韓慧玲，李 華，包振江，趙家齊，李 晴，袁曉霞，冀照君*

（內(nèi)蒙古民族大學 生命科學與食品學院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

內(nèi)蒙古通遼地區(qū)的牧民長期以來沿用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵方法制作具有民族特色的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，主要有奶豆腐、酸馬奶、酸性奶油（烏日莫）、奶皮子等，這些傳統(tǒng)乳制品工藝獨特、品種繁多、味道極美、營養(yǎng)豐富，并較好地保存了當?shù)刈匀画h(huán)境中的乳酸菌，曾經(jīng)是皇帝王室的貢品，至今還是蒙族地區(qū)最重要的主食，該地區(qū)獨特的氣候、環(huán)境和食品的特色加工方法使得傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌資源十分豐富[1-2]。有研究表明，新疆、青海、西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的優(yōu)勢菌群分別為瑞士乳桿菌（Lactobacillushelveticus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）[3]，內(nèi)蒙古西部地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的優(yōu)勢菌群為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、瑞士乳桿菌、植物乳桿菌和乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsplactis）[4-5]。這些乳酸菌對腸道內(nèi)病原菌生長和定殖有抑制作用，對維持腸道健康有著重要作用[6-7]，被公認為安全性（generally regarded as safe，GRAS）菌株[8]。因此，內(nèi)蒙古東部地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中豐富的乳酸菌資源尚待進一步開發(fā)利用。

近年來，隨著抗生素的廣泛使用，細菌耐藥性問題越來越嚴重，已由多重耐藥性發(fā)展為普遍耐藥性[9]。有研究表明，乳酸菌對萬古霉素、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星等藥物具有較強的耐藥性，且部分菌株具有多重耐藥性[10]，但乳酸菌對各種抗生素的耐藥性因樣品來源、生存環(huán)境等差異顯著[11-14]。因此，研究傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌的耐藥性具有重要的意義。

本研究以內(nèi)蒙古通遼地區(qū)自制的奶豆腐和酸性奶油（烏日莫）兩種傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品為材料，采用稀釋涂布法從中分離純化乳酸菌，借助保守序列16S rRNA鑒定乳酸菌種屬關(guān)系，并采用8種常見抗生素藥敏性實驗深入分析乳酸菌的耐藥率和多重耐藥性，為傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌安全性評價提供重要參考，為乳酸菌耐藥分子機制和優(yōu)良乳酸菌資源開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

奶豆腐（NDF）和烏日莫（WRM）兩種自制傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品均采集自內(nèi)蒙古通遼地區(qū)的牧民家庭。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS固體培養(yǎng)基[7]：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·H2O 0.25 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4。121 ℃滅菌20 min。MRS液體培養(yǎng)基中不添加瓊脂。

1.1.3 藥敏紙片及主要試劑

氯霉素（chloramphenicol，C）、萬古霉素（vancomycin，VA）、四環(huán)素（tetracycline，T）、鏈霉素（streptomycin，SM）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、利福平（rifampicin，RD）、萘啶酸（nalidixic acid，NA）、紅霉素（erythromycin，EM）抗生素藥敏試紙：杭州濱和微生物試劑有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市致遠化學試劑廠；瓊脂糖（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物：生工生物工程（上海）股份有限公司；磷酸氫二銨（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；硫酸錳（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；無水乙酸鈉（分析純）：天津市德恩化學試劑有限公司；酵母浸粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；2×Master Mix：北京擎科新業(yè)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3K-15型臺式高速離心機：德國Sigma公司；Mastercycler nexus PCR擴增儀：德國Eppendorf公司；DYY-6C電泳儀：北京六一電子儀器廠；ProteinSimple凝膠成像系統(tǒng)HP：美國ProteinSimple公司；DZF-6051型生化培養(yǎng)箱：寧波市東南儀器有限公司；BS-1E型振蕩培養(yǎng)箱：蘇州威爾實驗用品有限公司；LS-35HD型立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；V8型漩渦混合器：美國Essenscien公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌菌株的分離與純化

