基于鏡像酶正交酶切的蛋白質復合物規(guī)?；珳史治鲂路椒?/h1>
2022-03-09 13:39韓若楠趙麗麗安雨馨張麗華張玉奎1
色譜 2022年3期
韓若楠, 趙麗麗, 安雨馨, 梁 振, 趙 群*, 張麗華, 張玉奎1,
(1. 大連理工大學, 張大煜學院, 遼寧 大連 116024; 2. 中國科學院大連化學物理研究所, 中國科學院分離分析化學重點實驗室, 遼寧 大連 116023; 3. 中國科學院大學, 北京 100049)
蛋白質作為生命活動的執(zhí)行者,通過自身結構的動態(tài)改變,以及與其他蛋白質相互作用組裝為蛋白質復合物,調控各種生物學過程。因此,如何實現蛋白質復合物的精準解析已成為當前生命科學的研究熱點。化學交聯(lián)結合質譜(CXMS)技術作為蛋白質復合物解析的新興技術,利用化學交聯(lián)劑將空間距離足夠接近的蛋白質分子內或分子間的氨基酸殘基以共價鍵連接起來,再利用液相色譜-質譜聯(lián)用對交聯(lián)肽段進行鑒定,實現蛋白質復合物的組成、界面和相互作用位點的解析。該技術具有分析通量高、靈敏度高、可提供蛋白質間相互作用的界面信息、普遍適用于不同種類和復雜程度的生物樣品等優(yōu)勢,已成為X射線晶體衍射[1,2]、低溫冷凍電鏡[3,4]、免疫共沉淀[5,6]等蛋白質復合物研究技術的重要補充。
化學交聯(lián)位點的鑒定覆蓋度和準確度決定著該技術對于蛋白質復合物結構的解析能力。目前,為了實現蛋白質復合物的高覆蓋度交聯(lián),研究人員發(fā)展了可用于共價交聯(lián)賴氨酸(K)的氨基、谷氨酸(E)/天冬氨酸(N)的羧基[7]、精氨酸(R)的胍基[8]以及半胱氨酸(C)的巰基[9]等多種活性基團的新型交聯(lián)劑。進而,為了提高低豐度交聯(lián)肽段的鑒定靈敏度,體積排阻色譜法[10]、強陽離子交換色譜法[11],及親和基團富集策略被提出用于交聯(lián)肽段的高選擇性富集,如可富集型化學可斷裂交聯(lián)劑——Leiker[12],與不具備富集功能的交聯(lián)劑相比,通過親和富集可以將交聯(lián)位點鑒定數目提高4倍以上。此外,為了提高質譜對交聯(lián)肽段的鑒定能力,解決由于交聯(lián)肽段長度過長以及多級交聯(lián)導致的鑒定困難的問題,Leitner等[10]通過對8種標準蛋白質及20S蛋白酶體的交聯(lián)實驗,初步證明多酶酶切方法能夠有效提高交聯(lián)位點的鑒定數目;Zhao等[13]提出了基于“smart cutter”多種酶聯(lián)用的原位順序酶解策略,將大腸桿菌中蛋白質復合物交聯(lián)位點的鑒定數目相對單一胰蛋白酶(trypsin)酶切提高了54%。在交聯(lián)數據分析方面,為提高交聯(lián)位點的解析精度和效率,一系列的CXMS數據解析軟件被開發(fā),包括xQuest[14]、MassMatrix[15]和pLink[16,17]等。其中pLink在充分利用全部碎片離子的基礎上提出了粗細兩步打分策略用來縮減候選肽段規(guī)模,使鑒定速度得到了提高[18]。
上述技術雖然在很大程度上推動了基于CXMS的蛋白質復合物的解析覆蓋度,但是交聯(lián)肽段在質譜中存在多處碎裂,碎片離子形式多樣,且存在交聯(lián)基團與肽段共價連接的特異離子,因此交聯(lián)肽段二級譜圖的碎片離子比常規(guī)肽段的譜圖在種類和數目上更為復雜[16],會造成交聯(lián)肽段鑒定譜圖中碎片離子的匹配數目較少和肽段序列匹配連續(xù)性較差,導致譜圖可信度較低,影響蛋白質復合物交聯(lián)位點的鑒定精準度。
胰蛋白酶鏡像酶(LysargiNase)的酶切位點與胰蛋白酶互為鏡像,可特異地切割賴氨酸和精氨酸的N端。由于LysargiNase的N端酶切特點,電荷主要分布在交聯(lián)肽段的N端,在碰撞誘導裂解(CID)和高能誘導裂解(HCD)模式下產生以b離子為主的碎片離子,與胰蛋白酶酶切肽段以y離子為主的碎片離子互為鏡像補充,為胰蛋白酶酶解肽段在質譜鑒定中b離子缺失嚴重的問題提供了很好的解決辦法[19]。由于具有較高的酶切特異性和酶活性,鏡像酶已經成功地應用于蛋白質C末端蛋白質組鑒定[20]、磷酸化蛋白質組研究[21]、甲基化蛋白質組鑒定等[22]方面,然而在CXMS中的應用仍未見報道。
為進一步提高對蛋白質復合物結構及相互作用位點的解析能力,本文發(fā)展了LysargiNase與胰蛋白酶聯(lián)合酶切的方法,基于鏡像酶正交切割的互補特性,通過產生賴氨酸及精氨酸鏡像分布的交聯(lián)肽段,以增加特征碎片離子數量和肽段匹配連續(xù)性,從而提升交聯(lián)肽段的譜圖鑒定質量,達到提高交聯(lián)位點的鑒定覆蓋度和準確度的目的。通過分別對牛血清白蛋白及大腸桿菌全蛋白樣品的交聯(lián)位點鑒定結果的考察,評價該策略對單一蛋白樣品和復雜細胞裂解液樣品蛋白質復合物表征的應用潛力。
1 實驗部分
1.1 儀器、試劑與材料
蛋白酶抑制劑(cocktail)、二硫蘇糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、牛血清白蛋白(BSA)均購于美國Sigma-Aldrich公司;二(磺基琥珀酰亞胺)辛二酸酯(BS3)購于美國Thermo Fisher公司;胰蛋白酶、胰蛋白酶鏡像酶購于中國華利世公司;BCA試劑盒購自中國碧云天公司;色譜純乙腈(ACN)購自德國Merck公司;所有實驗用水均經過美國Millipore公司購買的Milli-Q系統(tǒng)純化;其他試劑均為分析純。用于質譜分析的分離柱(15 cm, 150 μm i.d., 365 μm o.d.)中裝有購于德國Dr. Maisch公司的ReproSil-Pur C18-AQ顆粒(顆粒大小為1.9 μm;孔徑為12 nm)。熔融石英毛細管(150 μm i.d., 365 μm o.d.)購于中國Sino Sumtech公司;Venusil XBP C18硅膠填料(5 μm, 12 nm)購于中國博納艾杰爾公司;Empore disk C18固相萃取膜片購于美國3M公司;超聲破碎儀購自美國Cole-Parmer公司;真空濃縮儀、超微量分光光度計(Nanodrop one)、Easy-nano LC 1000系統(tǒng)、Q-Exactive質譜儀、Easy-nano LC 1200系統(tǒng)及Orbitrap Fusion Lumos質譜儀均購自美國Thermo Fisher公司。
1.2 實驗方案
1.2.1蛋白質樣品制備
稱取牛血清白蛋白粉末,以20 mmol/L 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES, pH 7.5)作為緩沖體系,配制0.1 mmol/L牛血清白蛋白溶液。
