莫禎妮，邱樹毅，曾祥勇*，戴怡鳳

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

醬香型白酒具有“醬香突出、酒體醇厚、空杯留香持久”等特點(diǎn)，在我國(guó)白酒行業(yè)中占主導(dǎo)地位，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。大曲是中國(guó)醬香型白酒發(fā)酵生產(chǎn)過程中的重要發(fā)酵劑和專用原料，環(huán)境中的各類微生物在適合的條件下，能在其表面和內(nèi)部形成有益的釀酒微生物群系，成為原料中大分子物質(zhì)水解和代謝的必要條件，其產(chǎn)物能直接或間接地構(gòu)成酒中不同香型的獨(dú)特風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)中國(guó)白酒的品質(zhì)至關(guān)重要[1]。

大曲中的微生物主要集中在酵母菌、霉菌、細(xì)菌，其中細(xì)菌在高溫大曲中占有90%以上，耐高溫細(xì)菌不僅能產(chǎn)生水解淀粉及蛋白質(zhì)的酶類，還能為白酒生成香味物質(zhì)提供重要前體物質(zhì)，是白酒釀造過程中重要的產(chǎn)香功能微生物[2]。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法是直接對(duì)微生物進(jìn)行分離和純化。該方法簡(jiǎn)單易行，已廣泛應(yīng)用于白酒中微生物的分離。任愛容等[3]采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)從醬香白酒大曲和環(huán)境中分離得到1 370株細(xì)菌，并歸屬于5個(gè)門、28個(gè)屬，其中大曲和環(huán)境分別有18個(gè)屬、24個(gè)屬，芽孢桿菌屬（Bacillus）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和微球菌屬（Micrococcus）為大曲中的核心可培養(yǎng)細(xì)菌。然而，由于自然環(huán)境中僅有1%～10%的微生物能夠被培養(yǎng)，導(dǎo)致無法全面準(zhǔn)確地揭示微生物的群落結(jié)構(gòu)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和高通量測(cè)序等一系列免培養(yǎng)技術(shù)相繼出現(xiàn)，該技術(shù)最大特點(diǎn)是無需培養(yǎng)，直接對(duì)樣品中所有種類的微生物的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）多樣性進(jìn)行研究，從而揭示微生物群落組成[4]。醬香型白酒大曲微生物群落組成及演替規(guī)律的研究技術(shù)主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、高通量測(cè)序技術(shù)等。譚映月等[5]利用PCR-DGGE技術(shù)從醬香型酒曲中共檢測(cè)出10個(gè)細(xì)菌屬，發(fā)現(xiàn)了白酒中不曾報(bào)道過的如丙酸桿菌屬（Propionibacterium）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）中的鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas yabuuchiae）等細(xì)菌類群，并檢測(cè)到了3株不可培養(yǎng)細(xì)菌。與PCR-DGGE技術(shù)相比，高通量測(cè)序技術(shù)不僅能檢測(cè)出豐度高的微生物群落，而且豐度極低的微生物群落也能檢測(cè)出，具有簡(jiǎn)單、通量高、準(zhǔn)確度高和速度快等優(yōu)點(diǎn)，能夠更好地研究復(fù)雜的白酒微生物群落結(jié)構(gòu)及微生物多樣性。沈毅等[6]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)醬香型郎酒大曲、酒醅和窖泥的細(xì)菌菌群進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示郎酒窖泥中細(xì)菌菌群豐富度和多樣性最高，而大曲中細(xì)菌菌群的多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酒醅；母應(yīng)春等[7]運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)分析不同地區(qū)酒曲中微生物的組成及多樣性在屬和門水平上的差異性，結(jié)果表明，不同地區(qū)的酒曲微生物群落構(gòu)成及多樣性存在明顯差異。

目前，僅有少數(shù)研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法揭示了曲皮、曲心之間的微生物種類及數(shù)量的差異[8]，關(guān)于醬香大曲不同部位的微生物組成差異的研究鮮見報(bào)道。本研究采用Illumina Hiseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)貴州地區(qū)醬香型白酒大曲的細(xì)菌群落進(jìn)行研究，分析醬香型白酒大曲不同部位的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，初步了解其菌群組成的差異性，以期更好地揭示醬香型白酒大曲微生物發(fā)酵機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

高溫大曲樣品：取自貴州省茅臺(tái)鎮(zhèn)某酒廠同批次大曲，在不同顏色的大曲曲塊表面厚度約為1 cm處分別取三塊平行樣，粉碎后充分混勻作為曲皮（QP）樣品；在曲塊中心，取三塊長(zhǎng)、寬、厚均為5 cm的正方體，粉碎后充分混勻作為曲心（QX）樣品。

