李志行，朱順海，趙其平，韓紅玉，王 璐，劉桂玲，趙煥之，黃 兵，董 輝

（1.上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200234；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241）

泛素（Ubiquitin,Ub）和類泛素（Ubiquitinlikes,UBL）是真核細(xì)胞中的修飾性小分子，通過與靶蛋白共價(jià)結(jié)合實(shí)現(xiàn)蛋白的泛素化或類泛素化?；趯?duì)靶蛋白穩(wěn)定性、定位、活性以及相互作用的調(diào)控，泛素化和類泛素化廣泛參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、囊泡分選、免疫調(diào)節(jié)、炎癥應(yīng)答等細(xì)胞生命活動(dòng)的生理過程[1-4]。部分被泛素化的蛋白會(huì)被泛素-蛋白酶系統(tǒng)（Ubiquitin proteasome system,UPS）識(shí)別，在一系列特定酶的作用下完成降解，進(jìn)而對(duì)維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)具有不可替代的作用。Bedford等[5]通過對(duì)UPS系統(tǒng)中關(guān)鍵分子功能分析后，指出泛素類蛋白及UPS可作為藥物靶點(diǎn)。

雖然寄生蟲Ub/UBL的研究起步相對(duì)較晚，但目前已在剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）、利什曼原蟲（Leishmania spp.）、錐蟲（Trypanosoma spp.）等中發(fā)現(xiàn)。Braun等[6]在研究弓形蟲類泛素化修飾功能時(shí)，發(fā)現(xiàn)類泛素可能與宿主細(xì)胞侵襲和囊腫發(fā)生有關(guān)；Sharma等[7]在研究類泛素在利什曼原蟲發(fā)育過程中的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)類泛素可能在利什曼原蟲早期通過內(nèi)吞體介導(dǎo)血紅素?cái)z取中發(fā)揮作用；Cerqueira等[8]在研究電離輻射對(duì)克氏錐蟲UPS的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)UPS參與克氏錐蟲的DNA損傷修復(fù)過程；Ponts等[9]在分析了UPS在錐蟲、利什曼原蟲、弓形蟲、阿米巴原蟲（Entamoeba spp.）中的作用后，指出UPS可能是一種毒力因子，是一個(gè)可行的寄生蟲治療靶點(diǎn)。雖然關(guān)于UPS作為治療致病性原蟲病新靶點(diǎn)的報(bào)道日趨增多，但至今未見有球蟲泛素特性研究的報(bào)道。

本研究根據(jù)柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella,E.tenella）基因組數(shù)庫（http://www.genedb.org/Homepage/E.tenella）中公布的序列，對(duì)柔嫩艾美耳球蟲泛素（E.tenella Ubiquitin putative，EtUb）（GenBank登錄號(hào)：ETH00031625）基因進(jìn)行了克隆與表達(dá)，分析了EtUb在蟲體不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步分析，研究結(jié)果為深入研究EtUb在球蟲中功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和蟲體 新西蘭白兔購自上海市松江區(qū)松聯(lián)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)場；三黃雞購自上海市奉賢區(qū)，在無球蟲環(huán)境下飼養(yǎng)。柔嫩艾美耳球蟲上海株（資源號(hào)：CAAS 2111160721）由本實(shí)驗(yàn)室保存，經(jīng)雞體內(nèi)大量繁殖，按文獻(xiàn)[10-13]收集并純化未孢子化卵囊（unsporulated oocysts,UO）、孢子化卵囊（sporulated oocysts,SO）、子孢子（sporozoites,SZ）和第二代裂殖子（second generation merozoite,SM）。