大腸桿菌細胞(種屬K12)在37 ℃下采用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,然后于4 ℃以4 000 g離心2 min,收集細胞沉淀。細胞沉淀采用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍后,懸浮于細胞裂解液(含20 mmol/L HEPES和1%(v/v)蛋白酶抑制劑)中,冰浴超聲破碎180 s(30%能量,10 s開,10 s關)。勻漿液于4 ℃以20 000 g離心40 min,收集上清,采用BCA試劑盒測定所得蛋白質含量。稀釋大腸桿菌蛋白裂解液至蛋白質含量為0.5 mg/mL。
1.2.2化學交聯(lián)樣品制備
以20 mmol/L HEPES(pH 7.5)為溶劑配制濃度為20 mmol/L 的BS3交聯(lián)劑母液;將交聯(lián)劑母液加入牛血清白蛋白的緩沖溶液及大腸桿菌蛋白裂解液中,使交聯(lián)劑的終濃度為1 mmol/L,在室溫條件下反應15 min;通過添加終濃度為50 mmol/L的淬滅溶液NH4HCO3進行交聯(lián)反應淬滅,并在室溫下孵育15 min;在冰浴條件下,將交聯(lián)樣品逐漸滴入8倍體積的預冷丙酮中,于-20 ℃靜置過夜;在4 ℃條件下,以16 000 g轉速離心,去除丙酮,然后將交聯(lián)蛋白用預冷丙酮清洗2次,去除上清液后,于室溫揮發(fā)掉殘余的丙酮;以8 mol/L尿素溶液復溶蛋白質沉淀;將牛血清白蛋白交聯(lián)樣品以5 mmol/LTCEP作為還原劑，于25 ℃下反應1 h進行變性和還原；將大腸桿菌樣品以5 mmol/LDTT作為還原劑，于25 ℃下反應1 h進行變性和還原，避免大腸桿菌蛋白在酸性條件下發(fā)生變性；添加終濃度為10 mmol/L的碘乙酰胺(IAA),在黑暗中,于室溫下反應30 min;以50 mmol/LNH4HCO3稀釋樣品至尿素濃度為0.8 mol/L后,將樣品均分為兩份,一份以蛋白樣品與蛋白酶的質量比呈50∶1的比例加入胰蛋白酶,于37 ℃酶解過夜,另一份加入終濃度為20 mmol/L的CaCl2,以蛋白樣品與蛋白酶的質量比呈20∶1的比例加入LysargiNase,并在37 ℃溫度下酶解過夜。
1.2.3液相色譜-質譜鑒定及數據搜索
上述所有樣品經過除鹽,使用0.1%甲酸(FA)溶液復溶,用超微量分光光度計測定肽段濃度,進行反相高效色譜分離和質譜分析。
牛血清白蛋白樣品采用Easy-nano LC 1000系統(tǒng)偶聯(lián)Q-Exactive質譜儀平臺進行質譜分析。流動相A: 2%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA);流動相B: 98%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脫程序:0～10 min, 2%B～7%B; 10～60 min, 7%B～23%B; 60～80 min, 23%B～40%B; 80～82 min, 40%B～80%B; 82～95 min, 80%B。Q-Exactive質譜儀采用數據依賴性模式,Full MS掃描在Orbitrap上實現,掃描范圍為m/z300～1 800,分辨率為70 000(m/z=200),自動增益控制(AGC)為3×106,最大注入時間(IT)為60 ms,母離子分離窗口為m/z2。MS/MS掃描的分辨率為17 500(m/z=200),碎裂模式為HCD,歸一化碰撞能量(NCE)為35%, MS2從m/z110開始采集,MS2的AGC為5×104, IT為60 ms,僅選擇電荷值為3～7且強度高于1 000的母離子進行碎裂,并將動態(tài)排除時間設置為20 s。每個樣品分析3遍。
大腸桿菌樣品采用EASY-nano LC 1200系統(tǒng)偶聯(lián)Orbitrap Fusion Lumos三合一質譜儀平臺進行質譜分析。流動相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液;流動相B: 80%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脫程序:0～28 min, 5%B～16%B; 28～58 min, 16%B～34%B; 58～77 min, 34%B～48%B; 77～78 min, 48%B～95%B; 78～85 min, 95%B。Orbitrap Fusion Lumos三合一質譜儀采用數據依賴性模式,Full MS掃描在Orbitrap上實現,掃描范圍為m/z350～1 500,分辨率為60 000(m/z=200), AGC為4×105, IT為50 ms,母離子分離窗口為m/z1.6。MS2掃描的分辨率為15 000(m/z=200),碎裂模式為HCD, NCE為30%, MS2從m/z110開始采集,MS2的AGC為5×104, IT為60 ms。僅選擇電荷值為3～7且強度高于2×104的母離子進行碎裂,并將動態(tài)排除時間設置為20 s。每個樣品分析3遍。
質譜數據文件(*.raw)采用pLink 2軟件(2.3.9)對交聯(lián)信息進行檢索和鑒定。使用從UniProt于2019年4月27日下載的牛血清白蛋白序列和大腸桿菌序列,搜索參數如下:酶切方式為胰蛋白酶(酶切位置:K/R的C端)、LysargiNase(酶切位置:K/R的N端);漏切位點個數為3;一級掃描容忍(precursor tolerance)2.00×10-5;二級掃描容忍(fragment tolerance)2.00×10-5;每條肽段的質量范圍為500～1 000 Da;肽段長度的范圍為5～100個氨基酸;固定修飾為半胱氨酸還原烷基化(carbamidomethyl [C]);可變修飾為甲硫氨酸氧化(oxidation [M])、蛋白質N端乙?；?acetyl [protein N-term]);肽段譜圖匹配錯誤發(fā)現率(FDR)≤5%。
圖 1 胰蛋白酶與LysargiNase酶解樣品的交聯(lián)位點在牛血清 白蛋白晶體結構(PDB: 3V03)的映射Fig. 1 Mapping of cross-linked sites obtained from trypsin and LysargiNase digestion on the bovine serum albumin crystal structure (PDB: 3V03)
圖 2 LysargiNase與胰蛋白酶酶解樣品的交聯(lián)位點對及單一交聯(lián)位點的互補性Fig. 2 Complementarity of LysargiNase and trypsin digested cross-linked site pairs and single cross-linked sites a. venn diagram of single cross-linked sites; b. venn diagram of the cross-linked site pairs; c. number of cross-linked site pairs of each single cross-linked site, digested with LysargiNase and trypsin.
