黃斯晨, 趙宏朋, 胡永丹, 任達(dá)兵, 易倫朝

(昆明理工大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院, 云南 昆明 650500)

茶樹花與茶鮮葉同是茶樹(Camelliasinensis(L.) O. Kuntze)的生物產(chǎn)出。茶樹花一般于每年5月份開始花芽分化,開花時間因茶樹品種與種植地區(qū)而異,壽命一般為2天,結(jié)實率較低,具有“壽命短、花期長、結(jié)實少”的特點[1,2]。我國茶樹花資源十分豐富,全國茶區(qū)每年可產(chǎn)茶樹花300多萬噸[3]。茶樹花能夠被加工成多種產(chǎn)品,例如茶樹花酒[4]、茶樹花香皂[5]等,也可以經(jīng)干燥后直接沖泡飲用[6]。但長期以來,人們只是采摘茶樹的鮮嫩芽葉制茶,對于茶樹花,絕大部分任其自生自滅,甚至通過人為方法去除茶樹花,以達(dá)到茶葉高產(chǎn)的目的,這對茶樹花資源是一種極大浪費[1,7]。

近年來隨著研究的不斷深入,茶樹花的內(nèi)含物質(zhì)被不斷發(fā)現(xiàn)[8,9]。據(jù)研究報道,茶樹花含有與茶葉相似的化學(xué)成分,包括多酚、生物堿、酚酸、多糖和芳香化學(xué)成分等,對人體具有抗氧化、抗糖尿病、抗高血脂、抗高血糖、減肥等功效[10]。Chen等[11]將茶樹花中粗蛋白酶分離、提取和純化,并利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行了分析,首次發(fā)現(xiàn)茶樹花中含有對茶葉蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)水解能力的蛋白酶并能夠使茶湯當(dāng)中的氨基酸總量大大增加;徐人杰等[3]采用高效液相色譜法對茶樹花中可溶性糖、兒茶素和游離氨基酸的含量進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示,茶樹花中含有兒茶素和茶氨酸等成分,并且發(fā)現(xiàn)茶氨酸含量占總游離氨基酸的50%左右。然而,目前對于茶樹花中化學(xué)成分的分析主要集中在氨基酸、茶多酚等單一類型化學(xué)成分上,對于多類化學(xué)成分的同時分析仍鮮見報道。

超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry, UPLC-HRMS)是一種強(qiáng)大的分析工具,具有高通量、高選擇性和高靈敏度的特點,在多類化學(xué)成分的同時分析檢測方面得到了越來越廣泛的應(yīng)用[12-14]。然而,目前仍鮮見利用UPLC-HRMS對茶樹花中化學(xué)成分進(jìn)行分析的報道。此外,UPLC-HRMS數(shù)據(jù)非常復(fù)雜,含有大量的背景噪聲和干擾離子,給后續(xù)化學(xué)成分的定性分析帶來了許多困難[15]。為了有效去除干擾離子,提取目標(biāo)成分的質(zhì)譜特征,目前已有研究提出了多種質(zhì)譜過濾方法,包括質(zhì)量虧損過濾(mass defect filtering, MDF)[16]、氮規(guī)則過濾(nitrogen rule filtering, NRF)[15]、中性丟失過濾(neutral loss filtering, NLF)[17]和診斷碎片離子過濾(diagnostic fragment ion filtering, DFIF)[18]等。質(zhì)量虧損是一種元素或者化學(xué)成分的精確質(zhì)量與其最接近整數(shù)值之間的差值。質(zhì)量虧損過濾可以排除目標(biāo)質(zhì)量范圍外的化學(xué)成分,降低質(zhì)譜解析的復(fù)雜度[17]。氮規(guī)則是指不含氮或含偶數(shù)氮的有機(jī)物的相對分子質(zhì)量為偶數(shù),含奇數(shù)氮的有機(jī)物的相對分子質(zhì)量為奇數(shù),氮規(guī)則過濾可基于該規(guī)則對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行初步過濾[19]。中性丟失是指物質(zhì)在裂解過程中,失去的一些不帶電荷的基團(tuán)。診斷碎片離子是指可表征化學(xué)成分結(jié)構(gòu)特征的質(zhì)譜碎片離子,具有相同或相似骨架的化學(xué)成分在相同的碰撞電壓下會有相似的質(zhì)譜裂解,產(chǎn)生相似的質(zhì)譜碎片。中性丟失過濾和診斷碎片離子過濾可以快速識別具有相同或相似骨架結(jié)構(gòu)或具有相同官能團(tuán)的化學(xué)成分[18]。然而,單一過濾策略很難避免定性分析過程中的假陽性和假陰性。與單一過濾策略相比,整合過濾策略(integrated filtering strategy, IFS)融合了多種質(zhì)譜過濾方法,例如MDF、NRF以及DFIF相結(jié)合,在去除干擾離子和檢測目標(biāo)成分方面已被證實更有效[15,18]。本研究以茶樹花作為研究對象,結(jié)合UPLC-HRMS技術(shù)和IFS,全面分析茶樹花中化學(xué)成分的組成和含量,為茶樹花的綜合利用和開發(fā)提供有價值的信息。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

