平 華, 趙 芳, 李 成, 王北洪, 孔紅玲, 李 楊, 馬智宏*

(1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究中心, 北京 100097; 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(北京), 北京 100097)

草甘膦(GLY)和草銨膦(GLUF)均為滅生性除草劑,在世界范圍內(nèi)廣泛用于農(nóng)業(yè)及非農(nóng)業(yè)用地除草[1]。GLY和GLUF的大量使用在給農(nóng)業(yè)增產(chǎn)的同時,勢必會在土壤中累積,造成土壤污染,影響土壤微生態(tài)環(huán)境,還會通過淋溶遷移到地下水中[2-4]。Silva等[5]對歐盟成員國300份土壤樣品進行監(jiān)測發(fā)現(xiàn),45%的樣品中檢出了GLY和氨甲基膦酸(AMPA)殘留。近年來,僅有少數(shù)學(xué)者對國內(nèi)土壤中GLY和GLUF進行了監(jiān)測,也檢出了GLY、AMPA及GLUF殘留[6-8],這與土壤中GLY、GLUF及其代謝物檢測困難有一定的關(guān)系。

由于GLY、GLUF及其代謝物均為強極性化合物,缺少發(fā)色和熒光基團,采用常規(guī)的檢測技術(shù)對其進行定性定量分析難度較大[6,9]。目前,文獻中報道的GLY、GLUF及其代謝物的測定方法主要有氣相色譜法[10]、液相色譜法[11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13]、離子色譜法[14,15]、毛細管電泳法[16]等,涉及的檢測對象以植物源性食品或者水樣居多。關(guān)于土壤中的檢測方法相對較少,目前國內(nèi)僅有一項關(guān)于土壤中GLY的檢測標準[17]。這是由于土壤中的有機質(zhì)、腐殖酸、金屬氧化物及重金屬離子等對GLY、GLUF及其代謝物有很強的吸附和絡(luò)合作用,導(dǎo)致其在土壤中提取困難[3,7,18,19]。文獻及標準中土壤中GLY、GLUF檢測前處理多采用衍生化方法,但是衍生化方法存在步驟繁瑣、耗時長、重復(fù)性差、須嚴格控制操作條件、對分析人員要求高等問題[3,11,20]。與衍生化方法相比,非衍生化方法具有操作簡便、重復(fù)性好的優(yōu)點。近年來,孫文閃等[7]和周芹等[21]分別采用水-二氯甲烷、磷酸鈉-檸檬酸三鈉作為提取溶劑,非衍生化-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法測定土壤中GLY及其代謝物AMPA和GLUF等3種化合物,但是這兩種方法均需要過固相萃取小柱凈化,步驟繁瑣,且成本較高。目前關(guān)于土壤中GLY、AMPA、GLUF及其代謝物N-乙?；?草銨膦(NAG)、3-(甲基膦基)丙酸(MPP)等5種化合物同時測定的方法尚未見報道,因此有必要建立一套實施方便、試驗成本低、靈敏度高、重復(fù)性好的快速同時測定土壤中GLY、GLUF及其代謝物等5種化合物的檢測技術(shù)。

本文采用氨水作為提取溶劑,無須過固相萃取小柱凈化,無須衍生化處理,以HILIC色譜柱為分離柱,實現(xiàn)了不同有機質(zhì)含量土壤中GLY、AMPA、GLUF、MPP和NAG等5種化合物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速同時測定。該方法具有簡單、快速、前處理無須有機試劑、綠色環(huán)保、成本低、準確度和靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點,可以滿足不同有機質(zhì)含量土壤樣品的批量檢測,為研究其在土壤中的殘留狀況和環(huán)境行為提供可靠的技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY超高效液相色譜儀(美國Waters公司); Xevo TQ-S三重四極桿質(zhì)譜儀,配有電噴霧電離(ESI)源(Waters公司); 3K30高速冷凍離心機(美國Sigma公司); Classic UF純水機(美國Pall公司);水浴恒溫振蕩器(上海旻泉儀器有限公司); 0.2 μm微孔過濾膜(美國Gelman Laboratory公司);乙腈(HPLC級,美國Fisher公司);氨水(色譜純,上海阿拉丁試劑公司);十八烷基鍵合硅膠(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)(天津博納艾杰爾科技有限公司)。

GLY(純度98.6%)、GLUF(純度99.2%)、AMPA(純度99.0%)、NAG(純度97.4%)、MPP(質(zhì)量濃度100 mg/L)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。將5種除草劑標準品分別用純水配成10.0 mg/L標準儲備液,實驗時用土壤空白基質(zhì)溶液配成不同質(zhì)量濃度的工作液。