2 結果與討論
2.1 標準蛋白質鏡像酶正交酶切產物的交聯(lián)質譜分析
2.1.1基于鏡像酶切的牛血清白蛋白交聯(lián)位點鑒定覆蓋度
以BS3作為交聯(lián)劑對牛血清白蛋白單一模型蛋白體系進行化學交聯(lián),并將交聯(lián)樣品分別采用胰蛋白酶及胰蛋白酶鏡像酶進行酶解,經過質譜鑒定及數據分析,共得到了291對非冗余的交聯(lián)位點信息(見附表1,詳見http://www.chrom-China.com)。將所鑒定的交聯(lián)位點信息與牛血清白蛋白的晶體結構(PDB: 3V03)進行映射,如圖1所示,兩種酶切方式鑒定到的交聯(lián)位點存在一定互補性,初步表明基于鏡像酶正交酶切的交聯(lián)質譜分析策略能提高牛血清白蛋白交聯(lián)位點的鑒定數目。
如圖2a所示,胰蛋白酶酶解鑒定到的交聯(lián)位點的38%(82/216)被LysargiNase共同鑒定;此外,有75對交聯(lián)位點被LysargiNase補充鑒定,占胰蛋白酶鑒定總數35%(75/216)。表明LysargiNase與胰蛋白酶酶解產生的交聯(lián)肽段具有優(yōu)異的互補性。
對兩種酶切方式鑒定到的交聯(lián)位點的互補性進行分析,統(tǒng)計交聯(lián)位點對中的單一交聯(lián)位點的鑒定情況,發(fā)現LysargiNase與胰蛋白酶對單一交聯(lián)位點的鑒定能力并沒有明顯差別,83%(49/59)的位點被二者共同鑒定到(見圖2b)。然而,單一交聯(lián)位點在不同酶切方式所產生的交聯(lián)位點對的鑒定能力不同(見圖2c)。上述結果提示,兩種酶切方式產生的交聯(lián)位點對的互補性很可能源于質譜鑒定過程中對于二維交聯(lián)肽段與線性常規(guī)肽段的不同信號響應。由于交聯(lián)肽段較長,其碎片離子響應相對較差,LysargiNase較胰蛋白酶酶切雖然產生肽段的長度相當,但是由于二者酶切原理不同,K/R分別處在交聯(lián)肽段的N端和C端,使得產生的交聯(lián)肽段的質譜碎裂能力與響應不同,因此LysargiNase與胰蛋白酶聯(lián)合正交酶切的方法,較胰蛋白酶酶解方法,能顯著提高交聯(lián)肽段的鑒定覆蓋度。
圖 3 LysargiNase與胰蛋白酶酶解樣品共同得到的 交聯(lián)位點鑒定打分比較Fig. 3 Comparison of cross-linking site identification scores obtained by both LysargiNase and trypsin digestions
圖 4 b+/++與y+/++離子碎片分別在α/β-肽段的碎片覆蓋度Fig. 4 Fragment coverages of b+/++ and y+/++ ions of α/β-peptides
2.1.2基于鏡像酶切的牛血清白蛋白交聯(lián)位點鑒定準確度
實驗對胰蛋白酶與LysargiNase兩種酶切方式共同鑒定到的交聯(lián)位點對應肽段的譜圖質量進行了考察,以-lg(E-value)值作為打分標準,分值越高對應的譜圖鑒定的準確度越高,反之準確度越低,根據共同鑒定的位點對應的-lg[E-value(LysargiNase)/E-value(trypsin)]考察鏡像酶正交酶切對質譜鑒定準確度的影響。如圖3所示,在二者共同鑒定的交聯(lián)位點對中,32%(25/78)的交聯(lián)位點對在LysargiNase的酶切結果中獲得了比胰蛋白酶酶切結果更高的譜圖質量得分,初步顯示了鏡像酶正交酶切在提高交聯(lián)位點質譜鑒定準確度上的能力。
交聯(lián)肽段是由交聯(lián)劑共價連接的兩條肽段(α/β)組成的,與普通肽段相比,其長度更長,理化性質更加復雜,若無法產生足夠的碎片離子(b/y),則無法實現對交聯(lián)位點的準確鑒定。通過腳本處理搜庫結果文件,輸出碎片離子鑒定信息,并統(tǒng)計了α-肽段與β-肽段上b+/++及y+/++碎片離子的鑒定數目,如圖4所示,由LysargiNase酶切產生的交聯(lián)肽段主要以b+/++離子碎片為主,α-肽段的b+/++離子碎片數目的平均值高于β-肽段的y+/++離子,而y+/++離子在α-肽段與β-肽段的碎片數目基本相當;胰蛋白酶酶解的交聯(lián)肽段以y+/++離子為主,α-和β-肽段中y+/++和b+/++離子碎片數目相當。該結果從碎片離子的鑒定數目上初步顯示了兩種酶切方式產生的交聯(lián)肽段在質譜檢測響應行為上的互補性。
為了進一步考察兩種酶切方式鑒定到交聯(lián)肽段的譜圖質量,即交聯(lián)肽段與譜圖匹配的準確度,我們以胰蛋白酶酶解鑒定的交聯(lián)肽段的-lg(E-value)分值作為標準劃分了低、中、高3個打分區(qū)間,分別為[0, 4)、[4, 8)、[8, ∞)。如圖5所示,對于低打分區(qū)間(見圖5a), 與胰蛋白酶相比，LysargiNase酶解所得到的交聯(lián)肽段的譜圖質量得到了顯著提高,不僅b/y離子的匹配數目增加,其連續(xù)性也得到了提高;對于中、高打分區(qū)間內(見圖5b和5c), LysargiNase的譜圖質量提升效果同樣被證明。因此,LysargiNase較胰蛋白酶酶解,通過提高b+/++離子檢測效率,能夠有效增加不同長度交聯(lián)肽段在質譜檢測中碎片離子的鑒定數目和連續(xù)性,提高肽段序列的譜圖匹配質量,進而提升交聯(lián)肽段的質譜鑒定準確度。
圖 5 LysargiNase與胰蛋白酶酶解的交聯(lián)肽段質譜圖Fig. 5 Mass spectra of cross-linked peptides digested by LysargiNase and trypsin
圖 5 (續(xù))Fig. 5 (Continued)
2.2 復雜交聯(lián)樣品鏡像酶正交酶切產物的交聯(lián)質譜分析
2.2.1基于鏡像酶切的大腸桿菌蛋白復合物交聯(lián)位點鑒定覆蓋度
實驗進而以大腸桿菌裂解液為樣品,BS3為交聯(lián)試劑考察鏡像酶正交酶切策略對于復雜樣品中蛋白質復合物交聯(lián)信息的解析能力。如附圖1所示,采用鏡像酶正交酶切共鑒定到726對交聯(lián)位點,較單一胰蛋白酶酶切交聯(lián)位點數目提高了16%(102/624);此外,有172對交聯(lián)位點被LysargiNase與胰蛋白酶共同鑒定。具體的交聯(lián)位點信息見附表2?？傮w來看,LysargiNase酶解樣品交聯(lián)位點的鑒定總數明顯低于胰蛋白酶酶切樣品,可能的原因包括以下3個方面:(1)由于交聯(lián)反應主要發(fā)生于蛋白質表面,所產生的交聯(lián)肽段的豐度較低,在質譜檢測過程中存在隨機性,尤其對于復雜樣品表現得更為明顯[23]; (2)胰蛋白酶作為蛋白質組學研究中最常用的蛋白酶,可以高效、特異地切割賴氨酸和精氨酸的C端。盡管LysargiNase被證明具有較高的酶活性和酶切特異性,其酶活較胰蛋白酶相對較低[20],產生LysargiNase酶切的交聯(lián)肽段由于長度過長而難以被質譜檢測,尤其是在復雜樣品的應用中[20,24,25]; (3)由胰蛋白酶酶切的交聯(lián)肽段除N端外,由于酶切發(fā)生在K/R的C端,所以電荷在N端與C端都有分布,而LysargiNase的酶切位點在K/R的N端,電荷主要分布在N端,肽段整體的帶電性略低于胰蛋白酶酶切的肽段,導致LysargiNase酶切的肽段在質譜中離子化效率及碎裂效率相對低于胰蛋白酶酶切產生的肽段,最終降低了LysargiNase酶切的交聯(lián)肽段在質譜中的檢出率。因此,上述因素制約了LysargiNase酶切的交聯(lián)肽段的質譜鑒定能力,從而導致其鑒定的交聯(lián)位點數目少于胰蛋白酶。