將奶豆腐樣品置于無菌研缽中搗碎后待用，準確稱取奶豆腐、烏日莫樣品10.0 g于90 mL無菌生理鹽水（含量為0.9%）中，充分振蕩5 min，使樣品與生理鹽水混合均勻[15]。采用10倍系列梯度稀釋法將樣品稀釋至10-3，取稀釋度為10-1、10-2、10-3的樣品分別涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，每個梯度做3次平行[16]，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h后，根據(jù)乳酸菌菌落特征，挑取單菌落并純化2次，將純化菌株保存于20%甘油中，-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 分子生物學鑒定

采用異硫氰酸胍（guanidine thiocyanate，GUTC）法提取乳酸菌的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）[17]。以其為模板，27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）為引物，對其16SrRNA基因序列進行PCR擴增。PCR擴增體系：2×Mix（含Loading）23.00 μL、引物27F和1492R各1.00 μL、DNA模板2.00 μL，以雙蒸水（ddH2O）補至50.00 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)30次；72 ℃再延伸10 min。取PCR擴增產(chǎn)物3.00 μL，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將單一條帶的樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序結(jié)果提交到美國國立生物技術(shù)信息中心（nationalcenterforbiotechnologyinformation，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment searchtool，BLAST）進行同源性比對，鑒定菌株的種屬關(guān)系。

1.3.3 抗生素耐藥性敏感試驗

首先將乳酸菌菌株活化，挑取單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，將菌液用無菌水調(diào)整至OD600nm值為1.0的菌懸液。然后將15 mL MRS固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，取200 μL菌懸液加入4 mL 0.6%瓊脂，45 ℃混勻，均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，于室溫放置15 min。最后在無菌條件下取出藥敏紙片，置于固體培養(yǎng)基上（每皿3個相同藥敏紙片），37 ℃培養(yǎng)48 h后，測量并記錄抑菌圈直徑。根據(jù)臨床實驗室標準化協(xié)會（clinical and laboratory standards institute，CLSI）（2018）和《抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準》第十七版信息增刊提供的紙片法標準，制定評價乳酸菌對抗生素的耐藥性標準，具體判定標準見表1。

表1 藥敏紙片種類、含藥量及判定標準Table 1 Types,drug contents and determination standards of drug sensitive paper

1.3.4 耐藥率的計算

菌株的耐藥率[18]計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離

采用稀釋涂布法從內(nèi)蒙古通遼地區(qū)自制的奶豆腐和烏日莫中共分離得到80株乳酸菌，部分典型菌株的菌落形態(tài)及革蘭氏染色鏡檢觀察結(jié)果見圖1。

圖1 部分分離菌株的菌落形態(tài)（a）及革蘭氏染色結(jié)果（b）Fig.1 Colony morphology (a) and Gram staining results (b) of some isolated strains

由圖1可知，乳酸菌菌落在MRS固體培養(yǎng)基上多呈圓形，凸起，微白色，濕潤，邊緣整齊；所有菌株鏡檢結(jié)果均呈革蘭氏陽性，細胞形態(tài)多樣。

2.2 乳酸菌的分子生物學鑒定

分離乳酸菌的分子生物學鑒定結(jié)果見表2。由表2可知，經(jīng)16S rRNA基因測序與鑒定，80株乳酸菌歸屬于13個種，分別為短乳桿菌（7株）、糞腸球菌（5株）、乳酸片球菌（2株）、乳酸乳球菌（12株）、瑞士乳桿菌（4株）、屎腸球菌（13株）、戊糖片球菌（5株）、副干酪乳桿菌（7株）、食二酸乳桿菌（4株）、奧塔基乳桿菌（5株）、耐久腸球菌（4株）、植物乳桿菌（6株）、開菲爾乳桿菌（6株），表明內(nèi)蒙古東部地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌生物多樣性較高。