1.1.2 試劑

Hiseq Rapid SBS Kit v2測(cè)序試劑盒：美國(guó)Illumina公司；膠回收試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司；DNA Marker：北京擎科生物科技有限公司；引物：由上海生物工程股份有限公司合成；Gengreen染料：上海賽百盛有限公司；TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit：美國(guó)Illumina公司；KOD-Plus-Neo酶：日本TOYOBO公司；QIA quick Gel Extraction Kit：德國(guó)QIAGEN公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ABIGeneAmpR9700型PCR儀：美國(guó)ABI公司；Qubit2.0熒光定量?jī)x：美國(guó)Thermo Fisher公司；Thermo Scientific X3R型冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；CP114電子分析天平：上海奧豪斯儀器有限公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像儀：上海培清科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大曲樣品基因組總DNA的提取

將粉碎好的大曲樣品使用DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取后，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

以提取的基因組總DNA為模板，使用帶有Barcode的特異引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）PCR擴(kuò)增16SrDNA V4區(qū)域基因序列。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）為：1×PCR buffer 5 μL，MgCl2（1.5 mmol/L）3 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）（0.4 μmol/L）5 μL，正向和反向引物（1.0 μmol/L）各1 μL，KOD-Plus-Neo酶1 μL，模板10 ng，雙蒸水（ddH2O）31 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性20 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用QIA quick Gel Extraction Kit進(jìn)行純化，PCR純化產(chǎn)物用Qubit 2.0熒光定量?jī)x進(jìn)行檢測(cè)定量。

1.3.3 Illumina Hiseq高通量測(cè)序

使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit建庫(kù)，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用Hiseq 2500平臺(tái)PE250模式進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Flash 8.0軟件進(jìn)行序列拼接，使用Trimmomatic進(jìn)行質(zhì)控，過濾得到高質(zhì)量目標(biāo)序列后，利用Usearch序列分析軟件分組成具有97%相似度的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），挑選出現(xiàn)頻率最高的序列作為每個(gè)OTUs的代表性序列，使用SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行物種信息分類，采用隨機(jī)抽樣的方式對(duì)OTU特征表進(jìn)行抽平處理后，再利用QIIME等軟件對(duì)樣本進(jìn)行Alpha多樣性分析，采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲樣品中細(xì)菌菌群OTU的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

OTU可以反映樣品物種的豐富程度[9]，利用Usearch序列分析軟件在97%相似度下對(duì)所有序列進(jìn)行OTU的劃分。經(jīng)分析，QP和QX樣品基于97%相似度的OTU數(shù)量分別為73和74，說明QP與QX樣品的細(xì)菌種類差異不大。在水平方向，曲線的寬度反映樣本中物種的豐度，曲線在橫軸上的范圍越大，物種的豐度越高；曲線的平滑程度反映樣本中物種的均勻度，曲線越平緩，物種分布越均勻[10]。由圖1可知，兩個(gè)樣品的Rank-Abundance曲線不是很平緩，物種分布并不是很均勻，相比QX樣品，QP樣品的Rank-Abundance曲線較為平緩。盡管QP和QX樣品只有1個(gè)OTU數(shù)的差異，但根據(jù)OTU統(tǒng)計(jì)結(jié)果，大曲不同部位的細(xì)菌豐度分布存在一定的差異，可能是因?yàn)榍悠放c外界環(huán)境能夠直接接觸，曲皮的水分及空氣含量要低于曲心，導(dǎo)致大曲不同部位的物種存在較大差異[11]。

圖1 醬香型白酒大曲曲皮和曲心樣品中細(xì)菌菌群的Rank-Abundance曲線Fig.1 Rank-abundance curves of bacterial community in Qupi and Quxin samples of high-temperature Daqu

2.2 大曲樣品中細(xì)菌菌群多樣性的分析結(jié)果

2.2.1 稀釋曲線

稀釋曲線可以用來比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用來說明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理[12]。經(jīng)過Illumina Hiseq高通量測(cè)序和序列質(zhì)量控制，QP和QX樣品中細(xì)菌菌群中所得有效序列分別為29 871條和34 636條，其平均堿基長(zhǎng)度分別為290 bp和288 bp。由圖2可知，測(cè)序深度＞10 000條時(shí)，稀釋曲線趨于平緩，說明本次測(cè)序結(jié)果能代表樣本的真實(shí)情況，能較好地反映該區(qū)域細(xì)菌菌群的種類和結(jié)構(gòu)。

圖2 醬香型白酒大曲曲皮和曲心樣品中細(xì)菌群落的稀釋曲線Fig.2 Dilution curve of bacterial community in Qupi and Quxin samples of high-temperature Daqu

