謝文博, 夏 璐, 李 浩, 李 文, 曹 宇, 黃 云, 雷福厚*

(1. 廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 林產(chǎn)化學(xué)與工程國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/協(xié)同創(chuàng)新中心, 廣西 南寧 530006; 2. 湖北民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院, 湖北 恩施 445000)

三七為五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. Chen的干燥根,發(fā)揮藥效的主要成分是三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd,約占三七總皂苷含量的80%[1]。三七總皂苷既可以單獨(dú)作為藥物治療疾病[2],又可以與其他藥物共同發(fā)揮藥效[3],具有較好的臨床應(yīng)用效果與藥學(xué)開(kāi)發(fā)價(jià)值[4]。但三七的化學(xué)成分多,結(jié)構(gòu)繁雜且相似,較難分離。目前從三七中分離純化皂苷類化合物需要經(jīng)過(guò)大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理,該過(guò)程繁瑣且需要消耗大量有機(jī)試劑。高效液相色譜(HPLC)因其具有分析速度快、應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于食品、藥品、環(huán)境污染物和生物樣品等的分離[5,6]。高效液相色譜技術(shù)的關(guān)鍵是固定相,開(kāi)發(fā)新型色譜固定相分離和純化天然產(chǎn)物中的活性成分一直都是科學(xué)工作者的研究熱點(diǎn)。因此,制備新型液相色譜固定相,用于三七總皂苷的高選擇性分離和純化具有重要意義。

松香可生物降解,綠色環(huán)保。本課題組制備的松香基高分子微球已應(yīng)用于喜樹(shù)堿[7,8]、紫杉醇[9]、多環(huán)芳烴[10]等的分離純化。松香基高分子微球具有孔徑豐富、孔結(jié)構(gòu)可控以及與藥物甾環(huán)結(jié)構(gòu)相似的優(yōu)勢(shì),但其粒徑均一性差、比表面積小、機(jī)械強(qiáng)度低,不能滿足色譜固定相的需求;而二氧化硅粒徑均一,球形度好,比表面積大,機(jī)械強(qiáng)度高但是沒(méi)有選擇性。因此,本研究在前期工作的基礎(chǔ)上將二氧化硅微球進(jìn)行烷基化,引入新的反應(yīng)位點(diǎn),通過(guò)巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將松香基交聯(lián)劑氫化松香丙烯酸羥乙酯(HRHA)鍵合到烷基化硅膠表面,得到改性松香鍵合硅膠高效液相色譜固定相(SiO2@HRHA)。通過(guò)熱重、傅里葉變換紅外光譜、比表面積及微孔物理吸附和有機(jī)元素分析等手段對(duì)色譜固定相進(jìn)行表征;將制備的固定相濕法裝柱,對(duì)色譜柱的類型、流通性及重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià),用Tanaka測(cè)試對(duì)比分析其立體選擇性及氫鍵容量。最后將該色譜柱直接用于三七總皂苷的分離,為從實(shí)際樣品中分離純化三七總皂苷提供一種新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Ultra CP-24裝柱機(jī)(超高壓恒壓泵,美國(guó)Scientific Systems公司); MAGNA-IR 550傅里葉變換紅外光譜分析儀(美國(guó)Nicolet公司); STA449F3熱重分析儀(德國(guó)Netzsch公司); ASAP2020比表面積及微孔物理吸附儀(美國(guó)Micromeritics公司); Vario EL cube有機(jī)元素分析儀(德國(guó)Elemantar公司); LC-15C型高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)。

氫化松香丙烯酸羥乙酯、丙烯海松酸(16-羥乙基-34-丙烯酸羥乙基)酯(AAE)(純度95%,廣西鼎弘樹(shù)脂有限公司);二氫松油醇(DTP)(分析純,成都金山化學(xué)試劑有限公司);硅膠(粒徑:5 μm,比表面積:370 m2/g,蘇州納微科技股份有限公司); 3-巰基丙基三甲氧基硅烷(MAPS)(純度95%),三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd(純度≥98%),偶氮二異丁腈(AIBN)(純度99%),均購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙腈(色譜純,美國(guó)Fisher Scientific公司);其他試劑均為分析純。

1.2 色譜固定相的制備

將5 g活化硅膠置于250 mL三口燒瓶中,加入50 mL無(wú)水甲苯、2 mL無(wú)水吡啶、5 mL硅烷偶聯(lián)劑MAPS,于80 ℃下磁力攪拌8 h[11],反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫,抽濾,收集固體,依次使用甲醇、丙酮和正己烷沖洗(每次200 mL,各洗2次),于60 ℃真空干燥12 h,制備出烷基化硅膠(SiO2-MAPS)。

將5 g烷基化硅膠、0.005 g偶氮二異丁腈、100 mL乙酸乙酯置于250 mL三口燒瓶?jī)?nèi),同時(shí)添加3 g HRHA,于70 ℃下磁力攪拌反應(yīng)8 h[12],反應(yīng)結(jié)束后,抽濾,收集固體,用無(wú)水乙醇洗滌(每次200 mL,洗滌4次),于80 ℃下真空干燥10 h,得到固定相SiO2@HRHA。合成路線如圖1所示。

圖 1 SiO2@HRHA的合成路線Fig. 1 Synthesis route of SiO2@HRHAHRHA: hydrogenated rosin hydroxyethyl acrylate; MAPS: (3-mercaptopropyl) trimethoxysilane; AIBN: azobisisobutyronitrile.