表2 分離乳酸菌的分子生物學鑒定結(jié)果Table 2 Molecular biological identification results of isolated lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌耐藥性結(jié)果與分析

2.3.1 乳酸菌藥敏紙片結(jié)果

分離得到的80株乳酸菌對8種抗生素的耐藥性見表3。

由表3可知，利福平、鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、萬古霉素、奈啶酸、氯霉素抗性培養(yǎng)基上無抑菌圈（耐藥（R））的乳酸菌分別是36株、59株、13株、26株、49株、53株、80株、16株，這些乳酸菌對相應(yīng)抗生素表現(xiàn)出強耐藥性；抑菌圈直徑較大（敏感（S）型）的菌株數(shù)分別為39株、4株、59株、43株、11株、22株、0株、61株，這些菌株對相應(yīng)抗生素表現(xiàn)出強敏感性。另外，有7株乳酸菌（L.brevisIMUNJL0111、E.faecalisIMUNJL0096、E.faecalisIMUNJL0039、L.acidilacticiiIMUNJL0115、E.faeciumIMUNJL0213、E.faeciumIMUNJL0226、E.faeciumIMUNJL0229）對所有8種抗生素均無抑菌圈（強耐藥性）。由此可見，從內(nèi)蒙古通遼地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到的80株乳酸菌對8種抗生素的耐藥性差異顯著，部分菌株表現(xiàn)出強耐藥性，部分菌株表現(xiàn)出強敏感性，這可能與菌株自身的固有性耐藥以及外部環(huán)境的影響有關(guān)[19]。

表3 80株乳酸菌對8種抗生素的耐藥性結(jié)果Table 3 Drug resistance results of 80 strains of lactic acid bacteria to 8 antibiotics

續(xù)表

續(xù)表

2.3.2 乳酸菌對不同抗生素的耐藥率分析

13個乳酸菌菌種對8種抗生素的耐藥率見表4。

表4 乳酸菌對8種抗生素的耐藥率Table 4 Drug resistance rates of lactic acid bacteria to 8 antibiotics

由表4可知，80株乳酸菌對抗生素的耐藥率由高到低依次為萘啶酸（100%）、鏈霉素（95.00%）、環(huán)丙沙星（80.00%）、萬古霉素（72.50%）、利福平（51.25%）、四環(huán)素（45.00%）、紅霉素（26.25%）、氯霉素（23.75%）。13種乳酸菌對8種抗生素的耐藥率差異明顯。乳酸片球菌對萘啶酸、利福平、鏈霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、萬古霉素的耐藥率均為100%；戊糖片球菌對鏈霉素、環(huán)丙沙星、萬古霉素、萘啶酸的耐藥率均為100%；副干酪乳桿菌對鏈霉素、萬古霉素、萘啶酸的耐藥率均為100%。然而，植物乳桿菌對紅霉素、萬古霉素、氯霉素的耐藥率均為16.67%，耐藥率較低；奧塔基乳桿菌（對紅霉素、四環(huán)素、氯霉素的耐藥率為0）、耐久腸球菌（對紅霉素和萬古霉素的耐藥率為0）、戊糖片球菌和副干酪乳桿菌（對紅霉素耐藥率為0）對不同抗生素表現(xiàn)出高度的敏感性。