2.2.2 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性是指一個(gè)特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性和群落的物種豐富度，常用辛普森（Simpson）指數(shù)、香農(nóng)（Shannon）指數(shù)、超1（Chao 1）指數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育多樣性（phylogenetic diversity，PD）指數(shù)等進(jìn)行評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)結(jié)果[13]。QP和QX樣品中細(xì)菌菌群的Alpha多樣性分析結(jié)果見表1。由表1可知，QP樣品的Shannon指數(shù)（2.34）高于QX樣品（2.20），QP樣品的Simpson指數(shù)（0.77）低于QX樣品（0.82），表明QP樣品中細(xì)菌群落多樣性高于QX樣品。QX樣品細(xì)菌群落Chao 1指數(shù)（76.50）、PD指數(shù)（6.65）均高于QP樣品（74.33、6.63），表明QX樣品中細(xì)菌群落物種的豐富度高于QP樣品。這一研究結(jié)果與李登勇等[14]研究發(fā)現(xiàn)的高溫大曲細(xì)菌群落分布規(guī)律不同，可能是因?yàn)槿訒r(shí)間的不同造成了差異性[15]。

表1 醬香型白酒大曲曲皮和曲心樣品中細(xì)菌菌群的Alpha多樣性分析結(jié)果Table 1 Alpha diversity analysis results of bacterial community in Qupi and Quxin samples of high-temperature Daqu

2.3 大曲樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

將每個(gè)OTU與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，選取置信度閾值，即相似度在97%以上的序列進(jìn)行物種分類，得到每個(gè)OTU的分類水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)大曲樣品中細(xì)菌菌群主要?dú)w屬于7個(gè)門、13個(gè)綱、19個(gè)目、29個(gè)科和55個(gè)屬。

2.3.1 基于門水平細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

由圖3可知，從QP、QX樣品中共檢測(cè)到7個(gè)細(xì)菌菌門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、埃普西隆桿菌門（Epsilonbacteraeota）、螺旋體門（Spirochaetes）、Kiritimatiellaeota。在QP樣品中，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門（平均相對(duì)豐度≥1.00%）為厚壁菌門（Firmicutes）（90.92%）、放線菌門（Actinobacteria）（6.92%）、變形菌門（Proteobacteria）（1.93%）。任愛容等[16]從茅臺(tái)鎮(zhèn)主釀區(qū)大曲樣本中檢測(cè)出21個(gè)門，其中Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、擬桿菌門（Bacteroidetes）為優(yōu)勢(shì)菌門；郭敏[17]對(duì)醬香大曲微生態(tài)多樣性研究也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果。張雙燕等[9，18-19]通過高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，清香型大曲、芝麻香型高溫大曲以及濃香型大曲的主要細(xì)菌種群為Firmicutes及Proteobacteria。在不同香型的白酒中均能發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌，說明Firmicutes和Proteobacteria是中國(guó)白酒大曲中的重要微生物。而在QX樣品中，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門只有Firmicutes（81.65%）、Actinobacteria（17.40%）。LI H等[20]研究發(fā)現(xiàn)，醬香大曲中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為Firmicutes和Actinobacteria。醬香大曲中耐高溫細(xì)菌的種類共通性和豐度差異性，造成差異性的原因可能與原料來源、母曲中微生物組成及制曲工藝等因素有關(guān)[21]。在QX樣品中Proteobacteria沒有成為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，原因在于曲心的制曲溫度高（達(dá)到65 ℃）和水分含量低，導(dǎo)致不耐熱的Proteobacteria無法存活；而在QP樣品中因跟外界環(huán)境直接接觸，水分和溫度的適宜促使Proteobacteria成為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門[22]。這一結(jié)果說明在曲塊的不同部位所含的細(xì)菌菌群盡管種類沒有差異，但其相對(duì)豐度有所差異。

圖3 基于門水平醬香型大曲曲皮和曲心中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig.3 Analysis results of bacterial community structure in Qupi and Quxin samples of high-temperature Daqu at the phylum level