UltiMate 3000超高效液相色譜、Q Exactive臺式四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜(美國Thermo Scientific公司); TGL-16M高速離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司); SK5200GT超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀有限公司); Milli-Q A10超純水機(jī)(美國Millipore公司); AQ-180E磨粉機(jī)(慈溪市歐耐電器有限公司)。

甲醇、乙腈(質(zhì)譜級,德國Merck公司);甲酸(質(zhì)譜級,美國Honeywell公司);標(biāo)準(zhǔn)品共計78種,包括生物堿3種、氨基酸18種、兒茶素及其衍生物13種、酚酸及其衍生物13種、黃酮24種、其他類成分7種,純度均在97%及以上。

茶樹花樣品7份,均于2019年4月采自云南省德宏州盈江縣油松嶺。所有樣品經(jīng)冷凍干燥以及打粉,并過60目篩后放置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件 色譜柱:Waters ACQUITY UPLC?HSS C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:35 ℃;流動相:A為乙腈溶液,B為0.1% (v/v)甲酸溶液;流速0.2 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL。洗脫梯度:0～3 min, 95%B～93%B; 3～4 min, 93%B～90%B; 4～8 min, 90%B; 8～15 min, 90%B～60%B; 15～18 min, 60%B～50%B; 18～20 min, 50%B～95%B; 20～25 min, 95%B。

質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),采用正、負(fù)離子模式檢測;噴霧電壓:3 500 V(+), 4 000 V(-);霧化溫度:300 ℃;霧化氣(鞘氣)流速:30 L/min;輔助氣流速:10 L/min;傳輸毛細(xì)管溫度:320 ℃;掃描模式:全掃描(full scan),分辨率35 000;源內(nèi)誘導(dǎo)裂解電壓(in-source CID): 0 eV;數(shù)據(jù)依賴二級掃描(ddMS2),分辨率17 500;高能碰撞誘導(dǎo)電壓(HCD stepped): 25、35、45 eV。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品0.100 g,加入內(nèi)標(biāo)溶液(0.1 g/L葛根素和磺胺醋酰)各0.1 mL以及1 mL 70%(v/v)甲醇水溶液,渦旋混合均勻后進(jìn)行超聲波輔助提取(40 ℃, 15 min)。隨后將提取液進(jìn)行離心(10 000 r/min, 5 min)并取上清液于2 mL容量瓶中。之后分別取兩次0.5 mL 70%(v/v)甲醇水溶液再重復(fù)兩次上述提取步驟。最后用70%(v/v)甲醇水溶液定容并取1 mL樣品提取液過0.22 μm微孔濾膜于進(jìn)樣瓶中,保存至4 ℃冰箱備用。每個樣品做3次平行。