1.2 載體、菌株和細(xì)胞 大腸桿菌E.coli TOP10、E.coli BL21購自天根生化科技（北京）有限公司，pGEM-T-easy載體購自美國Promega公司，原核表達(dá)載體pET28a（+）購自Invitrogen公司。乳倉鼠腎細(xì)胞系（baby hamster kidney,BHK）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑與試劑盒 DL2000 DNA marker、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix購自天根生化科技（北京）有限公司；TRIzol、SYBR Green、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ均購自寶生物工程（大連）有限公司；T4 DNA連接酶購自美國Promega公司；DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、雙抗均購自美國Gibco公司；BCA Protein Assay Kit、Protein A/G Agarose、Western試劑及IP細(xì)胞裂解液、DAPI購自碧云天生物技術(shù)有限公司；IRDye?680CW羊抗兔IgG購自Abcam；PageRulerTM Prestained protein ladder購自美國Thermo scientific公司；Alexa FluorTM488 chicken anti-rabbit IgG （H+L）、Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Invitrogen公司；QIAquick Gel Extraction Kit購自QIAGEN公司。

1.4 總RNA提取和cDNA的合成 采用TRIzol法進(jìn)行RNA的總提取，按照試劑的說明書進(jìn)行操作，分別提取UO、SO、SZ、SM的總RNA，經(jīng)1%核酸凝膠電泳檢測RNA純度，用NANODROP 2000C測定濃度，按試劑盒說明去除基因組DNA，用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈。

1.5 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)柔嫩艾美耳球蟲基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.genedb.org/Homepage/Etenella）中EtUb（GenBank登錄號(hào)：ETH00031625）的CDs序列，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)PCR克隆引物、原核表達(dá)引物及定量PCR引物，序列見表1。引物均由上海華津科技有限公司合成。

表1 本研究引物Table 1 Primers used in this study

1.6 目的基因的擴(kuò)增和生物信息學(xué)分析 以1.4中SZ反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，F(xiàn)1、R1為引物，PCR擴(kuò)增大小為777 bp的EtUb基因。PCR反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共34個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%核酸凝膠電泳檢測，將目的條帶按照QIAquick Gel Extraction Kit使用手冊(cè)進(jìn)行回收?；厥盏哪康钠斡肨4 DNA連接酶與pGEM-T-easy載體連接，轉(zhuǎn)入E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，37℃條件下培養(yǎng)12 h，挑取單個(gè)白色菌落置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，菌液經(jīng)PCR鑒定后測序。使用NCBI上的BLAST程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）對(duì)測序獲得的基因序列進(jìn)行比對(duì)和分析，利用ProtParam工具（http://cn.expasy.org/tools/protparam.html）計(jì)算編碼蛋白質(zhì)的理論分子量、等電點(diǎn)等，利用Motif Scan（hppts://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif-scan）分析編碼蛋白的功能位點(diǎn)。

1.7 重組蛋白（recombinant EtUb,rEtUb）的原核表達(dá)與純化 以測序正確的質(zhì)粒為模板，F(xiàn)2、R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段與pET28a（+）載體進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶4℃連接過夜后轉(zhuǎn)入E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，37℃條件下培養(yǎng)12 h，挑取單個(gè)菌落，液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，經(jīng)PCR鑒定后測序。測序結(jié)果正確的菌液重新培養(yǎng)后，用小提質(zhì)粒試劑盒提取測序正確的重組質(zhì)粒，命名為pET28a-EtUb，轉(zhuǎn)入E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞后加入0.1% IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別取加入IPTG0、3、6、8 h后的菌液，超聲破碎后，SDS-PAGE分析rEtUb蛋白表達(dá)形式，用Ni離子親和層析柱純化在上清液中表達(dá)的rEtUb蛋白，BCA法測定濃度后分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 rEtUb蛋白多克隆抗體制備與IgG的純化 采用背部皮下注射的方法免疫2月齡的新西蘭白兔，每次免疫劑量為200 μg/只，初免使用弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，之后進(jìn)行4次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫均使用弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，每次間隔7 d。最后一次加強(qiáng)免疫7 d后采集兔血液，37℃靜置2 h，4℃靜置5 h，3000 ×g離心5 min，吸取上層血清分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取收集的兔血清10 mL過0.45 μm微孔濾膜，收集濾液。使用TBS緩沖液平衡過的protein A/G Agarose柱子中緩慢濾過，用TBS緩沖液再次洗脫柱子，然后依次加入1 mL pH2.7和pH1.9的50 mmol/L的甘氨酸溶液，分別收集濾液，獲得兔抗rEtUb蛋白IgG，命名為Anti-rEtUb-IgG。經(jīng)SDS-PAGE鑒定IgG純度，BCA法測定濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR）以UO、SO、SZ和SM的cDNA為模板，蟲體18S mRNA為內(nèi)參物進(jìn)行qPCR，引物詳見表1。反應(yīng)體系為2 μL，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，用2-ΔΔCt方法計(jì)算蟲體不同發(fā)育階段的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