2.2.2基于鏡像酶切的大腸桿菌蛋白復合物交聯(lián)位點鑒定準確度
對二者共同鑒定到的交聯(lián)位點的最大-lg(E-value)值進行統(tǒng)計,計算各交聯(lián)位點的-lg[E-value(LysargiNase)/E-value(trypsin)],用于評價LysargiNase酶切對于胰蛋白酶酶切交聯(lián)位點鑒定準確度的貢獻,結果顯示35%(48/137)的交聯(lián)位點獲得了更高的鑒定得分值(見附圖2)。通過考察α-肽段與β-肽段上b+/++及y+/++碎片離子的檢測覆蓋度,再次證實了該策略是基于交聯(lián)肽段碎片離子匹配及質譜碎裂行為上的鏡像互補實現了對譜圖質量的提高(見附圖3)。對于兩種酶切產生的交聯(lián)肽段的譜圖進行比較,進一步證明了LysargiNase無論在低、中、高打分區(qū)間([0, 4)、[4, 8)、[8, ∞)),均可以通過提高交聯(lián)肽段的碎片離子鑒定數目和連續(xù)性達到譜圖質量提升的效果(見附圖4),從而實現復雜蛋白體系中交聯(lián)肽段的高可信度質譜鑒定。
2.3 大腸桿菌蛋白質復合物交聯(lián)鑒定結果分析
綜合LysargiNase與胰蛋白酶兩種酶切方式所鑒定的大腸桿菌中交聯(lián)位點信息,我們共鑒定到29對蛋白質分子間的相互作用,對應119對交聯(lián)位點(見圖6a),以及242個蛋白質分子內的607對交聯(lián)位點信息。在已鑒定的29對蛋白質相互作用中,12對已被大腸桿菌整合蛋白質相互作用數據庫(http://www.bacteriome.org)所報道[26],此外,有10對相互作用與已報道的化學交聯(lián)蛋白互作數據相吻合[13],證實了本方法所獲得的分子間交聯(lián)信息的可靠性。另外,還有7組蛋白質間相互作用未見報道,有望為大腸桿菌中的蛋白質互作譜圖的全面繪制提供重要的數據參考。
圖 6 大腸桿菌樣品中LysargiNase與胰蛋白酶酶切鑒定蛋白質復合物信息互補性Fig. 6 Complementation of protein complex information identified by LysargiNase and trypsin digestion in Escherichia coli samplesa. complementary of protein-protein interactions; b. example of complementary of intra-cross-linked protein structure information.
蛋白質復合物在執(zhí)行其功能的過程中依賴蛋白質分子的結構調控蛋白質相互作用的動態(tài)組裝,交聯(lián)位點的高準確度和高覆蓋度鑒定對于揭示蛋白質復合物功能具有重要的作用。我們對獲得的大腸桿菌體系中242個蛋白質的607個分子內交聯(lián)位點信息進行分析。其中,由胰蛋白酶單獨鑒定到的分子內交聯(lián)位點數目為364個,由胰蛋白酶與LysargiNase共同鑒定到的分子內交聯(lián)位點數目為149個,由LysargiNase單獨鑒定到的為94個。對于共同鑒定到的蛋白質,其交聯(lián)位點鑒定數目較單一胰蛋白酶酶切,平均提高了34%(見附表3),表明鏡像酶正交酶切策略能顯著提高蛋白質結構交聯(lián)位點的鑒定覆蓋度。進一步,我們以丙酮酸激酶II(KPYK2)、谷氨酰胺結合周質蛋白(GLNH)、核糖導入結合蛋白(RBSB)為例,說明該方法在蛋白質復合物結構位點分析中的優(yōu)勢(見圖6b,具體交聯(lián)位點信息見附表4)。
丙酮酸激酶II蛋白在糖酵解的最后一步催化丙酮酸的形成,在生理條件下是不可逆的,對于糖酵解第二部分中代謝通量的控制至關重要。通過LysargiNase與胰蛋白酶聯(lián)用的鏡像酶正交酶切策略我們獲得了與KPYK2相關的8組交聯(lián)位點信息,將交聯(lián)位點信息映射到先前發(fā)布的KPYK2(PDB: 6K0K)結構上,兩個交聯(lián)位點之間的直線距離均在BS3的最大交聯(lián)距離限制之內(2.4 nm),滿足結構兼容性要求,證實了交聯(lián)數據的可靠性。其中,由胰蛋白酶酶解樣品單獨提供的交聯(lián)位點信息有1組,有3組交聯(lián)位點信息只被LysargiNase酶解的樣品鑒定到,有4組交聯(lián)位點信息被胰蛋白酶與LysargiNase共同鑒定,證明了該策略具有提高交聯(lián)位點信息準確度及覆蓋度的能力。
谷氨酰胺結合周質蛋白在谷氨酰胺轉運系統(tǒng)中發(fā)揮作用,對于谷氨酰胺通透酶活性是必不可少的,通過鏡像酶正交酶切策略,我們獲得了7組交聯(lián)位點數據,其中由胰蛋白酶酶解的交聯(lián)樣品單獨提供的交聯(lián)位點有1組,而由LysargiNase酶解的樣品單獨提供的有3組,兩種酶解樣品共同提供的位點信息有3組。將交聯(lián)信息映射到先前發(fā)布的GLNH的晶體結構上(PDB: 1GGG),有5組交聯(lián)位點信息能夠與該晶體結構匹配,且各交聯(lián)位點之間的直線距離均小于交聯(lián)劑最大交聯(lián)距離約束,證實了交聯(lián)結果具有高可靠性,未匹配的交聯(lián)信息有可能完善GLNH的結構分析。
核糖導入結合蛋白的交聯(lián)質譜分析結果也同樣證明了該方法對鑒定覆蓋度的提高。該蛋白質為ABC轉運蛋白復合物RbsABC的一部分,涉及核糖的結合與引入,同時也作為趨化性的主要化學感受器。通過鏡像酶正交酶切策略,我們總計獲得11組交聯(lián)位點數據,其中由胰蛋白酶酶解單獨提供的交聯(lián)位點有5組,由胰蛋白酶與LysargiNase共同提供的有3組,由LysargiNase單獨提供的有3組;并且得到的交聯(lián)位點在晶體結構(PDB: 2GX6)中的直線距離均符合交聯(lián)劑的距離約束,再次證實了該方法得到的交聯(lián)位點的可信性。
3 結論
本文提出了一種基于LysargiNase與胰蛋白酶鏡像酶正交酶切的化學交聯(lián)質譜技術。對牛血清白蛋白和大腸桿菌裂解液蛋白的分析結果表明,該方法從酶切的角度出發(fā),以鏡像互補的方式顯著增加了肽段特征碎片離子的鑒定數目和匹配連續(xù)性,提升了交聯(lián)肽段與譜圖匹配的準確度,提高了交聯(lián)位點鑒定準確度及覆蓋度,有望為實現規(guī)模化的蛋白質復合物精準解析提供新思路。