將AAE和DTP在色譜固定相合成過(guò)程中分別替代氫化松香丙烯酸羥乙酯,制備出SiO2@AAE和SiO2@DTP固定相。

1.3 裝柱

準(zhǔn)確稱量5.0 g固定相置于小燒杯內(nèi),加入58 mL甲醇(勻漿液)超聲，使固定相分散均勻,放置備用。將不銹鋼柱管(250 mm×4.6 mm)裝到裝柱機(jī)上,設(shè)置流速(24 mL/min)、裝柱壓力和時(shí)間(41 MPa, 20 min),將分散好的固定相倒入勻漿罐中,以甲醇為頂替液,進(jìn)行裝柱。

1.4 色譜條件

色譜柱為自制SiO2@HRHA柱(250 mm×4.6 mm);柱溫25 ℃;流動(dòng)相:A為乙腈,B為水,流速:1.0 mL/min。梯度洗脫程序:0～20 min, 18%A; 20～45 min, 18%A～46%A; 45～55 min, 46%A～55%A; 55～60 min, 55%A。進(jìn)樣量為20 μL;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。三七總皂苷在進(jìn)樣前需用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定相的表征

2.1.1 熱重分析

采用熱重分析儀對(duì)固定相進(jìn)行熱失重表征。從圖2a可以看出,SiO2@HRHA和SiO2@DTP在200 ℃以下質(zhì)量損失較少,說(shuō)明這兩種材料在200 ℃內(nèi)具有較好的熱穩(wěn)定性;從200 ℃時(shí)開(kāi)始分解到800 ℃時(shí)分解完全。而SiO2@AAE在200 ℃內(nèi)質(zhì)量損失較多,可能是由于含有的兩個(gè)酯基在此溫度范圍內(nèi)發(fā)生分解。SiO2@HRHA、SiO2@AAE和SiO2@DTP的鍵合量分別為8.55%、9.15%和6.40%。這3種固定相的熱失重變化與SiO2-MAPS相比有明顯差別,說(shuō)明HRHA、AAE及DTP均已成功鍵合到SiO2-MAPS表面。

圖 2 SiO2、SiO2-MAPS、SiO2@HRHA、SiO2@AAE 和SiO2@DTP的(a)熱重分析、(b)紅外光譜及(c)氮?dú)馕?脫附等溫線圖 Fig. 2 (a) Thermogravimetric analysis, (b) FT-IR spectra and (c) nitrogen adsorption-desorption isotherms graphs of SiO2, SiO2-MAPS, SiO2@HRHA, SiO2@AAE and SiO2@DTP AAE: acrylopimaric acid (16-hydroxyethyl-34-hydroxyethyl acrylate) ester; DTP: dihydroterpineol.

2.1.2 紅外光譜

分別對(duì)SiO2、SiO2-MAPS、SiO2@HRHA、SiO2@AAE和SiO2@DTP進(jìn)行傅立葉紅外光譜測(cè)試,結(jié)果如圖2b所示。3 502 cm-1處為-OH特征吸收峰,1 625 cm-1處是活化硅膠上結(jié)合水的伸縮振動(dòng)峰,在2 939 cm-1處為-CH2-和-CH3中C-H的伸縮振動(dòng)峰。在SiO2-MAPS譜圖中,3 502 cm-1處峰值強(qiáng)度降低和2 939 cm-1處特征峰的出現(xiàn)說(shuō)明硅烷偶聯(lián)劑已鍵合在硅膠表面;由于HRHA、AAE和DTP的引入使得SiO2@HRHA、SiO2@AAE和SiO2@DTP在2 939 cm-1處的峰值強(qiáng)度增強(qiáng),SiO2@HRHA和SiO2@AAE在1 722 cm-1處有C=O伸縮振動(dòng)峰的出現(xiàn);SiO2@AAE和SiO2@DTP在3 502 cm-1處的峰值由于AAE和DTP中-OH的存在而增大。結(jié)合熱重表征的結(jié)果,可以確定SiO2@HRHA、SiO2@AAE和SiO2@DTP已制備成功。