2.3.2 基于屬水平細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

由圖4可知，在QP和QX樣品中均檢測(cè)到55個(gè)屬。QP和QX樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬（相對(duì)豐度≥1.00%）分別為8個(gè)、7個(gè)，共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有5個(gè)，分別為枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）（46.36%，19.87%）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（12.78%，32.41%）、芽孢鏈菌屬（Desmospora）（10.26%，13.55%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（14.79%，6.47%）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）（2.87%，13.37%），其中Virgibacillus、Bacillus、Desmospora、Lactobacillus都屬于芽孢桿菌綱，因此表明芽孢桿菌是高溫大曲中的主要微生物菌群，該結(jié)果與戴奕杰等[23-24]的研究結(jié)果一致。有研究表明，Virgibacillus對(duì)醬香型白酒風(fēng)味品質(zhì)的形成有重要貢獻(xiàn)[25]；Lactobacillus在釀造過程中產(chǎn)生的乳酸能為白酒形成風(fēng)味物質(zhì)合成提供前體，具有維護(hù)與保持釀酒微生態(tài)環(huán)境等作用[26]。屬于放線菌綱的Saccharopolyspora為醬香型白酒第1輪次酒醅堆積發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬[27]，對(duì)白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成有重要作用。在芝麻香型白酒中也發(fā)現(xiàn)了Saccharopolyspora為優(yōu)勢(shì)菌群[28]。有研究表明，Desmospora與克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）的基因序列相似度達(dá)到94.3%[29]，Kroppenstedtia主要與丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯等酯類、β-苯基乙醇、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚乙基愈創(chuàng)木酚的產(chǎn)量呈正相關(guān)，Kroppenstedtia在白酒釀造中發(fā)現(xiàn)的時(shí)間較短，目前對(duì)其功能特性了解有限[30]。

圖4 基于屬水平醬香型大曲曲皮和曲心中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig.4 Analysis results of bacterial community structure in Qupi and Quxin samples of high-temperature Daqu at the genus level

QP樣品中特有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為鏈霉菌屬（Streptomyces）（2.30%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）（1.30%）、片球菌屬（Pediococcus）（1.02%）。其中，Streptomyces可能來源于白酒釀造環(huán)境中的空氣，其作為一種需氧菌，具有酯化脂肪酶、分泌酯酶、堿性磷酸酶與水解磷酸鹽酶的能力，可能在醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)或風(fēng)味前體的形成中起重要作用[31]；Sphingomonas可以降解芳香類化合物和產(chǎn)生多糖類物質(zhì)，同時(shí)具有較強(qiáng)的產(chǎn)輔酶Q能力[32]。Pediococcus可以利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸不產(chǎn)氣，無法分解蛋白，但能夠促進(jìn)發(fā)酵食品產(chǎn)生特有的風(fēng)味物質(zhì)，因此在白酒發(fā)酵過程中起著重要的作用[33]。這些菌屬僅在QP中成為優(yōu)勢(shì)菌屬可能是因?yàn)樗鼈兪切柩蹙騋X樣品中沒有氧氣所以無法大量生存。

QX樣品中特有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為Scopulibacillus（3.71%）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）（1.66%）。其中，Scopulibacillus是兼性厭氧嗜熱菌，在芝麻香型白酒高溫大曲也有發(fā)現(xiàn)[34]，但目前對(duì)Scopulibacillus在白酒中的功能還尚未清楚。

大曲曲塊不同部位的微生物群落的差異會(huì)導(dǎo)致水分、酸度、溫度等理化指標(biāo)也不同。同樣，大曲不同部位的水分和酸度值也是導(dǎo)致微生物群落分布不同的環(huán)境因素[35]。因此，盡管在QP和QX中的細(xì)菌種類差別不大，但由于其含量不同，共同在后期發(fā)酵過程中相互作用，可以對(duì)后期合成的風(fēng)味物質(zhì)造成一定的影響。

3 結(jié)論

本研究采用Illumina HiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，分析比較了醬香型白酒大曲曲皮和曲心的細(xì)菌菌群多樣性及群落結(jié)構(gòu)的差異性。結(jié)果表明，曲皮樣品中的細(xì)菌群落多樣性高于曲心樣品，但其豐度低于曲心樣品。在曲皮和曲心樣品中共檢測(cè)到7個(gè)門、13個(gè)綱、19個(gè)目、29個(gè)科和55個(gè)屬，曲皮、曲心樣品中檢測(cè)到的細(xì)菌種類沒有差異，但同一細(xì)菌的相對(duì)豐度存在一定的差異性。曲皮樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria，曲心樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門沒有Proteobacteria。曲皮和曲心樣品共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為Virgibacillus、Bacillus、Desmospora、Lactobacillus、Saccharopolyspora，除Desmospora屬外，其他優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬在曲皮和曲心樣品中的含量差異較大。曲皮樣品的特有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為Streptomyces、Sphingomonas、Pediococcus；曲心樣品的特有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為Scopulibacillus、Staphylococcus。這些細(xì)菌在茅臺(tái)酒的風(fēng)味生產(chǎn)和發(fā)酵中均起著重要作用，有助于形成茅臺(tái)酒獨(dú)特的酒體組成和獨(dú)特的風(fēng)格。本研究在一定程度上豐富了對(duì)貴州地區(qū)高溫大曲微生物群落多樣性的認(rèn)識(shí)，證實(shí)了在大曲的不同部位，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是有差異的，對(duì)后續(xù)研究微生物對(duì)大曲的理化指標(biāo)及其風(fēng)味物質(zhì)的影響奠定了基礎(chǔ)。