1.10 Western blot分析 取適量UO、SO、SZ、SM蟲體分別置于1.5 mL離心管中，每管各加200 μL RIPA裂解液重懸，加入2 μL蛋白酶抑制劑和適量玻璃珠，低溫漩渦震蕩30 min，4℃條件下12 000 ×g離心10 min，吸取上清液，用BCA法測定各階段蟲體蛋白濃度。取等量的4個(gè)階段蟲體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后，濕法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂乳37℃封閉2 h，PBS洗滌5 min（3次），用制備的抗rEtUb蛋白血清（1∶100稀釋）作為一抗，抗α-tubulin單克隆抗體（1∶10000）作為內(nèi)參一抗，4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min，用IRDye?680CW羊抗兔IgG（1∶10000稀）作為二抗，37℃條件下避光孵育1 h，PBST洗滌3次，每次5 min，用雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描。

1.11 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測EtUb蛋白在蟲體內(nèi)的分布 將玻片放置在6孔板中，取適量子孢子和第二代裂殖子分別滴加在爬片上風(fēng)干；4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗滌3次，每次5 min；1% Triton X-100室溫通透20 min，PBS洗滌5 min；2%BSA 37℃封閉1 h，PBS洗滌3次，每次5 min；抗rEtUb蛋白血清（1∶100稀釋）作為一抗，4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min；Alexa FluorTM488 chicken anti-rabbit IgG（H+L）（1∶500稀釋）作為二抗，避光孵育1 h，PBST洗滌3次，每次5 min；10 μg/mL DAPI避光孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min。將玻片倒置在滴有抗熒光淬滅劑的載玻片上，熒光顯微鏡觀察。

1.12 rEtUb蛋白多克隆抗體對(duì)子孢子入侵BHK細(xì)胞的影響 將BHK細(xì)胞（20萬/孔）加入24孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將新鮮純化的子孢子按CFDA SE說明書進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記好的子孢子分別置于不同濃度的Anti-rEtUb-IgG（50、100、200、300、400 μg/mL），37℃孵育2.5 h。同樣濃度梯度的陰性兔IgG作為對(duì)照組，不孵育IgG的子孢子作為空白對(duì)照組。孵育好的子孢子離心去除IgG，按BHK細(xì)胞與子孢子1∶3的量，將子孢子依次加入到鋪好細(xì)胞的24孔板中，繼續(xù)避光41℃、5%CO2培養(yǎng)12 h，每個(gè)IgG濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。孵育結(jié)束后棄去上層培養(yǎng)基，PBS洗滌1次；0.25%胰酶消化2 min，吸取消化好的細(xì)胞至于EP管中，1200 ×g離心5 min去除胰酶，PBS洗滌1次；300 μL PBS重懸，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測子孢子入侵率。入侵抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組入侵率/空白組入侵率）×100%，計(jì)算各組子孢子的入侵抑制率。