2.1.3 孔結(jié)構(gòu)表征

如圖2c所示,與SiO2相比,固定相的氮?dú)馕?脫附曲線仍屬于Ⅳ型等溫線,屬于介孔材料,沒(méi)有改變硅膠的孔結(jié)構(gòu)。由表1可知,與SiO2-MAPS相比,本研究制備的SiO2@HRHA、SiO2@AAE和SiO2@DTP比表面積、孔容和孔徑均有所下降,但SiO2@HRHA仍有較大的比表面積和孔徑可以滿足其作為色譜材料的要求。

2.1.4 元素分析

SiO2、SiO2-MAPS和3種固定相的元素分析結(jié)果如表2所示。與SiO2相比,SiO2-MAPS中硫元素的出現(xiàn),說(shuō)明MAPS已成功鍵合在硅膠表面;與SiO2-MAPS相比,SiO2@HRHA、SiO2@AAE和SiO2@DTP固定相上碳和氫含量的增加證明了單體已成功鍵合到烷基化硅膠表面。SiO2@HRHA、SiO2@AAE和SiO2@DTP的表面覆蓋度[13]分別為1.13、0. 86和1.16 μmol/m2。

表 1 SiO2、SiO2-MAPS、SiO2@HRHA、SiO2@AAE和 SiO2@DTP的比表面積、孔容和孔徑Table 1 Specific surface areas, pore volumes and pore sizes of SiO2, SiO2-MAPS, SiO2@HRHA, SiO2@AAE and SiO2@DTP

表 2 SiO2、SiO2-MAPS、SiO2@HRHA、SiO2@AAE和 SiO2@DTP的元素分析結(jié)果Table 2 Elemental analysis results of SiO2, SiO2-MAPS, SiO2@HRHA, SiO2@AAE and SiO2@DTP

2.2 色譜柱性能評(píng)價(jià)

2.2.1 流通性評(píng)價(jià)

以乙腈為流動(dòng)相,通過(guò)改變不同的流速來(lái)測(cè)試SiO2@HRHA、SiO2@AAE和SiO2@DTP柱的流通性能。結(jié)果如圖3所示,隨著流速的增加,柱壓逐漸升高;流動(dòng)相的流速與柱壓在3種色譜柱上表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,且相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999。表明3種色譜柱流通性能良好,具有較好的耐壓性能。

圖 3 SiO2@HRHA、SiO2@AAE和SiO2@DTP柱的 流速與柱壓關(guān)系曲線Fig. 3 Relationships between the flow rate and the column pressure of SiO2@HRHA, SiO2@AAE and SiO2@DTP columns

2.2.2 色譜柱的保留機(jī)制

以烷基苯為探針,在流速0.5 mL/min、波長(zhǎng)254 nm的條件下考察3種色譜柱的保留機(jī)制。如圖4所示,隨著流動(dòng)相中乙腈體積分?jǐn)?shù)的增加,烷基苯在色譜柱上的保留時(shí)間不斷下降,符合反相色譜的保留特征,說(shuō)明這3種色譜柱均具備反相色譜性能。從圖4d可知,烷基鏈的長(zhǎng)度與烷基苯在色譜柱上的保留因子logk有很好的相關(guān)性,R2均為0.999;而線性回歸曲線的斜率可以反映固定相與溶質(zhì)之間疏水作用的強(qiáng)度[14], SiO2@HRHA柱的線性擬合曲線的斜率值最大,表明SiO2@HRHA柱的疏水性優(yōu)于SiO2@AAE柱和SiO2@DTP柱。

圖 4 色譜柱反相色譜性能及疏水性能評(píng)價(jià)Fig. 4 Evaluation of reversed-phase chromatography performance and hydrophobic performance of columns

圖 5 SiO2@HRHA、SiO2@AAE及SiO2@DTP柱的Tanaka測(cè)試參數(shù)圖Fig. 5 Tanaka test parameter diagrams of SiO2@HRHA, SiO2@AAE and SiO2@DTP columns. kPB: hydrophobicity; αCH2: hydrophobic selectivity; αT/O: stereoselectivity; αC/P: hydrogen bond capacity; αB/P 7.60: ion exchange capacity of pH>7; αB/P 2.70: ion exchange capacity of pH<3.

