任同偉，覃 念，全東群，謝 欣，王 豪，王玉旭，陳 櫻，歐陽康，黃偉堅，韋祖樟

（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 動物傳染病與分子免疫學(xué)實驗室，南寧 530005）

豬繁殖與呼吸綜合癥（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗稱“藍(lán)耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的懷孕母豬流產(chǎn)，尤其是懷孕后期母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔，還引起各階段豬呼吸道疾病的一種接觸性傳染病[1-4]。PRRSV是一種不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目動脈炎病毒科動脈炎病毒屬成員。PRRSV基因組全長約15 000 bp，含有至少10個開放閱讀框（open reading frame,ORF）[5]，從5′端到3′端，依次為ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORFs3-7，以及最新發(fā)現(xiàn)的ORF5a。5′端占基因組全長3/4的ORF1a和ORF1b編碼病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的酶復(fù)合物，基因組3′端至少有8個ORFs（ORF2～ORF7）來編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白。

PRRSV N蛋白為病毒的核衣殼蛋白，由ORF7基因編碼，相對分子質(zhì)量為14～15 kDa。N蛋白免疫原性強，是PRRSV的主要免疫原蛋白，感染宿主主要產(chǎn)生抗N蛋白抗體[6]。N蛋白的主要作用是包裝病毒基因組RNA，N蛋白在細(xì)胞漿中合成后,通過共價和非共價的連接形式與自身結(jié)合，這是病毒核衣殼蛋白組裝的基礎(chǔ)[7]，當(dāng)N蛋白轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和高爾基體，N-N之間通過二硫鍵連接形成同源二聚體N蛋白，從而形成直徑在20～30 nm的球狀核衣殼[8-9]。在PRRSV復(fù)制過程中，部分N蛋白可進(jìn)入易感細(xì)胞如肺泡巨噬細(xì)胞（pulmonary macrophages,PAM）和Marc-145細(xì)胞的核仁中[10]，研究表明N蛋白核定位與PRRSV致病性有關(guān)[11]。本研究通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PRRSV N蛋白的Marc-145細(xì)胞系，為以后PRRSV N蛋白在細(xì)胞內(nèi)包裝病毒粒子相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞 Marc-145細(xì)胞、293T細(xì)胞、慢病毒載體pLenti-CMV-EGFP-Hygro質(zhì)粒、VSVG質(zhì)粒、psPAX2質(zhì)粒均由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物傳染病與分子免疫學(xué)實驗室保存，DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自CWBIO公司。

1.2 主要試劑 LA Taq?購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase購自NEB公司；Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit、Viral RNA Kit、HP Total RNA Kit購自O(shè)MEGA公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；Anti His-Tag Mouse Monoclonal Antibody、eEC Western blot Kit購自CWBIO公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）購自Beyotime公司；NaHCO3粉劑、細(xì)胞培養(yǎng)基MEM、DMEM粉劑購自Sigma公司；新生胎牛血清FBS購自Biological Industries；0.25%胰酶、0.05%胰酶購自Gibco公司。

1.3 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)PRRSV感染性克隆pGXAM和慢病毒載體pLenti-CMV-EGFP-Hygro的基因組序列設(shè)計一對特異性引物，N-XbaⅠ-F：5′-tgcTCTAGAtcatgctgagggtgat-3′，N-his-SalⅠ-R:5′-agtGTCGACtcaATGGTGATGGTGATGATGtg ctgagggtgatgc-3′，下劃線為內(nèi)切酶識別位點。以pGXAM為模板，通過PCR擴增在3′端含有His標(biāo)簽的PRRSV N蛋白序列。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后純化回收。將回收產(chǎn)物及慢病毒載體pLenti-CMV-GFP-Hygro分別用XbaⅠ和SalⅠ雙酶切后純化回收，用T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐抗性的LA平板，挑取單個菌落測序，將測序正確的菌液擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒。將構(gòu)建正確的質(zhì)粒命名為pLenti-CMV-N。

1.4 慢病毒包裝 以約1×106個/孔的密度將293T細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到90%時，按照Lipfection 2000的說明，將構(gòu)建好的質(zhì)粒pLenti-CMV-N以及陽性對照pLenti-CMV-GFP-Hygro（5 μg）分別與VSVG（1.25 μg）、psPAX2（3.5 μg）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，觀察24 h，收集細(xì)胞上清液后添加新鮮的2%FBS DMEM培養(yǎng)基，觀察48 h后并收取細(xì)胞上清液，將細(xì)胞上清液3000 ×g離心10 min，于-80℃保存。