1.13 EtUb潛在互作蟲體蛋白的篩選 將30 μL protein A/G Agarose加入到1.5 mL的EP管中，低速離心后棄去上層儲(chǔ)存液，加入5 μg純化好的Anti-rEtUb-IgG和200 μg的子孢子全蛋白，同時(shí)設(shè)置陰性兔IgG作為對(duì)照組，置于旋轉(zhuǎn)混合器上，4℃條件下緩慢旋轉(zhuǎn)孵育過夜。免疫共沉淀反應(yīng)結(jié)束后，4℃條件下3000 ×g離心2 min，棄上清液以去除未吸附蛋白，沉淀用1 mL裂解液清洗4次后，加入30 μL的2× SDS上樣緩沖液，沸水浴10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，凝膠用試劑盒進(jìn)行銀染后觀察結(jié)果。將差異條帶送上海厚基生物公司進(jìn)行質(zhì)譜分析，對(duì)獲得的蛋白質(zhì)多肽通過軟件MaxQuant 1.5.5.1檢索與Uniprot中球蟲數(shù)據(jù)庫（uniprot_Eimeria_57748_20181210.fasta，收錄序列57748條），鑒定蛋白，通過比對(duì)兩組之間的差異蛋白，獲得與EtUb潛在相互作用的蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 EtUb基因的擴(kuò)增和生物信息學(xué)分析 以柔嫩艾美耳球蟲子孢子cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測在750～1000 bp位置顯示特異性單一條帶（圖1），與預(yù)期的777 bp一致。擴(kuò)增片段與pGEM-T-easy連接轉(zhuǎn)化后，篩選陽性克隆并測序，所獲得的堿基序列與公布的EtUb基因序列同源性為100%，蛋白序列與E.necatrix、E.mitis、E.brunetti、E.acervulina、E.maxima、E.praecox的EtUb同源性分別為99%、76%、76%、76%、76%、75%，與弓形蟲和環(huán)孢子蟲（Cyclospora cayetanensis）同源性分別為41.71%和61.27%，說明該蛋白在雞球蟲中具有保守性，同時(shí)在頂復(fù)門原蟲中也具有一定的保守性。氨基酸序列分析結(jié)果表明，該蛋白含有258個(gè)氨基酸，分子量28.4 kDa，軟件預(yù)測等電點(diǎn)為4.78，無信號(hào)肽和跨膜區(qū)域。蛋白結(jié)構(gòu)分析表明，該蛋白含有1個(gè)酰胺化位點(diǎn)，4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，4個(gè)磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)N-肉豆蔻酰胺化位點(diǎn)，泛素結(jié)構(gòu)域在90～182氨基酸位置處。

圖1 EtUb基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplification of EtUb gene by PCR

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá) 將帶酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物與pET28a（+）質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后連接，對(duì)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果為陽性（圖2），測序結(jié)果顯示該基因正向插入，無移碼突變，表明重組質(zhì)粒pET-EtUb構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒經(jīng)0.1%IPTG、37℃誘導(dǎo)3 h后獲得了重組蛋白（圖3A），經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)rEtUb主要在上清液中表達(dá)，但rEtUb蛋白分子量明顯大于預(yù)期的28.4 kDa（圖3B）。

圖2 重組質(zhì)粒pET-EtUb的鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET-EtUb

圖3 rEtUb蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of rEtUb protein

2.3 蟲體不同發(fā)育階段中EtUb基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯水平 利用qPCR技術(shù)對(duì)蟲體4個(gè)發(fā)育階段中EtUb基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行相對(duì)定量。結(jié)果顯示，該基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平在第二代裂殖子（second generation merozoite,SM）最高，孢子化卵囊（sporulated oocysts,SO）與子孢子（sporozite,SZ）中次之，未孢子化卵囊（unsporulated oocysts,UO）中最低（圖4A）。對(duì)4個(gè)階段蟲體中EtUb蛋白質(zhì)翻譯水平進(jìn)行Western blot分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白在蟲體各階段都有表達(dá)，且在第二代裂殖子中表達(dá)量最高，子孢子和未孢子化卵囊中次之，未孢子化卵囊中表達(dá)量最低（見圖4B、4C）。

