田靜 張學(xué)輝 車奎 遲靜薇 王顏剛

[摘要] 目的 研究異葒草素對(duì)2型糖尿病（T2DM）合并非乙醇性脂肪肝小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 雄性C57BL/6J小鼠通過腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）和喂養(yǎng)60%的高脂飼料制備T2DM合并非乙醇性脂肪肝模型。成模小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組和異葒草素低、中、高劑量組，異葒草素低、中、高劑量組分別按10、20、40 mg/kg劑量腹腔注射給藥。8周后處死小鼠采集血及肝組織標(biāo)本。用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠空腹血清血糖（FBG）水平;油紅O染色觀察肝組織脂滴沉積;比色試劑盒檢測(cè)肝組織總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、游離脂肪酸（FFA）含量，以及總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）水平;Western blotting檢測(cè)肝組織轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子（Nrf-2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體2（GLUT2）蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 與模型對(duì)照組相比較，異葒草素處理各組小鼠的肝組織脂滴沉積明顯減少，TC、TG、FFA含量顯著降低（F=62.612～882.536，P<0.001）;血清FBG顯著降低（F=1 183.454，P<0.001）;肝組織中T-AOC、SOD、CAT、GSH等抗氧化指標(biāo)水平顯著升高（F=49.356～1 869.515，P<0.001），而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平顯著降低（F=287.756，P<0.001）;肝組織中Nrf-2、HO-1、GLUT2蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.560～42.410，P<0.01）。結(jié)論 異葒草素一方面通過激活Nrf-2/HO-1信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激，另一方面通過增加肝臟GLUT2蛋白表達(dá)降低血糖、減輕胰島素抵抗，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)T2DM合并非乙醇性脂肪肝小鼠的保護(hù)效應(yīng)。

[關(guān)鍵詞] 異葒草素;糖尿病，2型;非乙醇性脂肪性肝病;氧化性應(yīng)激;葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2型;小鼠

[中圖分類號(hào)] R587.1;R575.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2022）01-0007-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.006

隨著生活水平的提高，2型糖尿?。═2DM）的患病率逐年增加。流行病學(xué)調(diào)查顯示，T2DM病人非乙醇性脂肪肝（NAFL）的發(fā)生率高達(dá)49%～62%[1]。與單純T2DM病人比較，合并NAFL的T2DM病人的血糖水平更高、波動(dòng)更大、更難控制，心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也增加。NAFL可能進(jìn)一步進(jìn)展為肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝癌，嚴(yán)重威脅人類健康[2-3]。異葒草素（ISO）是一種木犀草素糖苷類黃酮化合物，其分子式為C21H20O11，分子量為448.38，微溶于甲醇溶劑。ISO廣泛存在于竹茹、竹葉、西番蓮、集花龍膽、葫蘆果、滿天星、決明子、黃荊、蕎麥芽等多種植物的食用或藥用部位[4-11]。研究表明，ISO具有抗炎、抗氧化、抗病毒等作用[12-14]。此外，ISO還具有保肝、降糖及調(diào)脂作用[6，15-16]。但I(xiàn)SO的具體作用機(jī)制目前尚未有深入研究。本實(shí)驗(yàn)采用高脂高糖飼養(yǎng)及腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）方法構(gòu)建T2DM合并NAFL小鼠模型，研究ISO的保肝作用并探討其作用機(jī)制，以期為T2DM合并NAFL的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