1.5 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞篩選 將Marc-145細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度達(dá)到90%時，取1.4中48 h慢病毒包裝的細(xì)胞上清液感染細(xì)胞，孵育1 h后，棄去感染液，加入新鮮的含有一定藥物濃度的10%FBS MEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于感染后24、48、72 h進(jìn)行觀察。對慢病毒感染后的細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選前，將潮霉素B以100～1000 μg/μL的濃度分別配制于10%FBS MEM培養(yǎng)基中，確定藥物篩選濃度為200 μg/μL。感染72 h后棄去原培養(yǎng)基，在6孔板中加入新鮮的含有潮霉素B的10%FBS MEM培養(yǎng)，每天觀察，待陰性對照全部死亡，終止篩選，初步篩選出陽性細(xì)胞。用終點稀釋法將藥物篩選后的細(xì)胞以1個/100 μL的密度接種于96孔板中培養(yǎng)。10 d左右挑取狀態(tài)良好的單一克隆細(xì)胞株移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后對孔中部分細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.6 細(xì)胞系的PCR鑒定 裂解篩選后的部分細(xì)胞，用Universal Genomic DNA Kit直接提取細(xì)胞DNA，PCR擴增N蛋白序列；用哺乳動物細(xì)胞RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，PCR擴增N蛋白序列。PCR反應(yīng)條件參考1.3。將PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。兩種方法分別設(shè)立沒有轉(zhuǎn)染慢病毒包裝上清液的Marc-145細(xì)胞作為陰性對照。

1.7 間接免疫熒光（indirect immunoinfluscent assay,IFA） 將PCR鑒定后初步篩選出的細(xì)胞傳至10代接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞單層長滿后，PBS洗3次，冰甲醇固定15 min，PBS洗3次，0.1%的BSA室溫封閉30 min，棄掉BSA上清液，PBS洗3次，1∶2500倍稀釋后的一抗（SDOW-17，PRRSV的抗N蛋白單克隆抗體，鼠單克隆抗體）37℃孵育2 h，PBS洗5次，1∶500倍稀釋二抗（Alexa Fluor568標(biāo)記羊抗鼠IgG）室溫避光孵育1 h，PBS潤洗5次，置于熒光顯微鏡避光觀察結(jié)果。設(shè)置空載轉(zhuǎn)染細(xì)胞及正常細(xì)胞作為對照。

1.8 蛋白免疫印跡 將PCR鑒定后初步篩選出的細(xì)胞傳至10代收集部分細(xì)胞，用RAPI裂解，經(jīng)5×上樣緩沖液處理后進(jìn)行15%的SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA室溫封閉2 h，1∶2000倍稀釋的一抗（Anti His-Tag Mouse Monoclonal Antibody），37℃孵育2 h，1∶1000倍稀釋的二抗（HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）），37℃孵育45 min，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色后觀察結(jié)果。設(shè)置空載轉(zhuǎn)染細(xì)胞及正常細(xì)胞作為對照。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建和包裝 以PRRSV感染性克隆pGXAM為模板，經(jīng)PCR擴增出含酶切位點及His標(biāo)簽的N蛋白基因序列，長度為384 bp。用XbaⅠ和SalⅠ內(nèi)切酶酶切后的PCR純化產(chǎn)物并克隆至pLenti-CMV-Hygro載體上。經(jīng)過酶切、測序鑒定后得到表達(dá)N蛋白的慢病毒質(zhì)粒pLenti-CMV-N。將慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLenti-CMV-N與VSVG和psPAX2共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并設(shè)置陽性對照pLenti-CMV-GFPHygro。24 h后，陽性對照可以觀察到熒光，表明慢病毒載體中GFP表達(dá)，病毒包裝成功。

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞系的篩選與鑒定 將包裝好的病毒液轉(zhuǎn)導(dǎo)Marc-145細(xì)胞，用潮霉素B篩選后，經(jīng)終點稀釋法將篩選后的細(xì)胞以1個/100μL稀釋到96孔板中，10 d左右可以明顯觀察到細(xì)胞克隆聚集成團(tuán)，篩選得到具有抗性的細(xì)胞株。抽提細(xì)胞DNA及RNA，分別用PCR擴增N蛋白基因序列，經(jīng)凝膠電泳顯示在380 bp左右處有特異性條帶（圖1）。將細(xì)胞傳至10代，間接免疫熒光（indirect immunoinfluscent assay,IFA）試驗可以觀察到篩選的細(xì)胞中有紅色的熒光信號（圖2）。提取細(xì)胞總蛋白，蛋白免疫印跡試驗檢測篩選細(xì)胞在15 kDa左右處有目的條帶（圖3）。這些結(jié)果表明我們成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)PRRSV N蛋白的Marc-145細(xì)胞系。