致謝 感謝中國科學院計算技術研究所pFind團隊毛鵬志同學在碎片離子統(tǒng)計工作中的幫助與指導。
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韓若楠, 趙麗麗, 安雨馨, 梁 振, 趙 群*, 張麗華, 張玉奎1,
(1. 大連理工大學, 張大煜學院, 遼寧 大連 116024; 2. 中國科學院大連化學物理研究所, 中國科學院分離分析化學重點實驗室, 遼寧 大連 116023; 3. 中國科學院大學, 北京 100049)
蛋白質作為生命活動的執(zhí)行者,通過自身結構的動態(tài)改變,以及與其他蛋白質相互作用組裝為蛋白質復合物,調控各種生物學過程。因此,如何實現蛋白質復合物的精準解析已成為當前生命科學的研究熱點。化學交聯(lián)結合質譜(CXMS)技術作為蛋白質復合物解析的新興技術,利用化學交聯(lián)劑將空間距離足夠接近的蛋白質分子內或分子間的氨基酸殘基以共價鍵連接起來,再利用液相色譜-質譜聯(lián)用對交聯(lián)肽段進行鑒定,實現蛋白質復合物的組成、界面和相互作用位點的解析。該技術具有分析通量高、靈敏度高、可提供蛋白質間相互作用的界面信息、普遍適用于不同種類和復雜程度的生物樣品等優(yōu)勢,已成為X射線晶體衍射[1,2]、低溫冷凍電鏡[3,4]、免疫共沉淀[5,6]等蛋白質復合物研究技術的重要補充。
化學交聯(lián)位點的鑒定覆蓋度和準確度決定著該技術對于蛋白質復合物結構的解析能力。目前,為了實現蛋白質復合物的高覆蓋度交聯(lián),研究人員發(fā)展了可用于共價交聯(lián)賴氨酸(K)的氨基、谷氨酸(E)/天冬氨酸(N)的羧基[7]、精氨酸(R)的胍基[8]以及半胱氨酸(C)的巰基[9]等多種活性基團的新型交聯(lián)劑。進而,為了提高低豐度交聯(lián)肽段的鑒定靈敏度,體積排阻色譜法[10]、強陽離子交換色譜法[11],及親和基團富集策略被提出用于交聯(lián)肽段的高選擇性富集,如可富集型化學可斷裂交聯(lián)劑——Leiker[12],與不具備富集功能的交聯(lián)劑相比,通過親和富集可以將交聯(lián)位點鑒定數目提高4倍以上。此外,為了提高質譜對交聯(lián)肽段的鑒定能力,解決由于交聯(lián)肽段長度過長以及多級交聯(lián)導致的鑒定困難的問題,Leitner等[10]通過對8種標準蛋白質及20S蛋白酶體的交聯(lián)實驗,初步證明多酶酶切方法能夠有效提高交聯(lián)位點的鑒定數目;Zhao等[13]提出了基于“smart cutter”多種酶聯(lián)用的原位順序酶解策略,將大腸桿菌中蛋白質復合物交聯(lián)位點的鑒定數目相對單一胰蛋白酶(trypsin)酶切提高了54%。在交聯(lián)數據分析方面,為提高交聯(lián)位點的解析精度和效率,一系列的CXMS數據解析軟件被開發(fā),包括xQuest[14]、MassMatrix[15]和pLink[16,17]等。其中pLink在充分利用全部碎片離子的基礎上提出了粗細兩步打分策略用來縮減候選肽段規(guī)模,使鑒定速度得到了提高[18]。
上述技術雖然在很大程度上推動了基于CXMS的蛋白質復合物的解析覆蓋度,但是交聯(lián)肽段在質譜中存在多處碎裂,碎片離子形式多樣,且存在交聯(lián)基團與肽段共價連接的特異離子,因此交聯(lián)肽段二級譜圖的碎片離子比常規(guī)肽段的譜圖在種類和數目上更為復雜[16],會造成交聯(lián)肽段鑒定譜圖中碎片離子的匹配數目較少和肽段序列匹配連續(xù)性較差,導致譜圖可信度較低,影響蛋白質復合物交聯(lián)位點的鑒定精準度。
胰蛋白酶鏡像酶(LysargiNase)的酶切位點與胰蛋白酶互為鏡像,可特異地切割賴氨酸和精氨酸的N端。由于LysargiNase的N端酶切特點,電荷主要分布在交聯(lián)肽段的N端,在碰撞誘導裂解(CID)和高能誘導裂解(HCD)模式下產生以b離子為主的碎片離子,與胰蛋白酶酶切肽段以y離子為主的碎片離子互為鏡像補充,為胰蛋白酶酶解肽段在質譜鑒定中b離子缺失嚴重的問題提供了很好的解決辦法[19]。由于具有較高的酶切特異性和酶活性,鏡像酶已經成功地應用于蛋白質C末端蛋白質組鑒定[20]、磷酸化蛋白質組研究[21]、甲基化蛋白質組鑒定等[22]方面,然而在CXMS中的應用仍未見報道。
為進一步提高對蛋白質復合物結構及相互作用位點的解析能力,本文發(fā)展了LysargiNase與胰蛋白酶聯(lián)合酶切的方法,基于鏡像酶正交切割的互補特性,通過產生賴氨酸及精氨酸鏡像分布的交聯(lián)肽段,以增加特征碎片離子數量和肽段匹配連續(xù)性,從而提升交聯(lián)肽段的譜圖鑒定質量,達到提高交聯(lián)位點的鑒定覆蓋度和準確度的目的。通過分別對牛血清白蛋白及大腸桿菌全蛋白樣品的交聯(lián)位點鑒定結果的考察,評價該策略對單一蛋白樣品和復雜細胞裂解液樣品蛋白質復合物表征的應用潛力。
1 實驗部分
1.1 儀器、試劑與材料
蛋白酶抑制劑(cocktail)、二硫蘇糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、牛血清白蛋白(BSA)均購于美國Sigma-Aldrich公司;二(磺基琥珀酰亞胺)辛二酸酯(BS3)購于美國Thermo Fisher公司;胰蛋白酶、胰蛋白酶鏡像酶購于中國華利世公司;BCA試劑盒購自中國碧云天公司;色譜純乙腈(ACN)購自德國Merck公司;所有實驗用水均經過美國Millipore公司購買的Milli-Q系統(tǒng)純化;其他試劑均為分析純。用于質譜分析的分離柱(15 cm, 150 μm i.d., 365 μm o.d.)中裝有購于德國Dr. Maisch公司的ReproSil-Pur C18-AQ顆粒(顆粒大小為1.9 μm;孔徑為12 nm)。熔融石英毛細管(150 μm i.d., 365 μm o.d.)購于中國Sino Sumtech公司;Venusil XBP C18硅膠填料(5 μm, 12 nm)購于中國博納艾杰爾公司;Empore disk C18固相萃取膜片購于美國3M公司;超聲破碎儀購自美國Cole-Parmer公司;真空濃縮儀、超微量分光光度計(Nanodrop one)、Easy-nano LC 1000系統(tǒng)、Q-Exactive質譜儀、Easy-nano LC 1200系統(tǒng)及Orbitrap Fusion Lumos質譜儀均購自美國Thermo Fisher公司。
1.2 實驗方案
1.2.1蛋白質樣品制備
稱取牛血清白蛋白粉末,以20 mmol/L 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES, pH 7.5)作為緩沖體系,配制0.1 mmol/L牛血清白蛋白溶液。