方法學(xué)考察試驗用空白土壤樣品采自北京市順義區(qū)某桃園,低有機質(zhì)含量樣品(有機質(zhì)含量為2.89%, pH值為7.0,陽離子交換量為12.3 cmol/kg),高有機質(zhì)含量樣品(有機質(zhì)含量為7.38%, pH值為7.1,陽離子交換量為13.0 cmol/kg)。

1.2 樣品前處理方法

稱取土壤5 g(過60目篩)于50 mL離心管中,加入0.5 mol/L氨水溶液20 mL,渦旋混勻,置于水浴恒溫振蕩器中于50 ℃加熱振蕩提取60 min,在4 ℃下10 000 r/min離心5 min,取上清液過0.2 μm濾膜,HPLC-MS/MS測定。

土壤空白基質(zhì)溶液制備:選取空白土壤(不含目標化合物的土壤)按照上述前處理方法進行提取后,離心,取上清液過0.2 μm濾膜,即得。

1.3 分析方法

1.3.1高效液相色譜條件

色譜柱:Dikma Polyamino HILIC(150 mm×2.0 mm, 5 μm);色譜柱溫:40 ℃;樣品室溫度:10 ℃;進樣體積:10 μL;流動相A:水相(0.2 mmol/L乙酸銨+0.07%氨水溶液),流動相B:乙腈,流速為0.25 mL/min;梯度洗脫條件:0～1.0 min, 25%A; 1.0～2.0 min, 25%A～95%A; 2.0～9.0 min, 95%A。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源:ESI源;掃描方式:負離子模式;監(jiān)測模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;毛細管電壓:2.5 kV;霧化氣溫度:500 ℃;去溶劑氣流量:1 000 L/h;碰撞氣流量:0.20 mL/min;離子源溫度:150 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC-MS/MS條件優(yōu)化

分別對5種化合物的質(zhì)譜條件進行了優(yōu)化,包括錐孔電壓、碰撞能量、毛細管電壓等,使每種化合物的母離子與特征碎片離子強度達到最大,將響應(yīng)值最大的碎片離子設(shè)定為定量離子,次級響應(yīng)離子為定性離子,優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 5種化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS parameters for the five compounds

GLY和GLUF及其代謝物極性均較強,在常規(guī)反相色譜柱上保留較小,因此應(yīng)選擇親水色譜柱進行分離。實驗中分別比較了Restek Polar X離子色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm)、ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和Dikma Polyamino HILIC色譜柱(150 mm×2.0 mm, 5 μm)對5種化合物色譜峰形、響應(yīng)值、出峰時間的影響。結(jié)果表明,GLY、GLUF及其代謝物在HILIC色譜柱上峰形良好,且響應(yīng)值高,因此最終選擇了HILIC色譜柱。

考察了流動相、柱溫、流速及梯度洗脫條件對目標化合物峰形、響應(yīng)值和離子化效率的影響。其中,流動相組成是一個重要的影響因素,分別考察了水相中加入不同濃度乙酸銨及不同比例氨水對色譜峰形及響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明,水相中加入0.2 mmol/L乙酸銨和0.07%氨水時有助于目標化合物離子化,響應(yīng)值最高。最終優(yōu)化后的流動相條件為水相(0.2 mmol/L乙酸銨+0.07%氨水溶液)和乙腈。各個化合物在MRM模式下的色譜圖見圖1。

圖 1 5種化合物在MRM模式下的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the five compounds under MRM mode

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的優(yōu)化

考察了不同提取溶劑對GLY、GLUF及其代謝物提取效率的影響。分別選擇純水、水-乙腈(1∶1, v/v)、檸檬酸鹽緩沖溶液(4%檸檬酸鈉、2%檸檬酸氫二鈉)、氨水作為溶劑,結(jié)果表明,氨水提取和檸檬酸鹽提取回收率無明顯差別,其余溶劑提取回收率均較低。這是由于GLY、GLUF及其代謝物為酸性,采用堿性溶液作為提取溶劑,有利于將被土壤有機質(zhì)結(jié)合的GLY、GLUF及其代謝物變成離子形態(tài),從土壤中游離出來,可以有效降低土壤對目標化合物的吸附,從而提高回收率。文獻[21,22]采用磷酸鈉、檸檬酸三鈉作為提取溶劑,發(fā)現(xiàn)隨著提取液pH的增加,土壤對GLY和AMPA的吸附量減少,提取效率變高,此結(jié)果與前人研究結(jié)果相一致?？紤]到檸檬酸鹽為不揮發(fā)性鹽,進入質(zhì)譜后會在離子源部分結(jié)晶、沉積,影響目標化合物電離,需要經(jīng)常清洗和保養(yǎng)。由于氨水具有揮發(fā)性,可以直接進入質(zhì)譜,省去轉(zhuǎn)換溶劑的步驟,因此選用氨水作為提取溶劑?？疾炝瞬煌瑵舛劝彼芤?0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3 mol/L氨水)對GLY、GLUF及其代謝物色譜峰形、響應(yīng)值和回收率的影響(見圖2)。結(jié)果表明,采用0.5 mol/L和1.0 mol/L氨水溶液提取5種化合物,回收率均在70%～120%之間,從節(jié)省試劑的角度出發(fā),最終選擇0.5 mol/L氨水溶液作為提取溶劑;在該條件下,5種目標化合物在質(zhì)譜中的離子化效率高,響應(yīng)值高,而且峰形好。