圖1 PCR檢測細(xì)胞系中N基因Fig.1 PCR amplification of N gene in cell lines

圖2 免疫熒光鑒定細(xì)胞系N蛋白的表達(dá)Fig.2 Indirect immunoinfluscent assay identification of N protein expression in cell lines

圖3 Western blot 檢測細(xì)胞系N蛋白上標(biāo)簽的表達(dá)Fig.3 Western blot identification of N protein expression in cell lines

3 討論

目前，建立穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞系有多種方法，相對于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞系的方法，慢病毒包裝具有高效的表達(dá)特性[12]。外源基因是否表達(dá)，以及目的蛋白是否具有活性，是鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系是否構(gòu)建成功的重要標(biāo)志[13]。相關(guān)研究表明，綠色熒光蛋白（green fluorescent pntein，GFP）性質(zhì)比較穩(wěn)定、熒光強度高，并且對多數(shù)宿主細(xì)胞沒有明顯的毒害作用，被廣泛地用作載體報告基因[14]。因此本試驗中，慢病毒包裝以及轉(zhuǎn)染時以pLenti-CMV-GFP-Hygro作為陽性對照。當(dāng)GFP基因整合進(jìn)入宿主DNA基因組并表達(dá)時，在倒置熒光顯微鏡下會觀察到GFP熒光，而沒有轉(zhuǎn)染或整合成功的細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下不會觀察到GFP熒光，根據(jù)GFP熒光表達(dá)情況，確定慢病毒的包裝及轉(zhuǎn)染是否成功。His-tag是由6個組氨酸組成的短肽，由于其相對分子質(zhì)量小，利用His標(biāo)簽可以建立一個基于融合蛋白的高效檢測和純化系統(tǒng)[15]。本試驗中，在N蛋白基因序列3′端加上His-tag，通過檢驗標(biāo)簽的表達(dá)從而確定細(xì)胞中N蛋白表達(dá)情況。

目前所應(yīng)用的慢病毒屬于復(fù)制缺陷型病毒，對分裂中和非分裂的細(xì)胞都有很高的感染效率，具有很好的生物安全性，是一種理想的用于篩選穩(wěn)定細(xì)胞系的基因轉(zhuǎn)移載體。建立穩(wěn)定的細(xì)胞系，在基因功能研究、藥物開發(fā)等生物研究中具有重要作用。針對PRRSV的研究，Pujhari等[16]借助構(gòu)建表達(dá)PRRSV GP2的Marc-145細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)GP2蛋白可能有抑制細(xì)胞凋亡的作用，其激活的轉(zhuǎn)錄因子可能是通過激活抗凋亡基因和抑制促凋亡基因的表達(dá)。Song等[17]構(gòu)建缺失部分ORF7的PRRSV感染性克隆，同時構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PRRSV N蛋白的BHK-21細(xì)胞系，將體外轉(zhuǎn)錄的有復(fù)制能力但缺乏繁殖能力的PRRSV病毒樣顆粒轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系，通過反式互補系統(tǒng)，成功拯救出單輪復(fù)制的PRRSV病毒。在這之前，Welch等[18]通過反向遺傳操作技術(shù)分別將PRRSV基因組序中的ORF2和ORF4基因起始密碼子敲除，并將ORF2和ORF4起始密碼子敲除的突變克隆轉(zhuǎn)染在穩(wěn)定表達(dá)PRRSV GP2和GP4蛋白的細(xì)胞系中，拯救出的病毒均在相應(yīng)的互補細(xì)胞中傳代40～50代。雖然拯救的病毒在正常的Marc-145細(xì)胞存在復(fù)制缺陷，但這些復(fù)制缺陷病毒可以進(jìn)入Marc-145和PAM細(xì)胞并表達(dá)病毒蛋白，并且對豬的攻毒試驗也表明具有很好的生物安全性。本試驗構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)PRRSV N蛋白的Marc-145細(xì)胞系，為研究PRRSV蛋白的結(jié)構(gòu)功能和探索新型疫苗提供新思路。