測敏感性較高，與動物體內毒性結果的真實性比較吻合。該方法可檢測可溶于浸提介質的可溶出物的細胞毒性反應，對于不溶于浸提介質的溶出物的細胞毒性評價不適用。胡煜雯等[16]對新版GB/T16886.5-2017中的MTT比色法進行解讀，認為MTT法存在假陰性的可能，并且提出XTT和CCK8這兩種試驗方法也值得利用不同材料的醫(yī)療器械進行交叉對比。進行對于同一種樣品，選擇的檢測標準不同其結果會有所不同。嚴小莉等[17]采用直接接觸試驗和MTT比色法對液體創(chuàng)可貼進行細胞毒性檢測，發(fā)現(xiàn)直接接觸試驗的細胞無法增殖而MTT比色法的細胞可正常貼壁生長。孫皎[18]提出生物學評價試驗本身因現(xiàn)有技術水平有限無法達到準確無誤的預測結果，且醫(yī)療器械的生物學評價應根據(jù)器械的實際應用情況設計相對的試驗。

近年來RCTA法（實時無標記細胞分析法）被提出可以適用于醫(yī)療器械的細胞毒性檢測，但還未納入國家標準中。王海濤等[19]針對RACT法的線性范圍、精密度和重復性等在8種醫(yī)療器械產品中進行考察，同時與MTT比色法的結果進行對比，發(fā)現(xiàn)RCTA法快捷簡便，結果準確可靠，可以初步適用于醫(yī)療器械體外細胞毒性評價。黃婷等[20]對56批次的醫(yī)療器械檢品進行RCTA法和MTT法結果對比，發(fā)現(xiàn)RCTA法可以有效檢測醫(yī)療器械細胞毒性，但是不適用于部分有溶出物干擾檢測的檢品。

3.討論

直接接觸法、瓊脂糖擴散法、MEM洗脫法（形態(tài)觀察法）以及MTT法等。鑒于化合物或者醫(yī)療器械一般僅選用其中一種檢測方法用于法規(guī)申報或者毒性研究，因此對細胞毒性檢測方法的選用至關重要?，F(xiàn)根據(jù)上述方法的概述比較分析各種方法的不同，其中，直接接觸法中需將供試品制成規(guī)定的形狀，將供試品直接放置于細胞層，能較為直接的評估到供試品對細胞層的毒性影響，此法對供試品要求較為嚴苛，密度過大或者過小都將影響試驗的操作和評估，操作時需注意防止不必要的移動，否則會導致細胞的物理性損傷。相比于直接接觸法，瓊脂擴散法通過在細胞層上附加一層瓊脂或者瓊脂糖，克服了直接接觸法易導致物理性損傷的缺點，但該試驗不適用于不能通過瓊脂層擴散或可能與瓊脂相互作用的可瀝濾物，使用瓊脂糖試驗進行細胞毒性評定應進行論證。MEM洗脫試驗為美國藥典推薦試驗，使用供試品浸提液/溶液給藥，等同于該標準下的形態(tài)觀察法，通過顯微鏡觀察評價細胞的圓縮比例、貼壁是否疏松、胞漿內有無顆粒、有無大范圍細胞溶解、細胞生長是否抑制等綜合評價細胞毒性，毒性評價為評分0～4級5個等級來客觀評價細胞毒性的反應在程度，較原標準多了個1個等級，且更為詳細和標準化，浸提液試驗作為現(xiàn)行細胞毒性檢測最常用的方法，但由于在GB/T 16886.12和ISO10993.12等標準對樣品的浸提液制備方法只規(guī)定了固體類材料，對于液體類的樣品沒有進行明確的規(guī)定，導致一些液體類產品浸提液制備方法的不適用性套用，直接影響對此類產品細胞毒性的客觀評價結果，因此該法的主觀評分對技術員的觀察經(jīng)驗和積累有更高的要求。相對于MEM洗脫試驗，MTT細胞毒性試驗更為客觀。MTT細胞毒性試驗為國內較為廣泛的細胞毒性檢測方法，黃色水溶液MTT在活細胞內代謝性還原，生成藍紫色不可溶的甲臜?；罴毎臄?shù)目與甲臜溶于醇類后用光度計測定的色度相關。

增塑劑可以增強塑料制品的柔韌性和斷裂拉伸率，改善PVC產品的成型加工。熱穩(wěn)定劑吸收HCl，置換出高分子鏈中的活潑原子，捕獲自由基，抑制PVC制品的老化降解。PVC材料在加工時加入增塑劑和熱穩(wěn)定劑是必不可免的工序，但是這兩種添加劑中絕大部分的化學助劑存在一定的生物毒性。開發(fā)環(huán)保型的化學助劑，減少PVC材質對人體以及環(huán)境的危害，是目前化學助劑行業(yè)最重要的問題。

由此可見，各類型細胞毒性檢測試驗的原理與方法各不相同，而各方法中又有很多影響檢測結果的參數(shù)，根據(jù)試驗材料本身的理化性質、毒性作用強弱及其用途正確的選擇試驗方法及相關參數(shù)十分重要，生物學評價試驗的現(xiàn)行標準不完善，生物學評價試驗的方法和評判依據(jù)主要參照現(xiàn)行的相關標準文件，而標準推薦的方法并非一定代表當今生物學和醫(yī)學領域中最先進、最有效和最適合的檢測手段。PVC材質醫(yī)療器械領域的使用，受到國家的嚴格管控，但是按照國家統(tǒng)一規(guī)定的GB/T16886.5-2017標準對醫(yī)療器械進行相應的細胞毒性檢測，結果會有所差異，如果要得出正確的評判，需要研究者不斷地嘗試和探索。改善國家標準中的檢測方法，抑或是尋找更加適用的檢測新手段，提高檢測的準確度和可靠性。對有關醫(yī)療器械的檢測，需要檢測人員根據(jù)醫(yī)療器械產品的特性，探尋出合理有效地檢測方法，以期達到有效地評價醫(yī)療器械產品細胞毒性的目的。