SPF級(jí)4～5周齡雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量（25±3）g，購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006）。ISO（純度>98%），購(gòu)自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司;STZ購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司;總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、游離脂肪酸（FFA）、總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）比色法試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子（Nrf-2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體2（GLUT2）和β-actin抗體及二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;顯影液購(gòu)自美國(guó)MILLIPORE公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立與藥物干預(yù) SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠60只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)選取12只作為正常對(duì)照組，給予普通飼料喂養(yǎng);其余48只小鼠使用60%的高脂飼料喂養(yǎng)4周，然后連續(xù)5次腹腔注射小劑量（30 mg/kg）STZ，1周后檢測(cè)隨機(jī)血糖連續(xù)2次大于16.7 mmol/L診斷為T2DM小鼠。再繼續(xù)用60%的高脂飼料喂養(yǎng)4周，構(gòu)建T2DM合并NAFL模型。將造模成功的T2DM合并NAFL小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組和ISO低、中、高劑量組，每組12只。ISO低、中、高劑量組分別按10、20、40 mg/kg劑量腹腔注射給藥;正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等量的5 g/L羧甲基纖維素鈉腹腔注射。建模成功當(dāng)天記作第0天，每周檢測(cè)空腹血糖（FBG）水平，給藥8周后處死小鼠，留取血及肝組織標(biāo)本待檢。

1.2.2 油紅O染色觀察肝組織脂肪樣變性 處死小鼠后立即取出部分肝臟組織，用OCT包埋劑包埋后冷凍切片，將冷凍切片復(fù)溫干燥，置固定液中固定，自來水沖洗。入油紅染液中浸染8～10 min，取出切片背景分化后浸入蘇木精中復(fù)染3～5 min，純水浸洗，分化液分化，蒸餾水沖洗，返藍(lán)液返藍(lán)，自來水浸洗，甘油明膠封片。光鏡下采集圖像并觀察各組肝組織細(xì)胞脂滴沉積情況。

1.2.3 血清FBG檢測(cè) 末次干預(yù)后小鼠禁食12 h眼球采血收集血樣，離心收集血清并進(jìn)行分裝，配制工作試劑，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)置相應(yīng)參數(shù)，上樣，全自動(dòng)生化分析儀自動(dòng)測(cè)定FBG值。

1.2.4 肝組織脂質(zhì)和氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 新鮮肝臟組織用超聲勻漿，取上清，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。

按照比色試劑盒操作步驟檢測(cè)TC、TG、FFA的含量以評(píng)估肝組織脂質(zhì)水平，檢測(cè)T-AOC、SOD、CAT、GSH、MDA水平以評(píng)估細(xì)胞內(nèi)抗氧化狀態(tài)。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)肝組織中Nrf-2、HO-1、GLUT2蛋白的表達(dá) 用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液裂解肝組織，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。按每泳道50 μg蛋白量上樣到SDS聚丙烯酰胺凝膠中，80 V恒壓電泳10～15 min，120 V恒壓電泳約1 h;將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用50 g/L的牛奶封閉液封閉2.5 h;分別加入一抗（Nrf-2、HO-1、GLUT2的稀釋比均為1∶1 000）4 ℃冰箱孵育過夜，以TBST洗膜3次，每次10 min;分別加入二抗（稀釋比1∶2 000）室溫下脫色搖床孵育1.5 h，以TBST洗膜3次，每次10 min;應(yīng)用顯影液在生物分子成像儀（LAS 500，美國(guó)GE公司）中進(jìn)行曝光顯影。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度值分析，結(jié)果以目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以[AKx-D]±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni（B）檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般狀況及肝組織病理學(xué)改變

一般狀況：正常對(duì)照組小鼠活動(dòng)狀態(tài)良好、行為敏捷，飲水及進(jìn)食正常，皮毛光滑整潔;模型對(duì)照組小鼠活動(dòng)明顯減少，飲水及進(jìn)食明顯增加，尿量明顯增多，脫毛;ISO低、中、高劑量組小鼠的一般狀況與模型對(duì)照組相比有不同程度改善，以中、高劑量組改善比較明顯。

油紅O染色結(jié)果：正常對(duì)照組小鼠肝組織未見脂滴沉積;模型對(duì)照組小鼠肝組織可見彌漫性紅色脂滴形成，數(shù)量頗多;ISO低、中、高劑量組小鼠脂滴沉積較模型對(duì)照組逐漸減少，以中、高劑量組減少較顯著。見圖1。