大腸桿菌細胞(種屬K12)在37 ℃下采用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,然后于4 ℃以4 000 g離心2 min,收集細胞沉淀。細胞沉淀采用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍后,懸浮于細胞裂解液(含20 mmol/L HEPES和1%(v/v)蛋白酶抑制劑)中,冰浴超聲破碎180 s(30%能量,10 s開,10 s關)。勻漿液于4 ℃以20 000 g離心40 min,收集上清,采用BCA試劑盒測定所得蛋白質含量。稀釋大腸桿菌蛋白裂解液至蛋白質含量為0.5 mg/mL。
1.2.2化學交聯(lián)樣品制備
以20 mmol/L HEPES(pH 7.5)為溶劑配制濃度為20 mmol/L 的BS3交聯(lián)劑母液;將交聯(lián)劑母液加入牛血清白蛋白的緩沖溶液及大腸桿菌蛋白裂解液中,使交聯(lián)劑的終濃度為1 mmol/L,在室溫條件下反應15 min;通過添加終濃度為50 mmol/L的淬滅溶液NH4HCO3進行交聯(lián)反應淬滅,并在室溫下孵育15 min;在冰浴條件下,將交聯(lián)樣品逐漸滴入8倍體積的預冷丙酮中,于-20 ℃靜置過夜;在4 ℃條件下,以16 000 g轉速離心,去除丙酮,然后將交聯(lián)蛋白用預冷丙酮清洗2次,去除上清液后,于室溫揮發(fā)掉殘余的丙酮;以8 mol/L尿素溶液復溶蛋白質沉淀;將牛血清白蛋白交聯(lián)樣品以5 mmol/LTCEP作為還原劑，于25 ℃下反應1 h進行變性和還原；將大腸桿菌樣品以5 mmol/LDTT作為還原劑，于25 ℃下反應1 h進行變性和還原，避免大腸桿菌蛋白在酸性條件下發(fā)生變性；添加終濃度為10 mmol/L的碘乙酰胺(IAA),在黑暗中,于室溫下反應30 min;以50 mmol/LNH4HCO3稀釋樣品至尿素濃度為0.8 mol/L后,將樣品均分為兩份,一份以蛋白樣品與蛋白酶的質量比呈50∶1的比例加入胰蛋白酶,于37 ℃酶解過夜,另一份加入終濃度為20 mmol/L的CaCl2,以蛋白樣品與蛋白酶的質量比呈20∶1的比例加入LysargiNase,并在37 ℃溫度下酶解過夜。
1.2.3液相色譜-質譜鑒定及數據搜索
上述所有樣品經過除鹽,使用0.1%甲酸(FA)溶液復溶,用超微量分光光度計測定肽段濃度,進行反相高效色譜分離和質譜分析。
牛血清白蛋白樣品采用Easy-nano LC 1000系統(tǒng)偶聯(lián)Q-Exactive質譜儀平臺進行質譜分析。流動相A: 2%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA);流動相B: 98%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脫程序:0～10 min, 2%B～7%B; 10～60 min, 7%B～23%B; 60～80 min, 23%B～40%B; 80～82 min, 40%B～80%B; 82～95 min, 80%B。Q-Exactive質譜儀采用數據依賴性模式,Full MS掃描在Orbitrap上實現,掃描范圍為m/z300～1 800,分辨率為70 000(m/z=200),自動增益控制(AGC)為3×106,最大注入時間(IT)為60 ms,母離子分離窗口為m/z2。MS/MS掃描的分辨率為17 500(m/z=200),碎裂模式為HCD,歸一化碰撞能量(NCE)為35%, MS2從m/z110開始采集,MS2的AGC為5×104, IT為60 ms,僅選擇電荷值為3～7且強度高于1 000的母離子進行碎裂,并將動態(tài)排除時間設置為20 s。每個樣品分析3遍。
大腸桿菌樣品采用EASY-nano LC 1200系統(tǒng)偶聯(lián)Orbitrap Fusion Lumos三合一質譜儀平臺進行質譜分析。流動相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液;流動相B: 80%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脫程序:0～28 min, 5%B～16%B; 28～58 min, 16%B～34%B; 58～77 min, 34%B～48%B; 77～78 min, 48%B～95%B; 78～85 min, 95%B。Orbitrap Fusion Lumos三合一質譜儀采用數據依賴性模式,Full MS掃描在Orbitrap上實現,掃描范圍為m/z350～1 500,分辨率為60 000(m/z=200), AGC為4×105, IT為50 ms,母離子分離窗口為m/z1.6。MS2掃描的分辨率為15 000(m/z=200),碎裂模式為HCD, NCE為30%, MS2從m/z110開始采集,MS2的AGC為5×104, IT為60 ms。僅選擇電荷值為3～7且強度高于2×104的母離子進行碎裂,并將動態(tài)排除時間設置為20 s。每個樣品分析3遍。
質譜數據文件(*.raw)采用pLink 2軟件(2.3.9)對交聯(lián)信息進行檢索和鑒定。使用從UniProt于2019年4月27日下載的牛血清白蛋白序列和大腸桿菌序列,搜索參數如下:酶切方式為胰蛋白酶(酶切位置:K/R的C端)、LysargiNase(酶切位置:K/R的N端);漏切位點個數為3;一級掃描容忍(precursor tolerance)2.00×10-5;二級掃描容忍(fragment tolerance)2.00×10-5;每條肽段的質量范圍為500～1 000 Da;肽段長度的范圍為5～100個氨基酸;固定修飾為半胱氨酸還原烷基化(carbamidomethyl [C]);可變修飾為甲硫氨酸氧化(oxidation [M])、蛋白質N端乙?；?acetyl [protein N-term]);肽段譜圖匹配錯誤發(fā)現率(FDR)≤5%。
圖 1 胰蛋白酶與LysargiNase酶解樣品的交聯(lián)位點在牛血清 白蛋白晶體結構(PDB: 3V03)的映射Fig. 1 Mapping of cross-linked sites obtained from trypsin and LysargiNase digestion on the bovine serum albumin crystal structure (PDB: 3V03)
圖 2 LysargiNase與胰蛋白酶酶解樣品的交聯(lián)位點對及單一交聯(lián)位點的互補性Fig. 2 Complementarity of LysargiNase and trypsin digested cross-linked site pairs and single cross-linked sites a. venn diagram of single cross-linked sites; b. venn diagram of the cross-linked site pairs; c. number of cross-linked site pairs of each single cross-linked site, digested with LysargiNase and trypsin.