2.2.3 重復(fù)性評(píng)價(jià)

重復(fù)性是評(píng)價(jià)色譜柱性能的一個(gè)重要指標(biāo)。以苯、萘、芴、蒽、苯并菲為探針,在流速為0.5 mL/min、波長(zhǎng)254 nm的條件下考察3種色譜柱的重復(fù)性。

將多環(huán)芳烴重復(fù)進(jìn)樣30次,依次選擇第1、5、10、15、20、30次數(shù)據(jù)計(jì)算。通過(guò)計(jì)算可知,在SiO2@HRHA、SiO2@AAE和SiO2@DTP柱上溶質(zhì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.32%～0.66%、0.20%～0.49%及0.46%～1.21%,表明3種色譜柱均有較好的重復(fù)性。

2.2.4Tanaka測(cè)試

色譜柱的Tanaka測(cè)試[15]是通過(guò)測(cè)試3種不同的混合物,根據(jù)其保留時(shí)間得到色譜柱的不同性能參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用的混合物1由尿嘧啶、丁基苯、戊基苯、o-三聯(lián)苯和苯并菲組成;混合物2由尿嘧啶、咖啡因和苯酚組成;混合物3由尿嘧啶、苯甲胺和苯酚組成,得出了疏水性、疏水選擇性、立體選擇性、氫鍵容量、pH>7和pH<3的離子交換容量。

如圖5所示,SiO2@HRHA柱和SiO2@AAE柱的立體選擇性αT/O值大于SiO2@DTP柱,說(shuō)明SiO2@HRHA柱和SiO2@AAE柱具有較好的立體選擇性,有利于平面和非平面化合物的分離[16],這可能與HRHA和AAE中的三元類菲環(huán)骨架有關(guān)。

圖 6 SiO2@HRHA、SiO2@AAE、SiO2@DTP和C18柱分離三七總皂苷Fig. 6 Separation of Panax notoginseng saponins by SiO2@HRHA, SiO2@AAE, SiO2@DTP and C18 columns For SiO2@HRHA, mobile phase: (A) acetonitrile-(B) water； gradient elution program: 0-20 min, 18%A; 20-45 min, 18%A-46%A; 45-55 min, 46%A-55%A; 55-60 min, 55%A； flow rate: 1.0 mL/min; temperature: 25 ℃; wavelength: 203 nm. For SiO2@AAE column, mobile phase: (A) acetonitrile-(B) water; gradient elution program: 0-20.00 min, 15%A; 20.00-27.23 min, 15%A-30%A; 27.23-60.00 min, 30%A; flow rate: 0.5 mL/min; temperature: 30 ℃; wavelength: 203 nm. For SiO2@DTP, mobile phase: (A) acetonitrile-(B) water (15∶85, v/v), isocratic elution; flow rate: 1.5 mL/min; temperature: 25 ℃; wavelength: 203 nm. For C18, mobile phase: (A) acetonitrile-(B) water; gradient elution program: 0-20 min, 20%A; 20-45 min, 20%A-46%A; 45-55 min, 46%A-55%A; 55-60 min, 55% A; flow rate: 1.5 mL/min; temperature: 25 ℃; wavelength: 203 nm.

SiO2@HRHA柱和SiO2@AAE柱的氫鍵容量αC/P值大于SiO2@DTP柱,可能是因?yàn)镾iO2@HRHA柱和SiO2@AAE柱在硅膠表面的鍵合量大于SiO2@DTP柱,含有較多的酯基和羥基,能夠與咖啡因形成氫鍵,增加溶質(zhì)的保留,對(duì)極性溶質(zhì)具有較好的分離選擇性[16,17]。

2.3 三七總皂苷的分離

圖6為4種色譜柱分別在各自最佳的色譜條件下分離三七總皂苷的色譜圖,從圖中可知,SiO2@HRHA柱和SiO2@AAE柱均有較好的分離效果,而SiO2@DTP柱分離效果不佳且出峰時(shí)間最長(zhǎng)。其中SiO2@HRHA柱對(duì)三七總皂苷的綜合分離效果最佳，分離度分別為3.33、3.54、20.17和9.72；并且對(duì)Rg1與Re的分離效果優(yōu)于C18柱。SiO2@HRHA柱對(duì)三七總皂苷的分離效果優(yōu)于SiO2@AAE和SiO2@DTP柱，這可能是由于SiO2@HRHA柱上松香基含有的三元類菲環(huán)骨架與多環(huán)化合物(三七總皂苷)具有結(jié)構(gòu)相似性，有利于三七總皂苷的分離。除此之外，SiO2@HRHA柱較好的立體選擇性和疏水性在三七總皂苷的分離過(guò)程中也發(fā)揮了一定作用。

3 結(jié)論

本文將氫化松香丙烯酸羥乙酯鍵合到烷基化硅膠表面,成功制備了SiO2@HRHA固定相。填充的SiO2@HRHA柱具有典型的反相色譜保留機(jī)制、較好的立體選擇性及氫鍵容量。結(jié)果表明,SiO2@HRHA柱對(duì)三七總皂苷具有較好的分離效果,說(shuō)明改性松香鍵合二氧化硅高效液相色譜柱具有潛在的應(yīng)用前景,為從實(shí)際樣品中分離純化三七總皂苷提供了新思路,為后續(xù)進(jìn)一步研究該色譜柱對(duì)天然產(chǎn)物的分離性能奠定了基礎(chǔ)。