圖 2 氨水濃度對GLY、GLUF及其代謝物回收率的影響Fig. 2 Effect of ammonia concentrations on the recoveries of GLY, GLUF and its metabolites

圖 3 提取溫度對GLY、GLUF及其代謝物回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of extraction temperature on the recoveries of GLY, GLUF and its metabolites (n=3)

2.2.2凈化方法的優(yōu)化

目前常用的凈化方法有分散固相萃取法和固相萃取法。C18和PSA是農(nóng)藥殘留凈化中常用的分散固相萃取吸附劑,分別考察了這兩種吸附劑對5種化合物回收率的影響。C18主要用于吸附脂類和甾醇類等非極性化合物,實驗發(fā)現(xiàn)C18凈化和未凈化無明顯差別,這說明提取液中的疏水性基質(zhì)對目標化合物的檢測無明顯影響。PSA凈化后回收率低,這是由于目標化合物含有羧基、膦酸基等基團,PSA在吸附提取液中極性色素、有機酸、脂肪酸等雜質(zhì)的同時,對目標化合物也產(chǎn)生了吸附[6,23]。固相萃取法中常將HLB固相萃取小柱用于GLY等極性化合物檢測的樣品凈化,可以有效地去除色素、脂肪及蛋白質(zhì)等雜質(zhì)[7,21]。對于提取液過HLB固相萃取小柱和不過小柱做了對比試驗,發(fā)現(xiàn)回收率無明顯差異;過HLB柱后,GLUF和NAG的基質(zhì)效應(yīng)反而增強;而且采用固相萃取柱凈化成本高,操作復(fù)雜,不適用于大批量樣品檢測。為節(jié)省成本,滿足大批量樣品快速測定的需要,因此最終選擇不使用吸附劑和固相萃取小柱進行凈化。

2.2.3提取溫度的優(yōu)化

溫度也是影響提取效率的一個因素,該實驗對25、40、50、60、70 ℃ 5個不同提取溫度進行了考察,結(jié)果見圖3。除NAG隨著提取溫度升高回收率不斷提高以外,其他幾種化合物回收率受溫度影響不太明顯。綜合考慮,優(yōu)化后的提取溫度為50 ℃。

2.2.4提取次數(shù)的優(yōu)化

實驗考察了提取1次和提取2次對5種化合物回收率的影響,發(fā)現(xiàn)提取次數(shù)對回收率無明顯影響,因此從提高效率和節(jié)約成本的角度考慮,最終選擇提取次數(shù)為1次。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)(ME)

基質(zhì)效應(yīng)可能會對目標化合物的離子化效率、響應(yīng)值造成影響,這是由于樣品基質(zhì)中存在的其他干擾成分在離子化過程中與目標化合物競爭,表現(xiàn)為增強或者抑制效應(yīng),如果基質(zhì)效應(yīng)強可能會導(dǎo)致目標化合物的定量結(jié)果不準確[24]。基質(zhì)效應(yīng)計算方法見公式(1)[25,26]:

(1)

其中,Am為土壤基質(zhì)溶液配制的標準溶液峰面積,As為純?nèi)軇┡渲频臉藴嗜芤悍迕娣e。|ME|≤20%,表明無明顯基質(zhì)效應(yīng);20%<|ME|≤50%,表明基質(zhì)效應(yīng)中等;|ME|>50%,表明對目標化合物有較強的基質(zhì)效應(yīng)。實驗中比較了0.05 mg/L溶劑標準溶液和土壤基質(zhì)標準溶液的峰面積,平行測定6次。結(jié)果表明,GLY、AMPA、GLUF、MPP、NAG基質(zhì)效應(yīng)分別為33.9%、31.0%、8.6%、21.4%、4.7%, GLY、AMPA和MPP表現(xiàn)為中等基質(zhì)效應(yīng),GLUF和NAG無明顯基質(zhì)效應(yīng)。綜合考慮,本實驗中選用基質(zhì)配制標準溶液的方式來進行定量分析,以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表 2 5種化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、 方法檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), method LODs and LOQs of the five compounds