上述結(jié)果與新疆北部[16]、西藏[20-21]、內(nèi)蒙地區(qū)[22]發(fā)酵乳制品中分離出的乳酸菌耐藥性高度一致，均發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌、副干酪乳桿菌對鏈霉素耐藥，對四環(huán)素、紅霉素敏感，這表明傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的乳酸菌在遺傳分化過程中具備一定的固有耐藥能力，這與乳酸菌基因組上的大環(huán)內(nèi)酯-林肯酰胺類ML（ermA，ermB，msrA/B，lnuA）及四環(huán)素類（tetM，tetK）、氨基糖苷類（aac（6'）-aph（2″），aph（3'）-III，strA，strB）、β-內(nèi)酰胺類（blaZ）、氯霉素（cat）和萬古霉素（vanX）等耐藥基因有關(guān)[23-24]。然而，河南新鄉(xiāng)市售酸奶中分離出的乳酸菌對四環(huán)素（61.3%）的耐藥率更高，并檢測到乳酸菌具有四環(huán)素耐藥基因tetM[25]；廣州市售酸奶中的乳酸菌對環(huán)丙沙星和萬古霉素耐藥率只有54.17%～35.42%，對四環(huán)素、青霉素、氯霉素、紅霉素和利福平的耐藥率均較低或完全敏感[19]。因此，乳酸菌抗生素耐藥性可能與地理位置、樣品來源、污染程度等均有關(guān)，也可能與其耐藥基因沉默或表達不充分有關(guān)[26-27]，有待于更深入研究。

2.3.3 乳酸菌多重耐藥性分析

13個乳酸菌菌種的多重耐藥性分析結(jié)果見表5。

表5 乳酸菌的多重耐藥率Table 5 Multiple drug resistance rates of lactic acid bacteria

由表5可知，76株（95%）乳酸菌具有多重耐藥性，其中短乳桿菌、糞腸球菌、乳酸片球菌、瑞士乳桿菌、屎腸球菌、戊糖片球菌、副干酪乳桿菌、食二酸乳桿菌、奧塔基乳桿菌、開菲爾乳桿菌均表現(xiàn)為抗3種及以上抗生素，表明這10個種的乳酸菌具有較強的耐藥性，比前期研究結(jié)果中具有多重耐藥性的乳酸菌所占比例（90.3%和70.33%）更高[28-29]，可能是由于具有多重耐藥性的乳酸菌對自然環(huán)境的適應(yīng)能力更強[30]。此外，有11株（13.75%）乳酸菌（短乳桿菌1株、糞腸球菌2株、乳酸片球菌1株、乳酸乳球菌2株、瑞士乳桿菌1株、屎腸球菌3株、植物乳桿菌1株）具有8重抗生素耐藥性，表明該地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的乳酸菌資源多重耐藥性現(xiàn)象十分普遍。這可能與農(nóng)牧區(qū)飼養(yǎng)動物長期接觸抗菌藥物有關(guān)，致使傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中抗生素殘留量較高，耐藥型菌株大量繁殖，以及抗性基因或R質(zhì)粒[31-32]在菌株間橫向轉(zhuǎn)移使乳酸菌由單重耐藥演化為多重耐藥[33]。

3 結(jié)論

采用稀釋涂布法從內(nèi)蒙古通遼地區(qū)自制的奶豆腐和烏日莫中共分離純化出80株乳酸菌，經(jīng)16S rRNA序列分析，歸屬于13個種，分別為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、乳酸片球菌（Lactobacillus acidilacticii）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、瑞士乳桿菌（Lactobacillushelveticus）、屎腸球菌（Enterococcusfaecium）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、食二酸乳桿菌（Lactobacillus digitalis）、奧塔基乳桿菌（Lactobacillusottaki）、耐久腸球菌（Enterococcus durans）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、開菲爾乳桿菌（Lactobacillus kefir），說明內(nèi)蒙古通遼地區(qū)傳統(tǒng)自然發(fā)酵乳制品中具有非常高的生物多樣性。80株乳酸菌對萘啶酸的耐藥率為100%，對鏈霉素、環(huán)丙沙星、萬古霉素、紅霉素、氯霉素的耐藥率分別為95.00%、80.00%、72.50%、26.25%、23.75%。此外，76株（95%）乳酸菌具有多重耐藥性（≥3種抗生素培養(yǎng)基上判斷為耐藥或中敏），這表明內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的乳酸菌抗生素耐藥性問題非常突出。因此，抗生素的使用頻率和劑量將致使傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌耐藥性改變，今后應(yīng)加強對傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的耐藥監(jiān)測和溯源，制定嚴格的衛(wèi)生標準。