2.2 小鼠血糖及肝組織脂質(zhì)水平變化

模型對(duì)照組小鼠的血清FBG水平以及肝組織TG、TC、FFA含量較正常對(duì)照組顯著增加，ISO低、中、高劑量組小鼠血清FBG水平以及肝組織TG、TC、FFA含量較模型對(duì)照組顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=62.612～1 183.454，P<0.001）。且ISO作用呈劑量依賴性。見表1。

2.3 小鼠肝組織氧化應(yīng)激水平變化

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠肝組織中T-AOC、SOD、CAT、GSH等抗氧化指標(biāo)水平顯著降低，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平顯著升高;與模型對(duì)照組相比，ISO低、中、高劑量組小鼠肝組織中T-AOC、SOD、CAT、GSH水平顯著升高，MDA水平則顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=49.356～1 869.515，P<0.001）。且ISO作用具有明顯的劑量依賴性。見表2。

2.4 小鼠肝組織Nrf-2、HO-1、GLUT2蛋白表達(dá)水平變化

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠肝組織中Nrf-2、HO-1、GLUT2蛋白的表達(dá)水平顯著降低;與模型對(duì)照組相比，ISO低、中、高劑量組小鼠肝組織中Nrf-2、HO-1及GLUT2蛋白的表達(dá)水平顯著增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.560～42.410，P<0.01）。ISO對(duì)Nrf-2及GLUT2蛋白表達(dá)水平的增高作用呈明顯的劑量依賴性，但對(duì)HO-1蛋白表達(dá)的增高作用無劑量依賴性。見圖2、表3。

3 討 論

T2DM病人NAFL的發(fā)病率逐年增高[1]，而且T2DM和NAFL高度相關(guān)，互為因果，從而導(dǎo)致疾病進(jìn)一步加重，嚴(yán)重威脅生命健康[17]。T2DM合并NAFL的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前學(xué)術(shù)界廣泛接受的學(xué)說是“二次打擊”學(xué)說：首次打擊是以胰島素抵抗為主要原因?qū)е碌闹|(zhì)在肝細(xì)胞胞質(zhì)中的沉積;再次打擊為氧化應(yīng)激反應(yīng)，指在首次打擊的基礎(chǔ)上，由活性氧（ROS）誘導(dǎo)發(fā)生在肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的一系列炎癥反應(yīng)[18-19]。持續(xù)的炎癥反應(yīng)會(huì)進(jìn)一步加重胰島素抵抗，從而促進(jìn)T2DM合并NAFL的疾病進(jìn)展[20-21]。因此，改善胰島素抵抗、抗氧化是延緩T2DM合并NAFL疾病進(jìn)展的重要措施。

ISO是一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、保肝、降糖及調(diào)脂作用[12-16]。本實(shí)驗(yàn)通過高脂高糖飲食及腹腔注射STZ建立T2DM合并NAFL模型，同時(shí)應(yīng)用ISO處理成模小鼠。結(jié)果顯示，ISO處理的成模小鼠肝組織TG、TC、FFA及血清FBG水平均顯著下降，肝組織脂滴沉積明顯減少甚至消失，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA（可以間接反映體內(nèi)氧自由基的水平）水平明顯降低，而肝組織抗氧化體系T-AOC、SOD、CAT、GSH水平顯著增高。表明ISO能改善T2DM合并NAFL模型小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，降低其FBG，抑制肝臟的氧化應(yīng)激。