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性范圍與檢出限

配制2.0、5.0、10、50、100、200、500 μg/L的土壤基質(zhì)混合標準溶液,以質(zhì)量濃度(x, μg/L)為橫坐標,峰面積(y)為縱坐標,繪制基質(zhì)標準工作曲線(見表2)。結(jié)果表明,GLY及其代謝物在5.0～500 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,GLUF及其代謝物在2.0～500 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99,可以滿足定量分析的要求。以3倍信噪比計算,GLY及其代謝物的方法檢出限(LOD)為4.0 μg/kg,GLUF及其代謝物的LOD值為2.0 μg/kg;以10倍信噪比計算,GLY及其代謝物的方法定量限(LOQ)為13.3 μg/kg,GLUF及其代謝物的LOQ值為6.7 μg/kg(見表2)。與標準方法相比[17],該方法GLY的線性范圍較寬、檢出限較低。

表 3 低有機質(zhì)含量土壤中5種化合物的加標回收率和 精密度(n=6)Table 3 Spiked recoveries and precisions of the five compounds in soil with low organic matter(n=6)

2.4.2精密度和準確度

由于土壤有機質(zhì)含量是影響GLY、GLUF及其代謝物吸附的主要因素,分別對低有機質(zhì)含量(有機質(zhì)含量在5%以下)和高有機質(zhì)含量(有機質(zhì)含量在5%～10%之間)的土壤樣品按照上述優(yōu)化的實驗方法進行加標回收試驗。分別在不同有機質(zhì)含量的空白土壤樣品中添加0.02、0.05、0.2 mg/kg 3個水平的5種除草劑的混合標準溶液,每個添加水平重復(fù)測定6次,計算平均回收率和相對標準偏差(RSD)。結(jié)果表明,低有機質(zhì)含量土壤中5種化合物的平均加標回收率在74.2%～101%之間,RSD在0.93%～6.8%之間(見表3);高有機質(zhì)含量土壤中5種化合物的平均加標回收率在90.8%～116%之間,RSD在0.40%～7.1%之間(見表4)。說明本方法精密度和準確度良好,對于有機質(zhì)含量在10%以下的土壤均適用,方法穩(wěn)定可靠。

2.4.3與其他方法比較

表5對本方法和文獻方法進行了比較。本方法中GLY和AMPA的LOD值低于絕大多數(shù)文獻中報道的非衍生化方法[7,15,27]。周芹等[21]建立的土壤中GLY和AMPA的非衍生化-UPLC-MS/MS測定方法雖然LOD值低于本方法,但是線性范圍的最低濃度為20 μg/L,高于本方法(5 μg/L);而且前處理需要過HLB固相萃取小柱,操作較繁瑣,成本高,不適用于大批量土壤樣品的快速檢測。目前文獻中報道的非衍生化方法均未注明所用土壤樣品的來源及類型,方法的適用范圍不明確。本文建立的方法可以適用于不同有機質(zhì)含量土壤中GLY、GLUF及其代謝物等5種化合物的同時測定,而且提取液無須過固相萃取小柱凈化,無須衍生化處理,操作步驟簡單,具有檢出限低,準確度高和重復(fù)性好等優(yōu)點。

2.5 實際樣品測定

經(jīng)前期調(diào)研發(fā)現(xiàn),在我國禁用百草枯后,桃園中普遍使用GLY和GLUF除草。采集了20份北京不同桃園的土壤樣品(有機質(zhì)含量在1.47%～8.48%之間),對其GLY、GLUF及其代謝物殘留量進行了測定,進一步驗證該方法的適用性。所有土壤樣品中AMPA、GLY、MPP、GLUF、NAG的檢出率分別為45%、25%、10%、5%、5%,GLY及其代謝物檢出率均高于GLUF及其代謝物,說明在這些桃園中GLY使用較多。AMPA檢出率和含量均高于母體GLY,這是由于AMPA為GLY的主要代謝物,與文獻報道相一致[5,6]。GLY母體最大殘留量為35.2 μg/kg, AMPA最大殘留量為147 μg/kg,檢出GLY母體的土壤樣品都同時檢測出其代謝物AMPA。GLY殘留量以GLY和AMPA殘留量之和計,GLUF殘留量以GLUF、MPP和NAG殘留量之和計,GLY最大殘留量為182 μg/kg,GLUF最大殘留量為187 μg/kg。因此,GLY和GLUF的使用在土壤造成的殘留需要引起一定的關(guān)注。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速同時測定土壤中草甘膦、草銨膦及其代謝物殘留量的方法。與文獻報道的方法相比,該方法具有簡單、快速、前處理無須有機試劑、綠色環(huán)保、成本低、準確度和靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點,可以滿足不同有機質(zhì)含量大批量土壤樣品中草甘膦、草銨膦及其代謝物的快速同時檢測,為研究其在土壤中的殘留狀況和環(huán)境行為提供可靠的技術(shù)支持。