圖4 柔嫩艾美耳球蟲4個(gè)階段中EtUb基因差異表達(dá)情況Fig.4 Transcription and protein levels of EtUb in four development stages of E.tenella

2.4 間接免疫熒光定位實(shí)驗(yàn) 用抗rEtUb兔血清作為一抗，孵育固定過的子孢子和第二代裂殖子，通過熒光顯微鏡觀察EtUb蛋白在子孢子與第二代裂殖子中的分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白主要分布在子孢子與第二代裂殖子的表面，且在頂端有富集現(xiàn)象（圖5A、5B）。

圖5 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測EtUb蛋白在蟲體上的分布Fig.5 Localization of EtUb by indirect immunofluorescence

2.5 體外子孢子入侵抑制實(shí)驗(yàn) 用流式細(xì)胞儀檢測不同濃度Anti-rEtUb-IgG對(duì)子孢子入侵率的影響，結(jié)果顯示，隨著Anti-rEtUb-IgG濃度的升高，子孢子的入侵抑制率明顯升高，在抗體濃度為300 μg/mL時(shí)入侵抑制率達(dá)到36%；而陰性兔IgG組的入侵抑制率變化不明顯（圖6）。

圖6 Anti-rEtUb-IgG體外入侵抑制實(shí)驗(yàn)Fig.6 Anti-rEtUb-IgG invasion inhibition

2.6 EtUb潛在互作蛋白的篩選 通過免疫共沉淀方法（co-immunoprecipitation,Co-IP）篩選與EtUb潛在互作的子孢子蛋白，SDS-PAGE分析后發(fā)現(xiàn)Anti-rEtUb-IgG組與陰性IgG對(duì)照組間有3條明顯的差異條帶（圖7）。質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，AntirEtUb-IgG組有8個(gè)陰性IgG對(duì)照組未出現(xiàn)的蛋白，包括Myosin A、Vacuolar ATP synthase subunit b等蛋白；同時(shí)有2個(gè)差異蛋白，為Microneme protein 3和40S ribosomal protein S18（表2）。

表2 IP篩選到與EtUb潛在互作的蟲體蛋白Table 2 Potential parasite proteins interacting with EtUb screened by IP

圖7 SDS-PAGE分析免疫共沉淀結(jié)果Fig.7 Analysis of immunoprecipitation by SDS-PAGE

3 討論

球蟲病是現(xiàn)代集約化養(yǎng)雞業(yè)中多發(fā)且危害嚴(yán)重疾病之一[14]，據(jù)統(tǒng)計(jì)雞球蟲病每年給全世界范圍內(nèi)家禽養(yǎng)殖業(yè)造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)5億英鎊[15]。目前，雞球蟲病的防治主要依靠抗球蟲藥物和疫苗免疫[16-17]，然而長期使用化學(xué)藥物致使球蟲耐藥性的問題日趨嚴(yán)重，市場上現(xiàn)有球蟲苗的數(shù)量有限，可選擇性低，因此尋找新的藥物靶點(diǎn)成為治療球蟲病的關(guān)鍵。Ub/UBL普遍存在于真核細(xì)胞內(nèi)，通過泛素化蛋白廣泛調(diào)節(jié)代謝活動(dòng)，從而維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。了解球蟲泛素化的過程，對(duì)探索抗球蟲藥物新靶點(diǎn)具有重要意義。

為了揭示EtUb在球蟲中的作用，本研究以柔嫩艾美耳球蟲子孢子cDNA為模板，成功克隆了EtUb基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示該基因的蛋白列與E.necatrix、E.mitis等其他雞球蟲具有75%～99%的同源性，表明該蛋白在艾美耳球蟲中具有保守性。對(duì)其表達(dá)形式進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在0.1%IPTG條件下誘導(dǎo)3 h可獲得表達(dá)量較高的重組蛋白，且在上清液中表達(dá)，這可能與EtUb蛋白氨基酸鏈較短，蛋白折疊后形成的結(jié)構(gòu)親水性較高有關(guān)。凝膠電泳結(jié)果顯示，所獲得重組蛋白的條帶大小大于預(yù)期的32 kDa，這可能與重組蛋白含有的標(biāo)簽蛋白有關(guān)，由于His標(biāo)簽是由6個(gè)組氨酸組成，堿性較大，導(dǎo)致重組蛋白在凝膠電泳中遷移速率降低[18]，因而rEtUb蛋白顯示結(jié)果比預(yù)期大，具體原因有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