1.4 QC樣本制備

取7種茶樹花樣品提取液各50 μL于棕色瓶中,渦旋混合均勻后用0.22 μm微孔濾膜過濾到進(jìn)樣瓶中作為質(zhì)量控制樣本(quality control, QC),保存至4 ℃冰箱備用。QC樣本用于評價儀器穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)重復(fù)性。

1.5 定性定量分析

定性分析 采用Xcalibur 3.0軟件分析UPLC-HRMS數(shù)據(jù)中化學(xué)成分的保留時間、一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜。對于目標(biāo)類型化學(xué)成分,如綠原酸類成分(chlorogenic acid components, CGAs)和糖基化槲皮素類成分(glycosylated quercetin components, GQs)等,采用MZmine 2.38軟件對原始UPLC-HRMS數(shù)據(jù)進(jìn)行色譜峰構(gòu)建、峰平滑及解卷積等處理,提取獲得具有化學(xué)成分保留時間、質(zhì)荷比和峰面積等信息的質(zhì)譜峰列表。采用集合NRF、MDF和DFIF的IFS方法去除干擾質(zhì)譜,獲得目標(biāo)類型化學(xué)成分的質(zhì)譜特征。IFS能夠以目標(biāo)化學(xué)成分的診斷碎片離子、氮原子數(shù)量以及質(zhì)量窗口等作為篩選條件對所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾,大大提高篩選目標(biāo)類型化學(xué)成分的效率,降低質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析的難度。在此基礎(chǔ)上,對于有標(biāo)準(zhǔn)品的78種化學(xué)成分,通過與標(biāo)準(zhǔn)品的一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)及保留時間比對,從而實現(xiàn)定性。其他化學(xué)成分則通過數(shù)據(jù)庫匹配,包括Tea Metabolome Database (TMDB)和Tea Plant Information Archive (TPIA),并結(jié)合參考文獻(xiàn)中的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜信息實現(xiàn)定性。

定量分析 采用內(nèi)標(biāo)法對各組分進(jìn)行定量分析。內(nèi)標(biāo)物的選擇不僅要盡可能與待測物質(zhì)性質(zhì)相似,而且要避免與上百個待測物質(zhì)中的任意物質(zhì)共流出,且在定量分析中需兼顧多類物質(zhì)的含量區(qū)間。由于磺胺醋酰與葛根素的物理化學(xué)性質(zhì)與茶樹花中主要化學(xué)成分兒茶素類和黃酮類相似,并且在UPLC-HRMS分析中能夠得到質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度適中且基線分離的色譜峰,因此磺胺醋酰和葛根素分別作為正離子以及負(fù)離子模式下的內(nèi)標(biāo)物。UPLC-HRMS數(shù)據(jù)通過MZmine 2.38軟件進(jìn)行分析,提取出化學(xué)成分的峰面積、保留時間、準(zhǔn)分子離子質(zhì)量,最后通過式(1)和(2)分別計算相對校正因子以及化學(xué)成分的含量。

(1)

式中,As:混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積;Ar:混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積;Cs:混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度,g/L;Cr:混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度,g/L。

(2)

式中,Ak:供試樣品液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積;Ai:供試樣品液中化學(xué)成分的峰面積;ms:供試樣品液中內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量,μg;wi:樣品中待測化學(xué)成分的含量,μg/g;m:樣品的質(zhì)量,g;F:相對校正因子。

其余未用標(biāo)準(zhǔn)品定性的化學(xué)成分含量通過式(3)計算,所有的字母定義和式(2)一致:

(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)重復(fù)性檢驗

為保證數(shù)據(jù)質(zhì)量,采用QC樣本數(shù)據(jù)評價儀器的穩(wěn)定性和檢測數(shù)據(jù)重復(fù)性。選取低含量代表性成分鳥苷、木犀草苷和L-組氨酸,中等含量代表性成分D-色氨酸、沒食子酸和檸檬酸以及高含量代表性成分兒茶素、咖啡因和可可堿,以檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)評價數(shù)據(jù)重復(fù)性和儀器穩(wěn)定性。以上9種化學(xué)成分的RSD值均在2.1%～12.2%范圍內(nèi),表明數(shù)據(jù)重復(fù)性好、儀器穩(wěn)定性高。這9種化學(xué)成分分屬本研究中的6類化學(xué)成分并且響應(yīng)強(qiáng)度也各有不同。