研究表明，NAFL是由于慢性脂質(zhì)沉積導(dǎo)致的肝臟脂毒性炎癥病變，其主要介導(dǎo)機(jī)制是胰島素抵抗和氧化應(yīng)激[18-19]。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)其抗氧化系統(tǒng)被激活，Nrf-2是抗氧化體系中一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子[22]。Nrf-2在肝臟中高表達(dá)，生理狀態(tài)下，Nrf-2存在于肝細(xì)胞胞漿中與其分子伴侶Keap1結(jié)合處于無活性狀態(tài)，當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf-2和Keap1解離，Nrf-2發(fā)生核轉(zhuǎn)位與抗氧化反應(yīng)原件（ARE）上的GCTGAGTCA位點(diǎn)相結(jié)合，啟動(dòng)抗氧化酶基因表達(dá)（包括HO-1、SOD及CAT等），最終導(dǎo)致肝細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[23]。前期研究表明，Nrf-2基因缺失可加重氧化應(yīng)激觸發(fā)的細(xì)胞毒性[24]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)照組氧化應(yīng)激導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平較正常對(duì)照組明顯增高，抗氧化體系T-AOC、SOD、CAT、GSH水平明顯降低，說明氧化體系與抗氧化體系失衡，存在嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)。而經(jīng)ISO處理的模型小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平較模型對(duì)照組明顯降低，抗氧化體系T-AOC、SOD、CAT、GSH水平明顯增高，說明ISO小鼠肝組織氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯減輕。同時(shí)，模型對(duì)照組小鼠肝組織抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路Nrf-2/HO-1中的相關(guān)蛋白Nrf-2、HO-1表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯降低，而經(jīng)ISO處理的模型小鼠肝組織Nrf-2、HO-1蛋白的表達(dá)量較模型對(duì)照組明顯增高，說明ISO通過激活Nrf-2/HO-1信號(hào)通路而起到抗氧化作用，從而減輕T2DM合并NAFL發(fā)病機(jī)制中的“第二次打擊”。有研究表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致肝臟胰島素抵抗發(fā)生的機(jī)制[25-27]，因此ISO也間接減輕了T2DM合并NAFL發(fā)病機(jī)制中的“第一次打擊”。

有研究表明，高脂高糖飲食除了可以誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA及ROS之外，還可導(dǎo)致胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路異常，誘發(fā)胰島素抵抗[28-29]。另有研究表明，抗氧化劑可干預(yù)這一過程，改善胰島素抵抗[30-32]。GLUT2是肝臟重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，當(dāng)機(jī)體處于高糖刺激時(shí)可促進(jìn)葡萄糖自血漿進(jìn)入胞質(zhì)[33-35]。T2DM時(shí)肝臟葡萄糖代謝紊亂可致肝臟GLUT2水平降低，說明糖尿病大鼠肝糖原含量減少與GLUT2表達(dá)下調(diào)有關(guān)[36-37]。PI3K/Akt信號(hào)通路是經(jīng)典的胰島素信號(hào)通路，此通路激活后可促進(jìn)肝臟GLUT2的轉(zhuǎn)運(yùn)，增加肝糖原合成，抑制肝糖原分解，降低血糖濃度，減輕T2DM病人胰島素抵抗[36，38]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)照組小鼠肝組織中GLUT2蛋白的表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照組，而經(jīng)ISO處理后模型小鼠肝組織中GLUT2蛋白的表達(dá)量顯著提高。GLUT2蛋白表達(dá)量提高可以促進(jìn)肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取，增加肝糖原合成，進(jìn)一步緩解T2DM合并NAFL小鼠肝臟胰島素抵抗，從而降低血糖水平以及減少以胰島素抵抗為中心的肝臟脂質(zhì)沉積，改善NAFL病情。

綜上所述，ISO能夠減輕T2DM合并NAFL小鼠肝臟的氧化應(yīng)激、胰島素抵抗及降低血糖，從而延緩T2DM合并NAFLD進(jìn)展、減輕病情。其機(jī)制與激活Nrf-2/HO-1信號(hào)通路，增加肝臟GLUT2蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究為ISO作為一種治療T2DM合并NAFL的新藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但I(xiàn)SO改善T2DM合并NAFL小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的具體分子機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步深究。

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（本文編輯 馬偉平）

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