2 結果與討論
2.1 標準蛋白質鏡像酶正交酶切產物的交聯(lián)質譜分析
2.1.1基于鏡像酶切的牛血清白蛋白交聯(lián)位點鑒定覆蓋度
以BS3作為交聯(lián)劑對牛血清白蛋白單一模型蛋白體系進行化學交聯(lián),并將交聯(lián)樣品分別采用胰蛋白酶及胰蛋白酶鏡像酶進行酶解,經過質譜鑒定及數據分析,共得到了291對非冗余的交聯(lián)位點信息(見附表1,詳見http://www.chrom-China.com)。將所鑒定的交聯(lián)位點信息與牛血清白蛋白的晶體結構(PDB: 3V03)進行映射,如圖1所示,兩種酶切方式鑒定到的交聯(lián)位點存在一定互補性,初步表明基于鏡像酶正交酶切的交聯(lián)質譜分析策略能提高牛血清白蛋白交聯(lián)位點的鑒定數目。
如圖2a所示,胰蛋白酶酶解鑒定到的交聯(lián)位點的38%(82/216)被LysargiNase共同鑒定;此外,有75對交聯(lián)位點被LysargiNase補充鑒定,占胰蛋白酶鑒定總數35%(75/216)。表明LysargiNase與胰蛋白酶酶解產生的交聯(lián)肽段具有優(yōu)異的互補性。
對兩種酶切方式鑒定到的交聯(lián)位點的互補性進行分析,統(tǒng)計交聯(lián)位點對中的單一交聯(lián)位點的鑒定情況,發(fā)現LysargiNase與胰蛋白酶對單一交聯(lián)位點的鑒定能力并沒有明顯差別,83%(49/59)的位點被二者共同鑒定到(見圖2b)。然而,單一交聯(lián)位點在不同酶切方式所產生的交聯(lián)位點對的鑒定能力不同(見圖2c)。上述結果提示,兩種酶切方式產生的交聯(lián)位點對的互補性很可能源于質譜鑒定過程中對于二維交聯(lián)肽段與線性常規(guī)肽段的不同信號響應。由于交聯(lián)肽段較長,其碎片離子響應相對較差,LysargiNase較胰蛋白酶酶切雖然產生肽段的長度相當,但是由于二者酶切原理不同,K/R分別處在交聯(lián)肽段的N端和C端,使得產生的交聯(lián)肽段的質譜碎裂能力與響應不同,因此LysargiNase與胰蛋白酶聯(lián)合正交酶切的方法,較胰蛋白酶酶解方法,能顯著提高交聯(lián)肽段的鑒定覆蓋度。
圖 3 LysargiNase與胰蛋白酶酶解樣品共同得到的 交聯(lián)位點鑒定打分比較Fig. 3 Comparison of cross-linking site identification scores obtained by both LysargiNase and trypsin digestions
圖 4 b+/++與y+/++離子碎片分別在α/β-肽段的碎片覆蓋度Fig. 4 Fragment coverages of b+/++ and y+/++ ions of α/β-peptides
2.1.2基于鏡像酶切的牛血清白蛋白交聯(lián)位點鑒定準確度
實驗對胰蛋白酶與LysargiNase兩種酶切方式共同鑒定到的交聯(lián)位點對應肽段的譜圖質量進行了考察,以-lg(E-value)值作為打分標準,分值越高對應的譜圖鑒定的準確度越高,反之準確度越低,根據共同鑒定的位點對應的-lg[E-value(LysargiNase)/E-value(trypsin)]考察鏡像酶正交酶切對質譜鑒定準確度的影響。如圖3所示,在二者共同鑒定的交聯(lián)位點對中,32%(25/78)的交聯(lián)位點對在LysargiNase的酶切結果中獲得了比胰蛋白酶酶切結果更高的譜圖質量得分,初步顯示了鏡像酶正交酶切在提高交聯(lián)位點質譜鑒定準確度上的能力。
交聯(lián)肽段是由交聯(lián)劑共價連接的兩條肽段(α/β)組成的,與普通肽段相比,其長度更長,理化性質更加復雜,若無法產生足夠的碎片離子(b/y),則無法實現對交聯(lián)位點的準確鑒定。通過腳本處理搜庫結果文件,輸出碎片離子鑒定信息,并統(tǒng)計了α-肽段與β-肽段上b+/++及y+/++碎片離子的鑒定數目,如圖4所示,由LysargiNase酶切產生的交聯(lián)肽段主要以b+/++離子碎片為主,α-肽段的b+/++離子碎片數目的平均值高于β-肽段的y+/++離子,而y+/++離子在α-肽段與β-肽段的碎片數目基本相當;胰蛋白酶酶解的交聯(lián)肽段以y+/++離子為主,α-和β-肽段中y+/++和b+/++離子碎片數目相當。該結果從碎片離子的鑒定數目上初步顯示了兩種酶切方式產生的交聯(lián)肽段在質譜檢測響應行為上的互補性。
為了進一步考察兩種酶切方式鑒定到交聯(lián)肽段的譜圖質量,即交聯(lián)肽段與譜圖匹配的準確度,我們以胰蛋白酶酶解鑒定的交聯(lián)肽段的-lg(E-value)分值作為標準劃分了低、中、高3個打分區(qū)間,分別為[0, 4)、[4, 8)、[8, ∞)。如圖5所示,對于低打分區(qū)間(見圖5a), 與胰蛋白酶相比，LysargiNase酶解所得到的交聯(lián)肽段的譜圖質量得到了顯著提高,不僅b/y離子的匹配數目增加,其連續(xù)性也得到了提高;對于中、高打分區(qū)間內(見圖5b和5c), LysargiNase的譜圖質量提升效果同樣被證明。因此,LysargiNase較胰蛋白酶酶解,通過提高b+/++離子檢測效率,能夠有效增加不同長度交聯(lián)肽段在質譜檢測中碎片離子的鑒定數目和連續(xù)性,提高肽段序列的譜圖匹配質量,進而提升交聯(lián)肽段的質譜鑒定準確度。
圖 5 LysargiNase與胰蛋白酶酶解的交聯(lián)肽段質譜圖Fig. 5 Mass spectra of cross-linked peptides digested by LysargiNase and trypsin
圖 5 (續(xù))Fig. 5 (Continued)
2.2 復雜交聯(lián)樣品鏡像酶正交酶切產物的交聯(lián)質譜分析
2.2.1基于鏡像酶切的大腸桿菌蛋白復合物交聯(lián)位點鑒定覆蓋度
實驗進而以大腸桿菌裂解液為樣品,BS3為交聯(lián)試劑考察鏡像酶正交酶切策略對于復雜樣品中蛋白質復合物交聯(lián)信息的解析能力。如附圖1所示,采用鏡像酶正交酶切共鑒定到726對交聯(lián)位點,較單一胰蛋白酶酶切交聯(lián)位點數目提高了16%(102/624);此外,有172對交聯(lián)位點被LysargiNase與胰蛋白酶共同鑒定。具體的交聯(lián)位點信息見附表2?？傮w來看,LysargiNase酶解樣品交聯(lián)位點的鑒定總數明顯低于胰蛋白酶酶切樣品,可能的原因包括以下3個方面:(1)由于交聯(lián)反應主要發(fā)生于蛋白質表面,所產生的交聯(lián)肽段的豐度較低,在質譜檢測過程中存在隨機性,尤其對于復雜樣品表現得更為明顯[23]; (2)胰蛋白酶作為蛋白質組學研究中最常用的蛋白酶,可以高效、特異地切割賴氨酸和精氨酸的C端。盡管LysargiNase被證明具有較高的酶活性和酶切特異性,其酶活較胰蛋白酶相對較低[20],產生LysargiNase酶切的交聯(lián)肽段由于長度過長而難以被質譜檢測,尤其是在復雜樣品的應用中[20,24,25]; (3)由胰蛋白酶酶切的交聯(lián)肽段除N端外,由于酶切發(fā)生在K/R的C端,所以電荷在N端與C端都有分布,而LysargiNase的酶切位點在K/R的N端,電荷主要分布在N端,肽段整體的帶電性略低于胰蛋白酶酶切的肽段,導致LysargiNase酶切的肽段在質譜中離子化效率及碎裂效率相對低于胰蛋白酶酶切產生的肽段,最終降低了LysargiNase酶切的交聯(lián)肽段在質譜中的檢出率。因此,上述因素制約了LysargiNase酶切的交聯(lián)肽段的質譜鑒定能力,從而導致其鑒定的交聯(lián)位點數目少于胰蛋白酶。