2.2 IFS提取目標(biāo)類型化學(xué)成分的質(zhì)譜特征

茶樹花提取物總離子流圖如圖1所示。從圖1可以看出,茶樹花提取物中含有大量的化學(xué)成分。采用MZmine 2.38對原始UPLC-HRMS數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,得到了包含4 150個質(zhì)譜特征的峰列表,其中包含大量的干擾質(zhì)譜。為有效過濾干擾質(zhì)譜,提取目標(biāo)類型化學(xué)成分的質(zhì)譜特征,本研究采用IFS對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。以下,以CGAs和GQs質(zhì)譜特征提取為例,說明IFS提取目標(biāo)類型化學(xué)成分的全過程。

圖 1 質(zhì)量控制樣品的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatogram of quality control sample

2.2.1綠原酸類成分的質(zhì)譜特征提取

CGAs是奎寧酸(quinic acid, QA)和肉桂酸衍生物酯化形成的一類特殊的酯,最常見的肉桂酸衍生物有對香豆酸、苯丙酸和3,4,5-三羥基肉桂酸[15,18,20,21]。本研究以QA為母體結(jié)構(gòu),根據(jù)酯化反應(yīng)位置和數(shù)量的不同,可以將CGAs的結(jié)構(gòu)分為3種,分別是單取代綠原酸類成分(mono-substituted chlorogenic acid components, Mono-CGAs)、二取代綠原酸類成分(di-substituted chlorogenic acid components, Di-CGAs)以及三取代綠原酸類成分(tri-substituted chlorogenic acid components, Tri-CGAs)。基于取代類型的不同,本研究設(shè)定了3個不同的MDF窗口,如表1所示。因此從符合NRF條件的3 537個質(zhì)譜峰中篩選出751個可能的目標(biāo)成分,如圖2a所示。CGAs通常在酯鍵處產(chǎn)生斷裂,并失去肉桂?；鶜埢?因此產(chǎn)生了m/z為191.055 1的特征碎片離子[20]。由標(biāo)準(zhǔn)品鑒定出的CGAs,包括綠原酸、隱綠原酸和新綠原酸,都包含m/z為191.055 1的特征碎片離子([QA-H]-)。故將m/z為191.055 1作為CGAs的診斷碎片離子進(jìn)行進(jìn)一步篩選,得到了22個符合NRF條件的目標(biāo)成分(見圖2a)。結(jié)合MDF、NRF和DFIF,最終篩選出9個目標(biāo)CGAs成分。

表 1 綠原酸類成分質(zhì)量虧損窗口的設(shè)定Table 1 Setting of the mass defect window of chlorogenic acid components (CGAs)

圖 2 (a)綠原酸類成分和(b)糖基化槲皮素類成分的 整合過濾策略篩選結(jié)果Fig. 2 Results of integrated filtration strategy for (a) chlorogenic acid components (CGAs) and (b) glycosylated quercetin components (GQs) NRF: nitrogen rule filtering; MDF: mass defect filtering; DFIF: diagnostic fragment ion filtering.

2.2.2糖基化槲皮素類成分質(zhì)譜特征提取

據(jù)文獻(xiàn)[15,22]報道,糖基化類黃酮中涉及的糖可分為戊糖(如阿拉伯糖和木糖)、脫氧己糖(如鼠李糖)和己糖(如半乳糖和葡萄糖),并且糖基化類黃酮還可以由幾種酚酸進(jìn)行?；?例如對香豆酸(p-coumaric,p-Co)和沒食子酸(gallic acid, G)。根據(jù)以上信息,可以對GQs的MDF窗口進(jìn)行設(shè)置,如表2所示。共設(shè)置了9個不同的MDF窗口,從符合NRF條件的3 537個質(zhì)譜峰中篩選出661個可能的目標(biāo)成分,如圖2b所示。質(zhì)譜離子化過程中,GQs的酯鍵容易斷裂并失去糖基和/或?；?從而生成m/z為301.035 4的特征碎片離子[15]。金絲桃苷和蘆丁等成分,都包含m/z為301.033 5的特征碎片離子([quercetin-H]-),故將其作為GQs的診斷碎片離子進(jìn)行后續(xù)篩選,得到了符合NRF條件的個目標(biāo)成分(見圖2b)。結(jié)合MDF、NRF和DFIF,最終篩選出6個GQs目標(biāo)成分。