本次實(shí)驗(yàn)通過qPCR和Western blot分析發(fā)現(xiàn)，EtUb基因在第二代裂殖子中mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)翻譯水平最高。在球蟲生活史中，第二代裂殖子在雞腸上皮細(xì)胞內(nèi)寄生，處于蟲體的裂殖生殖階段，與發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)代謝活躍，新合成蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中折疊錯(cuò)誤率增大，UPS活性增強(qiáng)。另外，已有文獻(xiàn)指出，泛素化途徑參與微管蛋白和細(xì)胞骨架蛋白的重排[19]，在裂殖生殖過程中，微管蛋白和骨架蛋白需要在新產(chǎn)生的蟲體內(nèi)部重新排布，因此我們推測該蛋白在第二代裂殖子中的高表達(dá)，對(duì)維持第二代裂殖子中蛋白質(zhì)平衡和新合成蛋白質(zhì)的定位具有重要意義。

Silmon等[20]在研究弓形蟲泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)，發(fā)現(xiàn)泛素化蛋白絕大多數(shù)定位在內(nèi)膜復(fù)合物（inner membrane complex,IMC）上，IMC是子孢子與第二代裂殖子中的一種特殊結(jié)構(gòu)，由中層膜和內(nèi)膜緊密附貼形成，分布在蟲體的表面，這與本實(shí)驗(yàn)中的間接免疫熒光定位結(jié)果相一致。IMC作為寄生蟲肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白運(yùn)動(dòng)的錨，促進(jìn)滑行運(yùn)動(dòng)和侵襲，也是復(fù)制過程中子代細(xì)胞形成的支架[21]。因此推測EtUb可能參與蟲體入侵宿主細(xì)胞的過程。后續(xù)的體外入侵抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Anti-rEtUb-IgG對(duì)子孢子入侵BHK細(xì)胞具有一定的抑制作用。這可能是加入Anti-rEtUb-IgG后，一方面抑制了UPS的部分功能，蟲體內(nèi)部蛋白平衡被打破，子孢子活性下降；另一方面，Anti-rEtUb-IgG結(jié)合IMC上的部分蛋白，限制其在入侵過程中的功能發(fā)揮，從而使蟲體入侵能力下降。

利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)篩選獲得了10個(gè)與EtUb潛在互作的蛋白，其中Myosin A是一種肌球蛋白，其具有一定酶活性，可以通過水解ATP的能量分子將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，在頂復(fù)門原蟲中Myosin參與蟲體的滑行及入侵過程[22]；同時(shí)Myosin A也是一種骨架蛋白參與細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)冗^程[23]。MIC3是頂復(fù)門原蟲中微線體分泌的一種重要的入侵相關(guān)蛋白，其主要分布在蟲體的頂端表面上，參與蟲體的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)過程，對(duì)蟲體黏附宿主細(xì)胞具有重要作用[24]。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們將對(duì)獲得的蛋白與EtUb間的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以獲得真正能與EtUb發(fā)生相互作用的子孢子蛋白。

綜上，本研究通過對(duì)EtUb蛋白功能的初步探索，發(fā)現(xiàn)EtUb在第二代裂殖子中高表達(dá)，其抗體可明顯抑制球蟲子孢子的入侵，共篩選出10個(gè)與rEtUb潛在互作的分子，結(jié)果為深入研究EtUb在球蟲中的功能作用奠定基礎(chǔ)。