2.2.2基于鏡像酶切的大腸桿菌蛋白復合物交聯(lián)位點鑒定準確度
對二者共同鑒定到的交聯(lián)位點的最大-lg(E-value)值進行統(tǒng)計,計算各交聯(lián)位點的-lg[E-value(LysargiNase)/E-value(trypsin)],用于評價LysargiNase酶切對于胰蛋白酶酶切交聯(lián)位點鑒定準確度的貢獻,結果顯示35%(48/137)的交聯(lián)位點獲得了更高的鑒定得分值(見附圖2)。通過考察α-肽段與β-肽段上b+/++及y+/++碎片離子的檢測覆蓋度,再次證實了該策略是基于交聯(lián)肽段碎片離子匹配及質譜碎裂行為上的鏡像互補實現了對譜圖質量的提高(見附圖3)。對于兩種酶切產生的交聯(lián)肽段的譜圖進行比較,進一步證明了LysargiNase無論在低、中、高打分區(qū)間([0, 4)、[4, 8)、[8, ∞)),均可以通過提高交聯(lián)肽段的碎片離子鑒定數目和連續(xù)性達到譜圖質量提升的效果(見附圖4),從而實現復雜蛋白體系中交聯(lián)肽段的高可信度質譜鑒定。
2.3 大腸桿菌蛋白質復合物交聯(lián)鑒定結果分析
綜合LysargiNase與胰蛋白酶兩種酶切方式所鑒定的大腸桿菌中交聯(lián)位點信息,我們共鑒定到29對蛋白質分子間的相互作用,對應119對交聯(lián)位點(見圖6a),以及242個蛋白質分子內的607對交聯(lián)位點信息。在已鑒定的29對蛋白質相互作用中,12對已被大腸桿菌整合蛋白質相互作用數據庫(http://www.bacteriome.org)所報道[26],此外,有10對相互作用與已報道的化學交聯(lián)蛋白互作數據相吻合[13],證實了本方法所獲得的分子間交聯(lián)信息的可靠性。另外,還有7組蛋白質間相互作用未見報道,有望為大腸桿菌中的蛋白質互作譜圖的全面繪制提供重要的數據參考。
圖 6 大腸桿菌樣品中LysargiNase與胰蛋白酶酶切鑒定蛋白質復合物信息互補性Fig. 6 Complementation of protein complex information identified by LysargiNase and trypsin digestion in Escherichia coli samplesa. complementary of protein-protein interactions; b. example of complementary of intra-cross-linked protein structure information.
蛋白質復合物在執(zhí)行其功能的過程中依賴蛋白質分子的結構調控蛋白質相互作用的動態(tài)組裝,交聯(lián)位點的高準確度和高覆蓋度鑒定對于揭示蛋白質復合物功能具有重要的作用。我們對獲得的大腸桿菌體系中242個蛋白質的607個分子內交聯(lián)位點信息進行分析。其中,由胰蛋白酶單獨鑒定到的分子內交聯(lián)位點數目為364個,由胰蛋白酶與LysargiNase共同鑒定到的分子內交聯(lián)位點數目為149個,由LysargiNase單獨鑒定到的為94個。對于共同鑒定到的蛋白質,其交聯(lián)位點鑒定數目較單一胰蛋白酶酶切,平均提高了34%(見附表3),表明鏡像酶正交酶切策略能顯著提高蛋白質結構交聯(lián)位點的鑒定覆蓋度。進一步,我們以丙酮酸激酶II(KPYK2)、谷氨酰胺結合周質蛋白(GLNH)、核糖導入結合蛋白(RBSB)為例,說明該方法在蛋白質復合物結構位點分析中的優(yōu)勢(見圖6b,具體交聯(lián)位點信息見附表4)。
丙酮酸激酶II蛋白在糖酵解的最后一步催化丙酮酸的形成,在生理條件下是不可逆的,對于糖酵解第二部分中代謝通量的控制至關重要。通過LysargiNase與胰蛋白酶聯(lián)用的鏡像酶正交酶切策略我們獲得了與KPYK2相關的8組交聯(lián)位點信息,將交聯(lián)位點信息映射到先前發(fā)布的KPYK2(PDB: 6K0K)結構上,兩個交聯(lián)位點之間的直線距離均在BS3的最大交聯(lián)距離限制之內(2.4 nm),滿足結構兼容性要求,證實了交聯(lián)數據的可靠性。其中,由胰蛋白酶酶解樣品單獨提供的交聯(lián)位點信息有1組,有3組交聯(lián)位點信息只被LysargiNase酶解的樣品鑒定到,有4組交聯(lián)位點信息被胰蛋白酶與LysargiNase共同鑒定,證明了該策略具有提高交聯(lián)位點信息準確度及覆蓋度的能力。
谷氨酰胺結合周質蛋白在谷氨酰胺轉運系統(tǒng)中發(fā)揮作用,對于谷氨酰胺通透酶活性是必不可少的,通過鏡像酶正交酶切策略,我們獲得了7組交聯(lián)位點數據,其中由胰蛋白酶酶解的交聯(lián)樣品單獨提供的交聯(lián)位點有1組,而由LysargiNase酶解的樣品單獨提供的有3組,兩種酶解樣品共同提供的位點信息有3組。將交聯(lián)信息映射到先前發(fā)布的GLNH的晶體結構上(PDB: 1GGG),有5組交聯(lián)位點信息能夠與該晶體結構匹配,且各交聯(lián)位點之間的直線距離均小于交聯(lián)劑最大交聯(lián)距離約束,證實了交聯(lián)結果具有高可靠性,未匹配的交聯(lián)信息有可能完善GLNH的結構分析。
核糖導入結合蛋白的交聯(lián)質譜分析結果也同樣證明了該方法對鑒定覆蓋度的提高。該蛋白質為ABC轉運蛋白復合物RbsABC的一部分,涉及核糖的結合與引入,同時也作為趨化性的主要化學感受器。通過鏡像酶正交酶切策略,我們總計獲得11組交聯(lián)位點數據,其中由胰蛋白酶酶解單獨提供的交聯(lián)位點有5組,由胰蛋白酶與LysargiNase共同提供的有3組,由LysargiNase單獨提供的有3組;并且得到的交聯(lián)位點在晶體結構(PDB: 2GX6)中的直線距離均符合交聯(lián)劑的距離約束,再次證實了該方法得到的交聯(lián)位點的可信性。
3 結論
本文提出了一種基于LysargiNase與胰蛋白酶鏡像酶正交酶切的化學交聯(lián)質譜技術。對牛血清白蛋白和大腸桿菌裂解液蛋白的分析結果表明,該方法從酶切的角度出發(fā),以鏡像互補的方式顯著增加了肽段特征碎片離子的鑒定數目和匹配連續(xù)性,提升了交聯(lián)肽段與譜圖匹配的準確度,提高了交聯(lián)位點鑒定準確度及覆蓋度,有望為實現規(guī)模化的蛋白質復合物精準解析提供新思路。
致謝 感謝中國科學院計算技術研究所pFind團隊毛鵬志同學在碎片離子統(tǒng)計工作中的幫助與指導。
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