表 2 糖基化槲皮素類成分質(zhì)量虧損窗口的設(shè)定Table 2 Setting of the mass defect window of glycosylated quercetin components (GQs)

由上述結(jié)果可知,IFS能夠快速有效地去除干擾質(zhì)譜信息,從而獲得目標(biāo)類型化學(xué)成分的質(zhì)譜特征,該方法在很大程度上提高了化學(xué)成分鑒定的準(zhǔn)確性和效率[23]?，F(xiàn)階段,該方法被應(yīng)用于中藥研究[24,25]、茶葉研究[15]以及代謝組學(xué)研究[17]等方面,但在茶樹花方面的應(yīng)用鮮見報道。本研究證實,IFS對于提高茶樹花中化學(xué)成分鑒定的效率和覆蓋面是有效的。

2.3 茶樹花中化學(xué)成分的定性分析

本研究從茶樹花中共鑒定出137種化學(xué)成分,包括3種生物堿、38種黃酮、31種酚酸及其衍生物、37種兒茶素及其衍生物、18種氨基酸以及10種其他類成分,如表3所示。其中78種化學(xué)成分根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行準(zhǔn)確定性,分別為18種氨基酸、13種兒茶素及其衍生物、13種酚酸及其衍生物、24種黃酮、3種生物堿以及7種其他類成分。59種化學(xué)成分根據(jù)文獻(xiàn)以及數(shù)據(jù)庫定性(如TMDB和TPIA),分別為24種兒茶素及其衍生物、18種酚酸及其衍生物、14種黃酮以及3種其他類成分。

2.4 茶樹花中化學(xué)成分的定量分析

本研究采用內(nèi)標(biāo)法對茶樹花中的化學(xué)成分進(jìn)行定量分析,定量結(jié)果如表3所示。137種化學(xué)成分中,總含量最高的是氨基酸,約為黃酮類成分總含量的7倍。兒茶素及其衍生物的總含量略低于氨基酸為9 068.43 μg/g。本次實驗中共鑒定出38種黃酮類成分,約占所鑒定成分總量的28%。在38種黃酮當(dāng)中,單個成分含量最高的為蘆丁,含量為204.84 μg/g?？Х纫?4 089.96 μg/g)、L-纈氨酸(5 601.57 μg/g)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(4 360.60 μg/g)分別為生物堿、氨基酸和兒茶素及其衍生物中含量最高的成分,含量分別約為蘆丁含量的20倍、27倍以及21倍。兒茶素單體相較其他兒茶素及其衍生物的含量更高,總含量占兒茶素及其衍生物總含量的83.5%。除兒茶素單體以外,含量最高的單體成分是茶黃素-3,3′-雙沒食子酸酯,含量為551.96 μg/g。

3 結(jié)論

本研究采用UPLC-HRMS技術(shù)實現(xiàn)了茶樹花中多類化學(xué)成分的同時分析檢測。在此基礎(chǔ)上,利用IFS對目標(biāo)類型化學(xué)成分進(jìn)行快速靶向識別,提高了茶樹花中化學(xué)成分定性分析的效率和覆蓋面。本研究共鑒定出茶樹花中的化學(xué)成分137種,并利用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析,實現(xiàn)了茶樹花中化學(xué)成分組成和含量的全面分析。研究結(jié)果有利于研究者全面了解茶樹花中化學(xué)成分的富集情況,為茶樹花的深度開發(fā)和利用提供有價值的信息和數(shù)據(jù)參考。